劉一楠,陳奕熹,汪 剛,毛軍福,彭貴青
(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,武漢 430070)
貓冠狀病毒(Feline coronavirus, FCoV)是家貓和野貓?bào)w內(nèi)普遍存在的病原體,分為通常只會(huì)引起貓輕微腹瀉的腸道冠狀病毒(Feline enteric coronavirus, FECV)[1]和致死性的貓傳染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus, FIPV)[2]。
FCoV屬于冠狀病毒科,與犬冠狀病毒(Canine coronavirus, CCoV)以及豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TEGV)同屬于冠狀病毒亞科α冠狀病毒屬,是有包膜的單股正鏈RNA病毒,其基因組約30 kb,有11個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF),分別含有四種結(jié)構(gòu)蛋白:刺突蛋白(spike protein, S)、包膜蛋白(envelope protein, E)、膜蛋白(membrane protein,M)和核衣殼蛋白(nucleoprotein, N),以及七種非結(jié)構(gòu)蛋白:輔助蛋白3a、3b、3c、7a和7b,復(fù)制酶1a和1ab[3-4]。FCoV有Ⅰ、Ⅱ型兩種血清型,根據(jù)其致病性可分為FECV和FIPV,其中Ⅰ型FCoV難以在體外培養(yǎng),Ⅱ型FCoV較易于在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。
Ⅰ型FIPV是患病貓中最常見(jiàn)的血清型[5],但就目前分離到的少數(shù)毒株而言,大部分為Ⅱ型。Ⅰ型FIPV的分離和培養(yǎng)困難給該疾病的研究帶來(lái)了阻礙。盡管對(duì)貓傳染性腹膜炎發(fā)病機(jī)制、傳播規(guī)律和防治進(jìn)行了數(shù)十年的研究,但是FIP仍然是目前最常見(jiàn)的致命性的貓科疾病之一??焖俣珳?zhǔn)的診斷對(duì)本病的預(yù)防和治療具有重要科學(xué)意義。
本文羅列了目前常見(jiàn)的幾種診斷方法,以期為今后的研究以及臨床診斷提供思路。
貓傳染性腹膜炎(feline infectious peritonitis,FIP)最常發(fā)生于兩歲以下的幼貓[6]。臨床癥狀為食欲不振,嗜睡,體重減輕,發(fā)熱,眼葡萄膜炎和神經(jīng)癥狀等[7]。FIP分為滲出型和非滲出型兩種,由于滲出型FIP可以檢測(cè)的指標(biāo)相對(duì)較多,有助于診斷[8]。但是FIP所具有的癥狀并非是該疾病的特異性癥狀,不能僅根據(jù)病史以及臨床癥狀確診,需將這些參數(shù)以及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果相結(jié)合進(jìn)一步做出診斷。
2.1 臨床診斷方法
2.1.1 臨床癥狀檢查 滲出型FIP,又稱濕性腹膜炎,患病貓腹部膨大,觸診有明顯的水樣波動(dòng);腹水呈粘性,稻草色,透明至中度渾濁[9]。大部分(69%)貓腹腔積液會(huì)伴有胸腔炎性滲出[10];嗜睡,厭食,呼吸困難,黃疸,眼葡萄膜炎,少數(shù)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。非滲出型FIP:又稱為干性腹膜炎,表現(xiàn)為胸腹腔無(wú)滲出液,干性腹膜炎的臨床癥狀無(wú)特異性[6],一般包括體溫升高、體重減輕、反應(yīng)遲鈍、食欲降低等,部分患病貓出現(xiàn)黃疸、眼內(nèi)有損傷等,診斷較為復(fù)雜。FIP引起的臨床癥狀沒(méi)有特異性,手術(shù)后繼發(fā)或器官損傷等均可引起胸腹水的產(chǎn)生,而嗜睡,呼吸困難,體溫升高,體重減輕等癥狀也多發(fā)于其他疾病,如貓呼吸系統(tǒng)疾病。因此只根據(jù)FIP的臨床癥狀難以確診。
2.1.2 血常規(guī)檢查與生化檢測(cè) 貓感染FIP后常見(jiàn)淋巴細(xì)胞減少、輕度至中度再生性貧血和由高球蛋白引起的高蛋白血癥[11]。當(dāng)患貓出現(xiàn)高蛋白血癥且血液中血清淀粉樣蛋白數(shù)值升高,白細(xì)胞數(shù)上升時(shí),提示體內(nèi)有明顯炎癥。但是引起炎癥的原因和種類(lèi)較多,僅根據(jù)血常規(guī)和生化檢測(cè)也難以診斷貓是否患有傳染性腹膜炎。以下是研究總結(jié)的數(shù)值可以進(jìn)行輔助診斷。
