陳穎鈺，李 翔，郭愛珍

（1.國家動物結(jié)核病專業(yè)實驗室（武漢），武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，華中農(nóng)業(yè)大學，武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢 430070；4. 華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，武漢 430070）

牛結(jié)核病和布魯菌病在民間俗稱“兩病”，是影響奶牛業(yè)發(fā)展的重要疫病。前者主要引起呼吸道癥狀，導致奶牛的消瘦和咳嗽，并有可能通過飛沫或未經(jīng)消毒的病牛奶傳染給人；后者主要引起孕畜的流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙，也有通過接觸傳染給人的風險。因此，“兩病”不僅給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，還對公共衛(wèi)生造成巨大的威脅。

2016年《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》出臺，明確指出奶牛結(jié)核病及布魯菌病為優(yōu)先防治的動物病種；到2020年需達到規(guī)劃設定的考核標準，牛發(fā)病率下降到4%以下，動物發(fā)病率、死亡率和公共衛(wèi)生風險顯著降低。加上民眾對“兩病”認知程度的不斷提高，對乳品要求的不斷加大，養(yǎng)牛企業(yè)對兩病的防控意識也在不斷增加。“兩病防控”達到了空前的高度。

疫病防控的首要步驟是“監(jiān)測”。目前用于牛結(jié)核病的常用檢測方法主要有皮試法、干擾素-γ體外釋放法以及ELISA抗體檢測法。這三種方法中，皮試法基于動物活體，需對牛進行兩次保定并進行皮厚檢測；干擾素-γ體外釋放法及ELISA抗體檢測法則基于血液，需要進行采血后進行檢測。用于牛布魯菌病的檢測方法主要有虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗及ELISA抗體檢測等。三種方法都依賴于血清學檢測，需要采血后進行檢測。

無論是皮試還是采血，“兩病”的常規(guī)檢測方法均會對牛造成較大的應激，導致產(chǎn)奶量下降等反應，并需要大量的人力投入。在需要一年多次檢疫的高風險地區(qū)則更是會導致較大的損失。

大缸奶（bulk tank milk, BTM）是相對于個體奶樣而言的，為多頭奶牛的混合奶樣。規(guī)?；膛龆嗖蓸幼詣踊瘮D奶設備將多頭奶牛的原奶通過管道系統(tǒng)直接混合貯存，樣本也極容易獲得。由于原奶中含有一定比例的免疫球蛋白，且易于獲得，相對血液而言能大大減少應激，且混合奶樣的檢測，可以獲得與常規(guī)檢測相同的效果[1]，很多國家便將疫病監(jiān)測的對象瞄準了大缸奶，通過監(jiān)測大缸奶樣中的抗體水平，對疫病的群體狀況進行掌控。雖然該種監(jiān)測手段在很多國家已經(jīng)十分成熟，但在我國除普遍將奶樣檢測用于乳腺炎診斷外[2]，其他疫病方面卻少有應用。

在我國全面啟動兩病凈化的形勢下，無論是污染場、控制場或是凈化場，定期進行實時監(jiān)測都是必不可少的環(huán)節(jié)。大缸奶監(jiān)測作為一種低應激、易跟蹤、有效的檢測方法，值得大規(guī)模推行。

1 大缸奶樣檢測的優(yōu)勢

對于奶牛場而言，泌乳奶牛在牛場中所占比例是比較大的。大量的臨床經(jīng)驗都已經(jīng)證實，無論是進行皮試檢測，還是采血進行檢測，都將對奶牛造成較大應激，造成產(chǎn)奶量的下降及品質(zhì)的降低。通過檢測奶樣中的抗體，能夠完全降低對奶牛的應激，不會有任何的副作用。并且大缸奶樣的檢測，更是能夠有效降低成本和勞力。對檢測結(jié)果而言，能夠獲得與常規(guī)檢測相同的效果，并對整群的抗體流行狀態(tài)進行監(jiān)測，并且能夠為新發(fā)傳染病提供預警。因此應該作為疫病監(jiān)測的重要手段，值得關注與應用。

