丁仰保，何劍橋，劉林林，余良政，崔柏楊，周華波，韋祖樟，歐陽(yáng)康，黃偉堅(jiān)，陳 櫻

（1.家畜傳染病與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2. 南寧市華波寵物醫(yī)院，南寧 530004）

貓杯狀病毒（Feline calicivirus, FCV）屬于皰疹病毒屬，單股正鏈RNA病毒，主要引起貓科動(dòng)物上呼吸道疾病及口腔潰瘍等主要臨床癥狀[1-2]。FCV具有高度流行趨勢(shì)，自1957年Fastier分離得到首株FCV以來(lái)，研究人員陸續(xù)從家貓[3]、老虎以及獵豹等貓科動(dòng)物中成功分離得到多株FCV[4]，并且還從患有腹瀉癥狀的狗中檢測(cè)到FCV[5]。由于FCV毒株的不斷變異，1998年美國(guó)的Pedersen等[6]首次報(bào)道了FCV相關(guān)的致死性全身系統(tǒng)性疾病（Virulent systemic disease FCV, VS-FCV），除表現(xiàn)為上呼吸道疾病等常規(guī)臨床癥狀外，感染貓還出現(xiàn)不同程度的皮膚水腫、發(fā)熱、潰瘍性皮炎、厭食和黃疸，死亡率高達(dá)50%；2013年，意大利的Battilani等[7]在一例免疫過(guò)FCV的死亡寵物貓中也分離得到一株VS-FCV毒株；2015年，劉永相等[8]首次發(fā)現(xiàn)虎VS-FCV?？梢?jiàn)，VSFCV毒株已經(jīng)在世界上許多國(guó)家和地區(qū)出現(xiàn)，并且早期疫苗株已經(jīng)不能夠提供足夠的保護(hù)，這嚴(yán)重危害到了寵物貓等貓科動(dòng)物的生命安全[9-10]。

FCV全基因組由3個(gè)開(kāi)放性閱讀框（open reading frame, ORF）組成，ORF1基因主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白前體，ORF2和ORF3基因分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和次要結(jié)構(gòu)蛋白VP2[11]。其中，ORF2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白（VP1），按功能域劃分為A、B、C、D、E和F 6個(gè)區(qū)。A區(qū)域利用蛋白酶切割功能形成成熟的結(jié)構(gòu)蛋白；B、D、F區(qū)相對(duì)比較保守；C和E區(qū)變異性較大，特別是E區(qū)包含大部分的抗原線性表位和鑒別VS-FCV的特征性氨基酸突變位點(diǎn)，變異最為明顯，也是早期疫苗免疫失敗的重要原因[12]。因此，了解FCV流行病學(xué)特征及其遺傳進(jìn)化規(guī)律，將為今后防控FCV和篩選候選疫苗株提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源及處理 2018年3月至2019年9月，從廣西地區(qū)采集疑似FCV臨床癥狀的貓鼻拭子59份?；疾∝堉饕獮楹粑栏腥?，伴有發(fā)熱（體溫為38.5℃～40.1℃），并出現(xiàn)口腔潰瘍、流涎和口眼鼻分泌物增多等主要臨床癥狀。將RT-PCR鑒定為陽(yáng)性的樣品，在旋渦振蕩1 min后，10 000×g、4℃離心4 min，棄棉簽，保存在-80℃已備接毒用。

1.2 細(xì)胞和主要試劑 貓腎細(xì)胞（crandell feline kidney cells, CRFK）由中國(guó)軍事科學(xué)院惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室保存。Primestar Mix購(gòu)自TaKaRa公司；Nucleic Acid Purification Kit購(gòu)自康寧公司；dNTP、RNasin酶抑制劑、M-MuLV Reverse Transcriptase（200U/L）購(gòu)自寶生物（大連）有限公司采購(gòu)；DNA膠回試劑盒購(gòu)自天根生化科技（有限）公司；DMEM培養(yǎng)基以及胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。