有研究發(fā)現(xiàn)白蛋白與球蛋白的比值(Albumin:Globulin, A:G)可用于輔助診斷FIP,即當(dāng)這個(gè)比值<0.4時(shí)患FIP的可能性較大,而>0.8時(shí)患FIP的可能性較小[12]。另一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)在一群健康的貓群中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)A:G>0.6,他們提出當(dāng)這一數(shù)值>0.6時(shí)可排除患有FIP,但這一數(shù)值<0.6卻無(wú)法說(shuō)明患有FIP[13]。因此,筆者認(rèn)為A:G的比值越低提示患有FIP可能性越大。貓較少發(fā)生嚴(yán)重性貧血,在沒(méi)有肝酶活性升高或嚴(yán)重貧血的情況下,高膽紅素血癥的存在可增強(qiáng)貓患有FIP的可能性[14]。
APP稱為急性期蛋白,主要由炎癥引起巨噬細(xì)胞或者單核細(xì)胞釋放的一類(lèi)細(xì)胞因子。α1-酸性糖蛋白(acid glycoprotein, AGP)是APP的一種,對(duì)其含量的測(cè)定有助于FIP的診斷,因?yàn)樵贔IP病例中常出現(xiàn)AGP水平升高(>1.5 mg/mL)的現(xiàn)象,因此AGP數(shù)值的升高可作為疑患FIP的指標(biāo)[15]。
血常規(guī)和生化檢測(cè)是動(dòng)物醫(yī)院常用的檢測(cè)方法。上述所提到的檢測(cè)指標(biāo)適用于大部分感染FIPV的貓,指標(biāo)異常與臨床癥狀相結(jié)合對(duì)FIP的診斷起指導(dǎo)的作用,但是確診則需要多方面的考量。
2.1.3 影像學(xué)檢查 對(duì)患貓X光檢查可見(jiàn)腹部膨大,胸腹腔影像密度增高并呈大面積分布。超聲檢查患貓?jiān)诎螂浊胺脚c大腸周?chē)梢?jiàn)大量的無(wú)回聲區(qū),伴隨肝腎指標(biāo)異常[16]??赏ㄟ^(guò)X光和超聲等影像學(xué)檢查得知患貓胸腹腔是否有積液,同時(shí)能夠檢測(cè)腎臟和肝臟是否存在異常,特別是在貓患干性腹膜炎時(shí),若無(wú)其他明顯癥狀,可優(yōu)先使用超聲檢測(cè)肝臟、腎臟來(lái)幫助進(jìn)行FIP的診斷。
2.1.4 Rivalta實(shí)驗(yàn) 對(duì)濕性腹膜炎而言,檢測(cè)腹水的成分能有助于疾病的診斷,腹水的測(cè)試比血液更有價(jià)值[8]。FIP腹水通常是透明、粘稠、微黃且富含蛋白質(zhì)的液體,總蛋白濃度>35 g/L(>50%球蛋白)。通過(guò)Rivalta的實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果可證明腹水為滲出液。將腹水滴加到8 mLddH2O與一滴98%乙酸的混合液中,腹水若在混合液中保持渾濁液滴狀沉入底部則為陽(yáng)性,若腹水形狀消失并與混合液融合則提示為陰性。雖然陽(yáng)性結(jié)果無(wú)法直接診斷為FIP,但仍可作為一種有效的輔助診斷方法[17]。
2.1.5 腦脊液檢測(cè) 非滲出型的FIP患貓更容易出現(xiàn)神經(jīng)癥狀[6],其腦脊液可以檢測(cè)到FIPV[18],是診斷神經(jīng)型FIP最有效的方法。但腦脊液會(huì)因蛋白質(zhì)和炎癥細(xì)胞增多而變得粘稠[19],使樣品的獲得存在一定難度,且操作不當(dāng)易形成腦疝,所以在進(jìn)行腦脊液采樣的時(shí)候,要操作規(guī)范。對(duì)伴有神經(jīng)癥狀的貓進(jìn)行腦脊液分析時(shí),可見(jiàn)蛋白質(zhì)濃度和白細(xì)胞(主要是嗜中性細(xì)胞和單核細(xì)胞)數(shù)量上升[19-20]。有臨床流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn):當(dāng)腦脊液抗體效價(jià)大于1∶640時(shí)可以確認(rèn)為FIP,但是該結(jié)果的價(jià)值有限,因?yàn)樵撗芯课丛O(shè)立陰性對(duì)照[21]。一份研究報(bào)告通過(guò)健康貓與患有FIP的貓做RT-PCR檢測(cè)其腦脊液,發(fā)現(xiàn)只有患有FIP(部分出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀)的貓的腦脊液中能檢測(cè)到FIPV,而對(duì)照貓則無(wú),因此運(yùn)用RT-PCR的方法檢測(cè)腦脊液具有100%的特異性[22]。
總之,腦脊液的檢測(cè)對(duì)于確診有很大的幫助,其中運(yùn)用RT-PCR特異性可以達(dá)到100%,腦脊液中檢測(cè)到抗體也可以作為很好的確診依據(jù)。
