朱世強，王帥勇，王 娟，姚 云，虞凌雪，單同領(lǐng)，周艷君，童 武，鄭 浩 ，童光志 ，于 海 ,2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

蓋塔病毒（Getah virus, GETV）屬于披膜病毒科甲病毒屬。GETV分布的地理區(qū)域比較廣泛，從歐亞大陸一直延伸到大洋洲，涉及到的宿主較為廣泛。蓋塔病毒主要感染豬和馬，病毒感染懷孕母豬后，可導(dǎo)致懷孕母豬胎兒死亡和流產(chǎn)等繁殖障礙癥狀，蓋塔病毒已被證實是引起母豬繁殖障礙的病原因子之一[1]。近年來我國多個省份豬場出現(xiàn)蓋塔病毒疫情，并造成一定的經(jīng)濟損失。

1 蓋塔病毒概況

蓋塔病毒是一種由蚊蟲傳播的病毒，分類學(xué)上屬于披膜病毒科甲病毒屬。GETV于1955年在馬來西亞首次從庫蚊中分離出來[2]。隨后GETV先后在日本、澳大利亞、馬來西亞、中國、韓國和東北亞被報道，1964年我國海南省首次從蚊蟲中分離到GETV，隨后GETV在中國廣泛而迅速地傳播，病毒已從河北、海南、四川、甘肅等省和上海市的蚊子和牲畜中分離出來。目前，已有研究報道了GETV感染馬和豬的臨床癥狀，GETV感染馬匹后可引起短暫的發(fā)熱、皮疹和腿部水腫[3-4]；GETV感染豬只后可引起發(fā)熱、厭食癥、抑郁和腹瀉，并可導(dǎo)致胎兒死亡和生殖障礙[4-5]。有研究報道，在鳥類、牛、山羊等其他動物血清中也能檢測到GETV抗體[6-9]。日本科學(xué)家證明了感染GETV的豬能夠很快產(chǎn)生病毒血癥，因此豬群在自然界中被認為是GETV的主要放大宿主[10]。

2 蓋塔病毒病原學(xué)

2.1 GETV基因組結(jié)構(gòu) 甲病毒的基因組為單鏈RNA，基因組全長約11 400～11 800 nt，蓋塔病毒全基因組長度約為11～12 kb，其中在基因組的79～7482位點編碼病毒非結(jié)構(gòu)蛋白（nsP1、nsP2、nsP3、nsP4），基因組的7527～11 288位點編碼結(jié)構(gòu)蛋白（C、E3、E2、6K、E1）。

蓋塔病毒粒子呈球形，直徑約50～70 nm，有囊膜及纖突。蓋塔病毒基因組是典型的甲病毒屬基因組結(jié)構(gòu)，蓋塔病毒屬于單股正鏈RNA病毒。其基因組RNA 5'端具有甲基化的帽狀結(jié)構(gòu)，3'末端具有ploy(A)的尾巴結(jié)構(gòu)，編碼兩個均勻排列的開放閱讀框（open reading frames, ORFs）。5'端的ORF編碼4個非結(jié)構(gòu)蛋白（nsP1、nsP2、nsP3和nsP4），3'末端的ORF編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白，包括C蛋白、E3蛋白、E2蛋白、6K蛋白、E1蛋白[11]。

甲病毒含有一個二十面體的核衣殼，被包裹在一個緊密的包膜中，其糖蛋白成分存在于二十面體晶格中[12]。核衣殼是由病毒的單股正鏈RNA基因組與多個30 kDa的單一衣殼蛋白裝配而成，其二十面體具有對稱性和開孔結(jié)構(gòu)，使得衣殼內(nèi)的RNA很容易被RNase降解。同時，病毒的核衣殼在受感染細胞的細胞質(zhì)中組裝成不同的受體，其中衣殼蛋白分子組合與包裝信號結(jié)合，更多的衣殼蛋白被招募到結(jié)構(gòu)中，這一反應(yīng)可能與部分組裝殼層中已經(jīng)存在的蛋白橫向互作。衣殼蛋白的N端與病毒RNA之間也存在靜電作用。N端的結(jié)構(gòu)域與RNA的靜電結(jié)合可能是非特異性的，不需要特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，這個區(qū)域的電荷密度非常高，這可能是導(dǎo)致空殼無法組裝的原因，因為組裝可能需要中和這些電荷。相反，與其他衣殼蛋白的橫向相互作用可能是特異性的，并由蛋白保守的C端序列介導(dǎo)衣殼的組裝，具有一定的特異性。