1.3 病毒分離和透射電鏡分析 將鑒定為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行過(guò)濾除菌，接種在長(zhǎng)至90%左右的單層CRFK細(xì)胞，37℃培養(yǎng)48 h，每12 h觀察是否有細(xì)胞病變（cytopathic effect, CPE），當(dāng)有明顯CPE時(shí)，取細(xì)胞上清液進(jìn)行3輪空斑純化，將純化的病毒送塞維爾公司進(jìn)行透射電鏡分析，其余凍存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒RT-PCR鑒定 按照Nucleic Acid Purification Kit試劑盒說(shuō)明書提取病毒總RNA。以P6引物（5'-CCCTGGGGTTAGGCGCWG-3'）作為反向引物[13]，并按照AMV反轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。具體體系如下：5×Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP mix 1 μL，P6（25 pmol/L）0.5 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.25 μL，RNasin抑制劑0.25 μL，RNA 8 μL。42℃反轉(zhuǎn)錄1 h。根據(jù)Abd-Eldaim[14]設(shè)計(jì)的引物和程序，對(duì)純化的病毒細(xì)胞上清液進(jìn)行鑒定。

1.5 病毒全基因組擴(kuò)增和序列拼接 根據(jù)何平等[10]先前設(shè)計(jì)的引物稍作修改，對(duì)獲得的FCV毒株進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，運(yùn)用Lasergene DNAStar 7.1中的SeqMan軟件對(duì)獲得的分段基因進(jìn)行序列拼接，并通過(guò)NCBI（BLAST，megablast；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行檢索。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性2 min；98℃變性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸1 min 30 s～3 min不等，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。膠回收產(chǎn)物送廣州華大生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù) 從GenBank上下載其他50株FCV的ORF2基因序列，運(yùn)用MEGA6.0 beta軟件，通過(guò)鄰接法（1000個(gè)重復(fù)）構(gòu)建遺傳進(jìn)化分析樹(shù)，并分析其序列特征。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離情況 將鑒定為陽(yáng)性的29份鼻拭子樣品接種單層CRFK細(xì)胞后，24 h內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓，呈串珠狀的典型細(xì)胞病變效應(yīng)（圖1A）。通過(guò)RT-PCR鑒定，結(jié)果表明，細(xì)胞上清液能成功擴(kuò)增獲得550 bp左右的目的片段，與預(yù)期結(jié)果相符合（圖1B）。通過(guò)三輪空斑純化，將細(xì)胞上清液濃縮進(jìn)行電鏡鑒定，結(jié)果顯示該病毒粒子的衣殼由呈中央凹陷的杯狀殼粒構(gòu)成，衣殼呈正二十面體，直徑為30～40 nm，符合FCV病毒粒子的特征（圖1C），因此將該分離株命名為NN01-19。

圖1 NN01-19株的分離鑒定Fig.1 Isolation and identification of NN01-19 strain

2.2 病毒全基因組擴(kuò)增和序列拼接 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增獲得基因片段（G1片段為1332 bp，G2片段為1947 bp，G3片段為2765 bp，G4片段為2288 bp）與預(yù)期大小相符（圖3）。將四個(gè)片段進(jìn)行序列拼接，發(fā)現(xiàn)本研究獲得的NN01-19分離株基因組全長(zhǎng)7709 bp，其中，5'UTR依舊高度保守，ORF1的長(zhǎng)度為5292 bp（20-5311 bp），ORF2為2010 bp（5314-7323 bp），ORF3為321 bp（7319-7640 bp）。ORF3起始密碼子與ORF2的終止密碼子有4個(gè)核苷酸重疊，與以前的研究結(jié)果一致，而且3'UTR延伸到7709個(gè)堿基。

圖2 NN01-19毒株全基因組擴(kuò)增圖Fig.2 Amplification of complete genome of NN01-19 stain by RT-PCR

2.3 ORF2基因的遺傳進(jìn)化分析 將ORF2基因與國(guó)內(nèi)外代表毒株進(jìn)行比較分析并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NN01-19分離株與東北地區(qū)分離株FCV-JL4的核苷酸和氨基酸同源性分別高達(dá)86.8%和93.1%，與2013年分離的廣西早期毒株GX01-13的同源性僅為77.9%和86.5%，并且與疫苗株的同源性也僅為76.3%～77.2%和87.0%～87.4%（表1）。遺傳進(jìn)化樹(shù)分析可知，NN01-19與FCV-JL4以及GX01-13均屬于GI株群，與FCV-JL4處于同一分支，但是與GX01-13和疫苗株遺傳距離卻相對(duì)較遠(yuǎn)，均不在同一個(gè)遺傳進(jìn)化分支上（圖3A和3B）。結(jié)果表明，F(xiàn)CV變異程度較大，并且分布也不具有明顯的地域特征。

表1 NN01-19分離株與代表株之間的同源性分析Table 1 Homology of ORF2 gene between NN01-19 and representative strains