2.1.6 眼部檢查 據(jù)報(bào)道,約有29%確診FIP貓的眼球出現(xiàn)以B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主的化膿性肉芽腫、葡萄膜炎和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎[10,23]。這些通常繼發(fā)于眼部結(jié)構(gòu)的炎癥和血-眼屏障的破壞,由于眼中存在感染FIPV的巨噬細(xì)胞,因此利用免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry, ICC)技術(shù)可以在房水中的巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到FIPV抗原[24]。但房水穿刺術(shù)主要用于細(xì)胞學(xué)和臨床病理學(xué)檢測(cè),對(duì)淋巴瘤的診斷更有意義[25-26];對(duì)于在未感染FIPV的貓中葡萄膜炎診斷也很常見(jiàn)[27],因此,僅靠眼球檢測(cè)不能作為確診依據(jù)。
2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)
2.2.1 RT-PCR 患FIP的貓比患FEC的貓更容易向外界排毒[28]。利用RT-PCR的方法,可檢測(cè)貓糞便、血液、滲出液和各種組織中的病毒核酸,其中腹腔積液和腦脊液樣品中FCoV的檢測(cè)可以幫助FIP的診斷。研究發(fā)現(xiàn),用RT-PCR的方法檢測(cè)腸系膜、腸淋巴結(jié)、肝臟、腎臟、脾臟、大網(wǎng)膜等組織樣品,除淋巴結(jié)外,大多組織的敏感性都很高[29-30]。與血清相比,使用RT-PCR檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)的敏感性更高[31]。
2012年的一項(xiàng)研究中,通過(guò)對(duì)FECV和FIPV氨基酸序列對(duì)比,發(fā)現(xiàn)在S蛋白的兩個(gè)氨基酸(M1058L和S1060A)位點(diǎn)出現(xiàn)差異,并證實(shí)利用這兩個(gè)氨基酸的差異可以在超過(guò)95%的病例中將FIPV與FECV區(qū)分開(kāi)來(lái)[32]。類(lèi)似的,2013年有研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)IPV和FECV的S蛋白在弗林蛋白酶切割處有差異[33]。這些為FIP的鑒別診斷提供了新的思路。
有研究學(xué)者想通過(guò)S基因來(lái)鑒別診斷FIP與FEC,使用FCoV特異性引物對(duì)102只貓的組織樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶定量PCR(RT-qPCR),同時(shí)對(duì)RT-qPCR陽(yáng)性樣品上的S基因進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果顯示這種方法并不能顯著增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度和特異性[28]。筆者認(rèn)為通過(guò)這種思路來(lái)鑒別FECV與FIPV是可行的,但還需要對(duì)FIPV的致病機(jī)制進(jìn)行研究,了解FECV轉(zhuǎn)化為FIPV的突變位點(diǎn)。
總之,RT-PCR是實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)手段,檢出率較高,但是目前大多只能檢出FCoV。在RTPCR結(jié)果為陽(yáng)性的同時(shí),結(jié)合臨床癥狀及生化指標(biāo),通??梢耘卸ㄘ埵欠窕加蠪IP。
2.2.2 熒光環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增 (reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)有研究團(tuán)隊(duì)探索這種方法來(lái)檢測(cè)FCoV的存在,通過(guò)瓊脂糖凝膠和羥基萘酚藍(lán)(hydroxynaphthol blue,HNB)染色來(lái)判定,結(jié)合RT-PCR以評(píng)估靈敏度和特異性。結(jié)果顯示,樣品總體特異性接近100%,但瓊脂糖凝膠和HNB的靈敏度分別為50%和54.5%。因此,RT-LAMP似乎是確認(rèn)病毒存在的很好方法,但不適合用于對(duì)陰性樣品的排除[34]。這種方法不需要昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的操作,可減少診斷的時(shí)間且特異性強(qiáng)(97%),但是該種方法存在靈敏度低(58%),檢測(cè)結(jié)果有一定誤差的缺點(diǎn)[35]。