2 大缸奶抗體水平具備作為疫病監(jiān)測的能力

利用奶樣進行動物疫病的檢測具有顯而易見的優(yōu)勢：應激少、樣品易獲得。因此很多國家都已利用奶樣，甚至大缸奶樣進行多種疫病的監(jiān)測。通常認為，奶樣中抗體水平比血樣中的抗體水平要低一個數(shù)量級（即約為血清中抗體水平的1/10）。因此奶樣中抗體水平能否反映，或者有多大能力反映血清中的抗體水平一直是國際上大缸奶抗體研究的重點。

早在1991年，瑞典學者就已提出大缸奶中的抗體檢測完全可以作為奶牛場病毒性腹瀉病的監(jiān)測手段，大缸奶抗體與血樣中抗體有著非常好的相關性[3]。斯堪的納維亞半島國家更是利用大缸奶對牛病毒性腹瀉病進行監(jiān)測，并配合使用血清學檢測方法進行確診，成功控制并根除了該病[4]；比利時、丹麥、葡萄牙國家也早就將大缸奶及個體奶樣檢測作為牛支原體病常規(guī)檢測及監(jiān)測的重要手段[5-7]；我國也有利用大缸奶抗體檢測牛病毒性腹瀉病流行情況的報道，結(jié)果顯示77.8%的奶牛群體為陽性牛群[8]；愛爾蘭通過檢測奶樣中的抗體水平確定奶牛支原體乳腺炎的流行狀況[9]；丹麥則以一個非常系統(tǒng)的流行病學模型證實了牛奶中的抗體完全能夠作為副結(jié)核病低流行率場的評估手段，且大缸奶樣監(jiān)測是最為經(jīng)濟有效的監(jiān)測手段[10]；德國則早在二十世紀九十年代就官方授權許可了牛副結(jié)核病的奶樣ELISA抗體檢測方法，美國已開發(fā)出商業(yè)化檢測試劑盒[11]。在澳大利亞，用于防控牛支原體的一個非常重要的生物安全措施就是對奶樣進行PCR或ELISA抗體監(jiān)測[12]。

有數(shù)據(jù)顯示，血清和奶樣抗體ELISA結(jié)果間有著非常強的相關性。當以血清抗體檢測作為參考方法進行比對時，奶樣ELISA檢測的敏感性為60.9%，特異性高達94.6%[13]。一項基于奶牛副結(jié)核病檢測的研究報告指出，在高陽性率群體中（血清學流行率≥10%），大缸奶樣檢測的敏感性為85.7%～71.4%。在陰性群體中，大缸奶樣檢測的特異性為70.5%～53%[14]。施馬倫貝格病毒的血樣及大缸奶樣抗體檢測比對分析發(fā)現(xiàn)，兩種方法表現(xiàn)為高度相關（r=0.807，R2= 0.832）[15]，尤其對抗體低度高的群體，奶樣檢測具有非常強的預測能力。

當然，在利用大缸奶進行預測評估時，還必須要考慮到個體之間的差異。如干奶或育成?？赡芤驗闆]有收集奶樣而缺乏檢測，新產(chǎn)犢牛的母牛奶中抗體變化又較其他類型奶牛更大等，這些都有可能造成檢測上的偏差。因此在進行群體預測后，仍需要對這部分個體進行個體水平的評估。

