吳思蒙 王利剛 張雪燕 王太升 張繼紅?

1.北華大學醫(yī)學院,吉林 吉林 132000;2.中國昆侖工程有限公司吉林分公司,吉林 吉林 132010

2012年美國環(huán)保局(US EPA)和國際癌癥研究機構(gòu)將(trichloroethylene，TCE)列為1類致癌物[1]。盡管研究人員對TCE毒性做了大量研究，但TCE導致肝臟纖維化程度及發(fā)病機制尚不明確。本文研究了吸入三氯乙烯后小鼠肝臟產(chǎn)生不同程度纖維化，以及I型膠原(Collagen I)、α－平滑肌肌動蛋白(α－ SMA)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)在小鼠肝組織中的表達水平。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 TCE為分析純(美國Sigma公司);Collagen I、α－SMA、CTGF(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);顯微鏡(Olympus公司);SYD－B病理石蠟包埋機(沈陽譽德電子儀器有限公司);RM2245輪轉(zhuǎn)式切片機(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司);ZPJ－1展片機(天津天利航空機電有限公司);GZX－9070MBE干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);LEICA ASP300S全自動組織脫水機;CV5030多功能染色玻璃封片機。

1.2 實驗動物 選擇健康清潔級雄性小鼠45只(購于長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司)，體重16～18g，小鼠被飼養(yǎng)在干凈的動物房里，并保持12小時光照/黑暗的晝夜節(jié)律，飼養(yǎng)條件為溫度22～26℃，相對濕度45～65%。

1.3 動物染毒與分組 自由進食，適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為三組，包括清潔空氣對照組(5只)、低濃度三氯乙烯組1500mg(20只)、高濃度三氯乙烯組5500mg(20只)。采用靜式吸入染毒法，染毒時用膠帶將染毒柜密封，試驗時將染毒物質(zhì)迅速注入染毒柜內(nèi)有加熱功能的裝置中，打開風扇使柜內(nèi)空氣分布均勻。將小鼠暴露于不同濃度的三氯乙烯氣體中，每天染毒2小時，染毒結(jié)束后分別在實驗2個月、3個月時，各處死10只小白鼠并在無菌條件下取出肝臟。

1.4 觀察指標

1.4.1 組織病理觀察:HE染色，網(wǎng)狀纖維染色。

1.4.2 免疫組化檢測 采用Envision法(多聚體兩步法)免疫組化檢測肝臟組織中α－SMA、Collagen I、CTGF蛋白的表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，用image－pro plus軟件測得平均光密度值，用±s表示，組內(nèi)比較選用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05則表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肝組織病理學觀察結(jié)果

2.1.1 HE染色結(jié)果顯示 清潔空氣對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞大小正常，細胞核呈圓形，胞質(zhì)豐富，并以中央靜脈為圓心，肝細胞呈放射狀排列，肝索排列規(guī)則。相同濃度的染毒組兩個月時肝細胞結(jié)構(gòu)基本正常，肝細胞腫脹變性，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，小葉間纖維結(jié)締輕度增生;三個月時肝細胞變性加重，可見肝細胞壞死，小葉間可見成纖維樣細胞，匯管區(qū)和小葉間纖維結(jié)締組織增生，肝索排列紊亂，少量炎細胞浸潤。染毒時間相同，高濃度組比低濃度組肝細胞變性和纖維結(jié)締組織增生明顯。

2.1.2 Masson染色結(jié)果顯示 清潔空氣對照組肝組織無明顯膠原纖維增生。相同濃度的染毒組兩個月時有少量藍色膠原纖維增生，三個月時藍色膠原纖維增多。染毒時間相同時，高劑量組比低劑量組藍色膠原纖維增多明顯。

2.1.3 網(wǎng)狀纖維染色結(jié)果顯示 對照組網(wǎng)狀纖維呈絮網(wǎng)狀均勻分布于肝組織中，未見網(wǎng)狀纖維增粗、融合。各染毒組肝組織內(nèi)網(wǎng)狀纖維失去正常分布狀態(tài)，匯管區(qū)周圍網(wǎng)狀纖維均有不同程度增粗。

2.2 免疫組化染色結(jié)果

2.2.1 各組α－ SMA表達水平

染毒組α－SMA蛋白表達水平明顯高于對照組(P＜0.05);吸入TCE濃度相同時，染毒三個月α－SMA蛋白表達水平高于染毒兩個月 (P＜0.05);吸入TCE時間相同時，高濃度染毒組α－SMA蛋白表達水平高于低濃度染毒 (P＜0.05)，見表1。

表1 各組小鼠肝組織α-SMA蛋白的表達(±s n=10)

表1 各組小鼠肝組織α-SMA蛋白的表達(±s n=10)

注:與(A)比較?P＜0.05;與(B)比較＃P＜0.05;與(C)比較※P＜0.05;與(D)比較◎P＜0.05

組別α－SMA IOD值(積分光密度值)清潔空氣對照組(A) 0.022±0.010 2個月低濃度染毒組(B) 0.266±0.033?2個月高濃度染毒組(C) 0.475±0.056?＃3個月低濃度染毒組(D) 0.763±0.031?＃3個月高濃度染毒組(E) 0.918±0.333?※◎