2.2 GETV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白及其功能

2.2.1 衣殼蛋白（Cap） 甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白是從亞基因組26S mRNA翻譯而來的多聚蛋白。核衣殼蛋白屬于N端的多聚蛋白，具有絲氨酸蛋白酶活性，可以通過順式作用從新生多肽鏈中釋放自身。這種蛋白質(zhì)被認為是在酶的活性部位與化學(xué)鍵發(fā)生折疊并被裂解，因此蛋白質(zhì)水解非常迅速。當(dāng)26S mRNA被翻譯后，Cap蛋白隨即產(chǎn)生。最近的研究表明，一種終止衣殼蛋白C端下游2個殘基的結(jié)構(gòu)被正常裂解，從而產(chǎn)生的衣殼蛋白。另外，衣殼蛋白中有一些區(qū)域與RNA特異性結(jié)合，新合成的衣殼蛋白與大核糖體亞單位結(jié)合，這種結(jié)合反應(yīng)可能在衣殼蛋白進入細胞后被激活[14]。

2.2.2 E3蛋白 E2糖蛋白存在于包膜中，負責(zé)受體的附著。成熟的E2是由病毒成熟后期pE2前體蛋白的呋喃蛋白裂解形成，產(chǎn)生E3和E2。大多數(shù)甲病毒在病毒粒子中不保留E3。

2.2.3 E2蛋白 E2蛋白是一種長而薄的分子，在穗狀花序頂端有一個高度暴露的葉狀結(jié)構(gòu)，隨后是較窄的莖，莖繞著E1蛋白分子旋轉(zhuǎn)[15]。E2蛋白的前260個氨基酸構(gòu)成外域，約100個氨基酸形成莖區(qū)和30個氨基酸組成的跨膜螺旋。E2蛋白的羧基端結(jié)構(gòu)域由33個與NC核相互作用的氨基酸組成[16-17]。其葉狀結(jié)構(gòu)與E1糖蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅱ的遠端、E2的莖部與E1的Ⅰ、Ⅲ結(jié)構(gòu)域之間存在著接觸。受體附著位點位于E2殘基附近，與E2殘基相關(guān)的碳水化合物位于大而突出的葉狀表面[18]。

圖1 病毒粒子結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)蛋白[13]Fig.1 Virion structure and structural proteins[13]

2.2.4 6K蛋白 6K是一種小的多肽，盡管相對于其他結(jié)構(gòu)蛋白翻譯成等摩爾量的量，但仍以少量（730個拷貝）的形式被整合到病毒粒子中[19-20]。在低溫電子顯微鏡病毒粒子結(jié)構(gòu)中，6K的存在和位置尚未確定。病毒粒子中存在的6K蛋白被認為是甲病毒粒子的必要結(jié)構(gòu)成分[21]。在6K區(qū)域引入 的幾個變化，包括減少6K棕櫚?；耐蛔僛19,22]，或編碼該肽序列的缺失[23]，導(dǎo)致感染性病毒的產(chǎn)量大大降低。然而，分離出來的病毒顆粒完全不含6K，并且在結(jié)構(gòu)上與野生型顆粒難以區(qū)分。缺乏6K蛋白的SFV突變體的生長對受感染的宿主細胞有很強的依賴性，哺乳動物細胞在裝配過程中受到的影響要比昆蟲細胞大得多。在合成后不久，6K蛋白與pE2/E1異質(zhì)二聚體結(jié)合，然后被轉(zhuǎn)運到病毒在質(zhì)膜組裝的位點[19]。由于在pE2蛋白的C端存在一個信號序列，6K蛋白在ER膜上發(fā)生共翻譯易位，包括一個16-氨基酸腔域和兩個跨膜域，兩個跨膜域由一個短的（8個氨基酸）細胞質(zhì)環(huán)連接。