3 大缸奶樣監(jiān)測在兩病監(jiān)測中的應用

事實上牛布魯菌病的檢測很早就已經(jīng)涉及了奶樣：全乳環(huán)狀試驗很早就成為了牛布魯菌病檢測的經(jīng)典方法[16]。同樣的，全乳環(huán)狀試驗同樣可以用在大缸奶的檢測上，多用作牛布魯菌病的篩檢手段，對大缸奶檢測出來的問題牛群再進行進一步的確診[17]。在抗體檢測方面，印度已將牛奶抗體檢測作為牛布魯菌病監(jiān)測的重要方法，不僅評估了牛布魯菌病的流行情況，更利用該方法對其風險因子進行了分析[18]。大缸奶用于布魯菌病的監(jiān)測，是英國法定控制體系的組成部分[19]，我國也有利用奶樣檢測牛布魯菌病的研究[20]。有文獻報道，奶樣PCR可以檢測出不少于100個布魯菌的感染；而奶樣ELISA則可以實現(xiàn)當1份陽性奶樣混合在200頭陰性奶樣（大缸奶）中時，檢測結(jié)果仍為陽性[1]；流行病學調(diào)查結(jié)果證實了奶樣ELISA抗體檢測與間接ELISA及競爭ELISA具有較高的一致性，且大缸奶的檢測靈敏度較高，與血清檢測結(jié)果保持一致，符合率分別為98.78%和97.56%[21]。

在牛結(jié)核病檢測方面，韓國學者對用大缸奶檢測奶牛結(jié)核病抗體水平進行了評價。當采用MPB70抗原進行牛結(jié)核病檢測時，血樣與奶樣檢測結(jié)果間表現(xiàn)出非常顯著的相關性，R2為0.83。當采用皮試法作為參考方法時，奶樣檢測及血樣檢測的敏感性分別為87.8%和81.8%，特異性分別為97.7%和100%。當采用大缸奶對群體進行篩檢時，陽性群的檢出率比皮試高出約2倍[17]，表現(xiàn)出了良好的陽性群體預測能力，且大大節(jié)省了人力及降低了奶牛的應激。有學者對185個來自美國密西根的無結(jié)核病牛群和來自墨西哥的17個結(jié)核感染牛群的大缸奶樣進行了ELISA抗體檢測，結(jié)果顯示，所有的陰性牛群的大缸奶檢測結(jié)果均為陰性，82.4%的感染牛群大缸奶檢測為陽性[22]。除抗體檢測外，大缸奶檢測在抗原檢測也有一定的應用。巴西某學者從個體奶和大缸奶水平評價了結(jié)核分支桿菌復合群的流行率，結(jié)果顯示，西北地區(qū)大缸奶中陽性率為2.15%，個體陽性率為1.91%，南部地區(qū)大缸奶中陽性率為1.91%，個體陽性率為1.6%[23]。進一步證實了大缸奶對奶牛結(jié)核病抗原的診斷價值。

4 大缸奶檢測方法的挑戰(zhàn)與應用建議

基于大缸奶檢測的好處是顯而易見的：降低成本、節(jié)約時間。但是也不可避免的存在一定的問題。其中最為關鍵的應該是大缸奶檢測的敏感性。雖然部分研究顯示大缸奶檢測有較好的敏感性，但當群體中存在少量的陽性及大量的陰性個體時，大缸奶的混合則導致對陽性奶樣的稀釋而呈現(xiàn)假陰性結(jié)果。如何去對大缸奶檢出的結(jié)果做出正確的判斷，奶樣與真實抗體水平究竟有什么樣的推演關系，是目前學者們熱烈討論的問題，更是進行大缸奶檢測過程中建模的重點。

由于大缸奶樣的敏感性存在有一定的局限，因此在應用時并不適合作為牛病檢測的確診，但基于該方法的特異性較高，因此更適合將大缸奶樣檢測法作為篩選方法或作為預警，對其檢測出來的陰性樣本，認為是潔凈群體，對陽性樣本則通過血清學或其他敏感性更高的方法進行確診來降低對個體的誤判，減少隨之帶來的經(jīng)濟損失。

在動物疫病不斷更新的形勢下，早期、準確的對動物疫病進行判斷，同時減少由多次檢測帶來的經(jīng)濟損失是養(yǎng)牛行業(yè)的新的追求。作為一種國際上成熟的，我們國家也正在趨向成熟的監(jiān)測、預警方法，大缸奶樣檢測對兩病的監(jiān)測必將對兩病的控制、根除及凈化起到積極的推動作用，具有極為廣闊的應用前景。