2.2.2 各組Collagen I表達水平 染毒組Collagen I蛋白表達水平明顯高于對照組 (P＜0.05);吸入TCE濃度相同時，染毒三個月Collagen I蛋白表達水平高于染毒兩個月 (P＜0.05);吸入TCE時間相同時，高濃度染毒組Collagen I蛋白表達水平高于低濃度染毒 (P＜0.05)，見表2。

表2 各組肝組織Collagen I蛋白的表達(±s n=10)

表2 各組肝組織Collagen I蛋白的表達(±s n=10)

注:與(A)比較?P＜0.05;與(B)比較＃P＜0.05;與(C)比較※P＜0.05;與(D)比較◎P＜0.05

0.014±0.004 2個月低濃度染毒組(B) 0.030±0.005?2個月高濃度染毒組(C) 0.053±0.006?＃3個月低濃度染毒組(D) 0.090±0.008?＃3個月高濃度染毒組(E) 0.110±0.006?※◎組別Collagen IIOD值(積分光密度值)清潔空氣對照組(A)

2.2.3 各組CTGF表達水平 染毒組CTGF蛋白表達水平明顯高于對照組 (P＜0.05);吸入TCE濃度相同時，染毒三個月CTGF蛋白表達水平高于染毒兩個月(P＜0.05);吸入TCE時間相同時，高濃度染毒組CTGF蛋白表達水平高于低濃度染毒 (P＜0.05)，及表3。

表3 各組肝組織CTGF蛋白的表達(±s n=10)

表3 各組肝組織CTGF蛋白的表達(±s n=10)

注:與(A)比較?P＜0.05;與(B)比較＃P＜0.05;與(C)比較※P＜0.05;與(D)比較◎P＜0.05

0.017±0.004 2個月低濃度染毒組(B) 0.036±0.006?2個月高濃度染毒組(C) 0.058±0.005?＃3個月低濃度染毒組(D) 0.080±0.007?＃3個月高濃度染毒組(E) 0.108±0.007?※◎組別CTGFIOD值(積分光密度值)清潔空氣對照組(A)

3 討 論

TCE被列為I類致癌物，其職業(yè)暴露途徑主要為經(jīng)呼吸道和皮膚直接接觸，嚴重威脅職業(yè)性接觸TCE工人的健康。第一次由TCE引起病損的病例在1915年被報道，主要損傷部位在肝臟[3]，纖維化是其中之一。

HE染色常用來顯示組織或細胞一般形態(tài)的改變，也是觀察肝纖維化情況常用的染色方法之一;Masson和網(wǎng)狀纖維染色則是顯示纖維結(jié)締組織的重要染色方法，其能較為準確地判斷出組織纖維化的嚴重程度[4]。

α－SMA是活化的成纖維細胞的標志，參與合成Ⅰ型膠原、Ⅲ 型膠原、纖維連接蛋白等多種細胞外基質(zhì)成分，被認為是肝星狀細胞激活的標志性蛋白并與肝纖維化有高度的相關(guān)性。

Collagen I是誘導細胞外基質(zhì)的主要成分，其含量的高低在一定程度上反應了肝纖維化嚴重程度。抑制肝星狀細胞的增殖，減少Collagen I的產(chǎn)生可以減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化[5]。

CTGF在機體創(chuàng)傷修復及器官纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展中起到中心調(diào)節(jié)作用，是器官纖維化疾病緩慢進展的重要細胞因子，被認為是纖維化疾病的“總開關(guān)”。肝星狀細胞的激活及表型改變被認為是肝纖維化進展中細胞外基質(zhì)的主要來源，CTGF信使RNA水平顯著增加，CTGF可能是刺激肝星狀細胞活化增殖的關(guān)鍵因子之一。

本研究通過Masson和網(wǎng)狀纖維染色印證了肝纖維化的存在，吸入TCE可致小鼠肝纖維化，且隨著時間延長、劑量增加纖維化程度越重。TCE所導致肝纖維化時肝組織α－SMA、Collagen I表達明顯增強，CTGF信號傳導通路功能明顯增強，對肝纖維化發(fā)生發(fā)展起到了正反饋效果。作為慢性疾病的早期階段，早期纖維化階段被普遍認為具有可逆性，并非不可逆的“疤痕組織”。因此，阻斷早期肝纖維化進程可以成為治療慢性肝疾病新的切入點，使慢性肝病在早期階段就有治愈的可能性。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制CTGF表達能阻斷TGF－β1/Smads通路，進而阻斷肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。目前肝纖維化治療中已經(jīng)有CTGF靶向疫苗能夠抑制小鼠肝纖維化發(fā)展，未來CTGF可能成為抗肝纖維化治療的重要靶點。由于本次實驗持續(xù)時間較短，小鼠數(shù)量較少，可能導致實驗結(jié)果有些許偏差，接下來會對現(xiàn)有實驗進行優(yōu)化進而深入研究為臨床診治工作提供更精準的依據(jù)。