2.2.3 血清抗體檢測(cè) FCoV感染后機(jī)體會(huì)產(chǎn)生特異性的抗體[36],實(shí)驗(yàn)性感染最早在7~28 d可檢測(cè)到抗體[37-38],因此抗體檢測(cè)可以在疾病的早期進(jìn)行。但是患有FIP的貓大約有10%沒(méi)有血清抗體的產(chǎn)生[39],在這些貓中,可能是炎癥導(dǎo)致血液成分(包括抗體)外滲,因此,無(wú)法通過(guò)抗體測(cè)定法來(lái)判定[40]。最近一項(xiàng)研究表明,F(xiàn)CoV病毒血癥甚至不能說(shuō)明FIP,因?yàn)闇y(cè)試發(fā)現(xiàn)FCoV呈陽(yáng)性的健康貓?jiān)跍y(cè)試的6個(gè)月內(nèi)均未出現(xiàn)FIP或臨床疾病[41],所以從腹水中或者腦脊液中檢測(cè)到FIPV病毒會(huì)比血清中檢測(cè)到病毒更有助于診斷。
FCoV的血清抗體檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法、間接免疫熒光抗體檢測(cè)(immunoinfluscent assay test,IFAT)法和快速免疫遷移試驗(yàn)[42]。這些檢測(cè)方法都是以抗原(例如:FCoV感染的貓細(xì)胞)作為底物,來(lái)檢測(cè)不同稀釋倍數(shù)的血清。間接免疫熒光是檢測(cè)FCoV的金標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰 性時(shí)則提示貓不會(huì)排毒,而血清檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性時(shí),則提示貓已被FCoV感染且產(chǎn)生抗體(感染2~3周后)。Ⅰ、Ⅱ型FCoV和豬傳染性 胃腸炎病毒都可以利用間接免疫熒光的方法進(jìn)行檢測(cè)。值得注意的是,在個(gè)別情況下檢測(cè)結(jié)果會(huì)受到影響,比如并發(fā)感染(FIV與全身性真菌病)、自身免疫疾病、近期免疫接種和使用治療甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)的藥物(甲巰咪唑、他巴唑、甲硫咪唑)等,因此,應(yīng)使用未感染的正常細(xì)胞作為陰性對(duì)照,若結(jié)果為陽(yáng)性且正常、細(xì)胞為陰性,則可證明底物與FCoV結(jié)合[40]。
2.2.4 抗體檢測(cè)試劑盒 抗體檢測(cè)方法靈敏度高、專一性強(qiáng),是未來(lái)最有可能大量應(yīng)用于市場(chǎng)的檢測(cè)方法。有研究團(tuán)隊(duì)對(duì)這些檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)估,包括IFAT和ELISA。間接免疫熒光抗體測(cè)試的靈敏度可達(dá)96%,而ELISA在樣品量較少時(shí)是最佳的選擇[42]。目前市場(chǎng)上已有FCoV抗體的檢測(cè)試劑盒,但是這些試劑盒還無(wú)法精確檢測(cè)FIPV,因此還需要進(jìn)一步研發(fā)針對(duì)FIPV檢測(cè)的試劑盒。
2.2.5 腹水的免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 將腹水樣品作為底物來(lái)檢測(cè)是否存在FIPV抗體的方法所得結(jié)果差異性大,有研究者提出抗體檢測(cè)和RNA檢測(cè)相結(jié)合可用于濕性腹膜炎的診斷[40,43]。
將腹腔滲出液離心得到的細(xì)胞沉淀用福爾馬林固定,再用石蠟包埋,通過(guò)免疫組化(immunohistochemistry, IHC)的方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè),盡管處理時(shí)間較長(zhǎng),但可以提高FCoV抗原檢測(cè)的可靠性,且已有報(bào)道用腦脊液離心得到的巨噬細(xì)胞做免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry, ICC)可檢測(cè)到FCoV[44]。
腹水的產(chǎn)生作為濕性腹膜炎重要的臨床癥狀,獲得腹水對(duì)診斷有很大的幫助,但是FCoV也有可能會(huì)存在于沒(méi)有患FIP的貓滲出液中[35,45]。所以單獨(dú)的腹水病毒檢測(cè)并不能作為確診依據(jù),需要多方面一起考慮。