2.2.5 E1蛋白 甲病毒E1蛋白將病毒表面蛋白轉(zhuǎn)化為細胞膜上的離子滲透孔，負責(zé)病毒進入時病毒包膜與宿主內(nèi)體膜融合[24]。這些孔被認為對Na+、K+和Ca2+離子具有滲透性，并允許核內(nèi)體質(zhì)子流入細胞質(zhì)以交換K+離子。這種生理機制可能導(dǎo)致內(nèi)泌體附近的pH降低，從而導(dǎo)致病毒基因組的局部核心解體和翻譯。E1在內(nèi)胚體酸化過程中使融合能力增強。酸性環(huán)境導(dǎo)致病毒糖蛋白的重新排列，暴露了先前隱藏在E1中的融合肽。將E1融合肽插入宿主內(nèi)體膜被認為是一個協(xié)同的過程，產(chǎn)生由5～6個同源三聚體組成的環(huán)[25]。交聯(lián)研究表明，融合后的三聚體由E1-E1相互作用維持，這一結(jié)果與發(fā)現(xiàn)一致，即病毒包膜與細胞膜融合后E1-E2異質(zhì)二聚體解體，產(chǎn)生E2單體和E1同型三聚體[26]。通常隱藏在中性pH下的其他E1區(qū)域（融合肽除外）也暴露在融合活性構(gòu)象中[27]。位于位置3的組氨酸殘基在膜融合過程中調(diào)節(jié)E1的低pH依賴性重折疊[28]。融合環(huán)阻斷細胞融合（G91D）的突變，是由于膜融合后期的一個阻斷，涉及E1同三聚體缺乏有效的形成[29-30]。進入時暴露在低pH值環(huán)境中可能不是蚊子細胞感染過程中的一個強制性步驟。

3 甲病毒復(fù)制機制

目前，對于蓋塔病毒研究有限，已知的蓋塔病毒可以在節(jié)肢動物宿主和脊椎動物宿主中復(fù)制，在節(jié)肢動物中產(chǎn)生持續(xù)終生的感染，而在脊椎動物中導(dǎo)致急性感染，通常是短期感染。這種情況也反映在細胞培養(yǎng)中，甲病毒在蚊子細胞中產(chǎn)生持續(xù)感染，在這種情況下，細胞存活并繼續(xù)在低水平上產(chǎn)生病毒，但在脊椎動物細胞能夠產(chǎn)生細胞溶解性感染。由于該病毒不能抑制宿主大分子合成，且產(chǎn)生的病毒產(chǎn)物水平較低，因此在蚊子細胞中持續(xù)感染的研究一直較為困難。在感染甲病毒的脊椎動物細胞中，宿主大分子合成受到抑制，病毒產(chǎn)物大量產(chǎn)生，很容易被觀察到。甲病毒在蚊子細胞中的復(fù)制對達契霉素等抑制劑敏感[14]，在去核細胞中復(fù)制能力降低，這表明感染需要一個功能核[31]。在脊椎動物細胞中，即使有達契霉素等抑制劑存在，也可以獲得正常復(fù)制。雖然沒有證據(jù)表明在感染過程中需要細胞核，但脊椎動物細胞經(jīng)長時間的達契霉素等抑制劑處理后產(chǎn)生較低的病毒量，這表明病毒在這些細胞中復(fù)制也需要細胞核編碼功能。此外，研究發(fā)現(xiàn)許多病毒基因組的突變對不同細胞系的病毒復(fù)制有不同的影響，這表明病毒與宿主蛋白之間存在相互作用[14]。

甲病毒感染脊椎動物細胞的一個標(biāo)志是能夠在不影響病毒蛋白和核酸合成的情況下關(guān)閉宿主轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些功能的關(guān)閉導(dǎo)致宿主細胞IFN-α/β產(chǎn)生減少，先天免疫系統(tǒng)減弱。這些功能似乎部分地映射到舊世界病毒中的nsP2和新世界病毒中的CP[32]。宿主細胞翻譯起始因子eIF2α磷酸化可能介導(dǎo)宿主細胞相關(guān)蛋白質(zhì)合成的關(guān)閉，dsRNA病毒的宿主蛋白激酶翻譯sRNA，病毒次基因組RNA的翻譯不需要宿主eIF2α[33]。隨著宿主大分子合成的停止，細胞病變效應(yīng)的發(fā)展也隨之發(fā)生。脊椎動物細胞感染甲病毒通常會誘導(dǎo)凋亡通路[34]。這一途徑已被證明對受感染生物體神經(jīng)元發(fā)病機制的研究具有重要意義[35]。在一些甲病毒中，細胞的凋亡已經(jīng)被證明是膜融合的過程，該過程通過病毒包膜蛋白的表達完成，或通過nsP2和RNA復(fù)制的表達發(fā)生[36-37]。目前研究又發(fā)現(xiàn)了宿主細胞凋亡能夠促進病毒復(fù)制但不誘導(dǎo)細胞凋亡的突變體，通過轉(zhuǎn)染具有復(fù)制但增殖缺陷的病毒RNA，從而消除病毒粒子進入的過程，也能誘導(dǎo)細胞凋亡。因此，有多種機制被認為參與了甲病毒感染誘導(dǎo)細胞凋亡的過程，可能同時涉及宿主和病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡。甲病毒與凋亡的研究在近年來的研究中得到了廣泛綜述[37-38]。在感染過程中，甲病毒主要利用宿主生物膜結(jié)構(gòu)，其中內(nèi)溶酶體膜和溶酶體膜被重新排列成液泡結(jié)構(gòu)。這些被稱為細胞病變液泡，直徑12 μm，被認為是病毒復(fù)制復(fù)合體[39]。

圖2 病毒復(fù)制模式圖[40]Fig.2 Pattern of GETV replication[40]

4 小結(jié)

甲病毒在哺乳動物細胞中引起細胞溶解性感染，同時在蚊子細胞中引起非細胞病變的持續(xù)性感染。蚊媒對甲病毒的適應(yīng)是甲病毒流行株傳播的主要因素。雖然對受感染的哺乳動物細胞進行了甲病毒的廣泛研究，但甲病毒在蚊蟲細胞中的復(fù)制和組裝的形態(tài)學(xué)和結(jié)構(gòu)學(xué)仍然知之甚少。近年來，蓋塔病毒已經(jīng)成為危害畜牧業(yè)的一個潛在威脅，國內(nèi)于2018首次報道了湖南省某豬場暴發(fā)蓋塔病毒病疫情，經(jīng)濟損失嚴(yán)重，隨后在山東某豬廠也出現(xiàn)蓋塔病毒疫情，而國內(nèi)對于蓋塔病毒的研究相對較少[41]。同時相關(guān)宿主蛋白在病毒生命周期中的作用以及宿主與病毒蛋白作用還有待探究。因此對宿主因子在宿主抗病毒活動的進入、復(fù)制、組裝和調(diào)節(jié)方面的功能進行詳細解析，將會有助于更好地了解宿主與蓋塔病毒的相互作用。目前，對甲病毒E2蛋白的研究已經(jīng)相對成熟，加深了我們對病毒粒子結(jié)構(gòu)的理解，而對剩余非結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)的闡明可能會對其活性和相互作用產(chǎn)生新的思路。甲病毒作為一種病毒載體在分子生物學(xué)和治療學(xué)中的應(yīng)用也在不斷發(fā)展。含有熒光蛋白與單個非結(jié)構(gòu)蛋白融合的病毒結(jié)構(gòu)已經(jīng)產(chǎn)生，這可能有助于進一步探索非結(jié)構(gòu)蛋白和復(fù)制復(fù)合物的功能和定位。甲病毒已經(jīng)被證明在哺乳動物系統(tǒng)中表達異種蛋白方面是有用的，而甲病毒復(fù)制子將繼續(xù)為疫苗和基因治療提供載體。此外，以甲病毒成熟的研究背景為基礎(chǔ)，也將有利于闡明蓋塔病毒的侵襲機制。