2.2.6 病理變化 病變組織內(nèi)FCoV抗原的免疫組織化學(xué)染色被認(rèn)為是用于診斷FIP的另一種金標(biāo)準(zhǔn)[10],對(duì)貓活檢常使用兩種方法:Tru-cut活檢(TCB)和細(xì)針穿刺活檢(FNAB)。有研究團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn),將組織樣品固定后切片,通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)或免疫熒光(IF)對(duì)組織(通常為積液)樣品進(jìn)行染色,利用抗體與FCoV抗原的結(jié)合,通過(guò)顏色變化(ICC)或產(chǎn)生熒光(IF)來(lái)判定結(jié)果,但是,用這些方法檢測(cè)結(jié)果顯示靈敏度低[46],作者對(duì)此的解釋是由于細(xì)胞損傷使獲得的樣品不足[47]。此外,在腸系膜淋巴結(jié)樣本中發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果,導(dǎo)致特異性僅為91%。因此,僅由FNA或TCB獲得的樣品做免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)無(wú)法確診FIP[46-47]。
通過(guò)FIP引起的組織病理變化對(duì)巨噬細(xì)胞做免疫組化(IHC),敏感性可達(dá)97%~100%[48]。IHC還被用于檢測(cè)異常組織或非家養(yǎng)貓科動(dòng)物巨噬細(xì)胞中的FCoV抗原。例如,在兩只由FIP引起的具有非典型皮膚損傷的貓的皮膚中檢測(cè)到FIPV抗原[48],在獅子的眼組織中檢測(cè)到FCoV抗原[49]。
總之,目前最常用、有效的檢測(cè)方法是RTPCR,結(jié)果判定為陽(yáng)性后結(jié)合臨床生化血常規(guī)檢測(cè)可以確診是否感染FCoV,特別是用腹水和腦脊液作為樣品所得的陽(yáng)性結(jié)果可以幫助對(duì)FIP的診斷。FCoV突變性高,不同毒株之間基因差異大,因此對(duì)RT-PCR引物的設(shè)計(jì)要求高。實(shí)驗(yàn)室還可以利用血清學(xué)抗體檢測(cè)的方法,這種方法有著方便快捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),相信在未來(lái)這種方法能夠得到更多的應(yīng)用。
總結(jié)之前的診斷思路,作出以下的診斷路線圖供獸醫(yī)師參考。
圖1 診斷路線參考圖Fig.1 Diagnostic route reference
目前我們無(wú)法基于一項(xiàng)診斷方法來(lái)確診FIP,需要綜合疑似患有FIP貓的病史、臨床特診和臨床病理指標(biāo)來(lái)判斷。根據(jù)實(shí)際情況,使用多種測(cè)試方法,對(duì)每只病貓進(jìn)行常規(guī)血液學(xué),血清生化檢查以及滲出液分析,尤其是對(duì)病毒的檢測(cè)。對(duì)于具有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的貓,進(jìn)行腦脊液分析可以起到幫助確診的作用。
近年來(lái),大部分研究者都把目光聚焦在S蛋白上。S蛋白可以誘導(dǎo)膜融合,對(duì)病毒的入侵起到重要作用[50-51]。研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)IPV和FECV S蛋白的部分氨基酸會(huì)出現(xiàn)穩(wěn)定差異[32],這些差異可以通過(guò)測(cè)序進(jìn)行比較,進(jìn)一步確定是FECV感染還是FIPV感染,為診斷FIP提供了新的思路。筆者認(rèn)為具有特異性的突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)將對(duì)FIP的診斷提供廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
FECV的RNA廣泛存在于全身各處,但是患FECV和患FIPV的貓所帶的病毒量有明顯差異[28],因此定量分析病毒含量可以為鑒別診斷提供幫助。
最近有研究者在貓冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp3上發(fā)現(xiàn)有兩種肽對(duì)區(qū)分FECV和FIPV有潛在價(jià)值[52]。也有研究表明,3c基因的截短能夠引起FECV向FIPV轉(zhuǎn)變,是FECV-FIPV轉(zhuǎn)換的決定性因素[1,4,53-54]。
綜上,本文闡述了目前針對(duì)FIP的臨床診斷方法,以及實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)手段。討論了FIPV與FECV的區(qū)別與轉(zhuǎn)化的觀點(diǎn),這些為之后尋找FIPV與FECV之間的差異提供思路;本文還討論了FECV與FIPV的差異包括患貓?bào)w內(nèi)的病毒量的不同等。研究顯示S蛋白對(duì)FECV與FIPV毒力的強(qiáng)弱起到關(guān)鍵作用[55],所以S蛋白在區(qū)分這兩種病毒上具有潛在研究?jī)r(jià)值。隨著對(duì)貓冠狀病毒研究的不斷深入,我們相信,在不久的將來(lái),F(xiàn)IP的鑒別診斷、預(yù)防及治療能夠更加高效、特異。