圖3 ORF2基因的核苷酸和氨基酸遺傳進(jìn)化樹(shù)（A為核苷酸遺傳進(jìn)化樹(shù), B為氨基酸遺傳進(jìn)化樹(shù))Fig.3 Phylogenetic trees based on nucleotides and amino acids of ORF2 gene（A and B means phylogenetic tree based on nucleotides and amino acids, respectively)

2.4ORF2D和E區(qū)抗原線性表位分析 本研究以F9疫苗株為參照株，其抗原線性表位為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)與廣西早期分離株GX01-13的ORF2D和E區(qū)進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)（圖4），D區(qū)抗原線性表位依舊高度保守；E區(qū)的抗原線性表位則發(fā)生高度變異，與GX01-13相比，NN01-19新增了T448A、T450G、G451Q和T454S 4個(gè)抗原突變位點(diǎn)。

圖4 ORF2 D和E區(qū)抗原線性表位分析圖譜Fig.4 Linear epitope analysis of antigen in D and E regions of ORF2

2.5 VS-FCV特征性氨基酸分析 本研究以Foley J等[15]對(duì)E區(qū)分析的具有VS-FCV突變特征的氨基酸位點(diǎn)為依據(jù)，將分離毒株與早期分離株GX01-13和16株VS-FCV毒株VP1蛋白的部分超變區(qū)序列（426-461 aa）進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NN01-19在430、448和452位點(diǎn)發(fā)生突變，其中只有V430T符合VS-FCV氨基酸位點(diǎn)特征（圖5）。

圖5 VP1蛋白 部分E區(qū)的氨基酸比較圖Fig.5 Comparison of amino acid sequences of partical E region in VP1 protein

3 討論

在過(guò)去40年的時(shí)間里，F(xiàn)CV被看做貓的重要病原之一。由于該病毒RNA聚合酶的校正功能的缺乏，導(dǎo)致其基因組頻繁變異，甚至在出現(xiàn)VSD毒株感染時(shí)，疫苗失去保護(hù)力。隨著近年來(lái)對(duì)FCV的不斷監(jiān)測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)廣西地區(qū)FCV流行呈上升趨勢(shì)。在對(duì)感染FCV貓進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，我們發(fā)現(xiàn)所有年齡階段的貓都能感染，1-3月齡的幼貓相對(duì)較易感，感染率高達(dá)41.4%（12/29）（數(shù)據(jù)未出示）。有報(bào)道稱，成年貓感染后表現(xiàn)更為嚴(yán)重，甚至致死，特別是VS毒株的出現(xiàn)可能改變了主要保護(hù)抗原的蛋白結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致免疫逃逸[16]。為深入了解FCV流行規(guī)律及其變異情況，本研究對(duì)新分離的FCV NN01-19毒株進(jìn)行了遺傳進(jìn)化和致病性氨基酸位點(diǎn)的分析。

FCV毒株分為GI和GII兩個(gè)株群，其中GI群以高致病性的Kaos、Air和UTCVM-NH2等國(guó)外的VSFCV毒株為主，GII株群則為經(jīng)典株群，其中，大部分中國(guó)的FCV毒株均屬于GII株群[17]。有趣的是，通過(guò)ORF2核苷酸和氨基酸的遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，本研究分離的廣西毒株NN01-19并非屬于GII經(jīng)典株群，而是與廣西早期毒株GX01-13同屬GI高致病性群體。同時(shí)，NN01-19和GX01-13雖同屬一個(gè)株群，但核苷酸和氨基酸同源性卻相對(duì)較低，分別僅為77.9%和86.5%，這也再一次證實(shí)了FCV隨著時(shí)間推移，其基因組的變異程度較大。此外，與疫苗株相比，本研究分離的毒株仍舊與其不在同一分支，而且同源性也較低，這意味著當(dāng)前疫苗的使用可能會(huì)造成貓群的免疫失敗。另外，通過(guò)分析NN01-19全基因組特征，我們發(fā)現(xiàn)該毒株的確發(fā)生了較大變異，與早期分離株GX01-13相比，NN01-19 ORF3基因3'端的非編碼區(qū)延伸到7709個(gè)堿基，這也與大多數(shù)報(bào)道的毒株均不相同（數(shù)據(jù)未顯示）。2011年，Clotilde等[18]證明3'端非編碼區(qū)可以與核仁素（一種普遍存在的多功能核仁穿梭磷蛋白）相互作用，廣泛參與病毒的翻譯和復(fù)制，這些相互作用通常有利于提高其宿主特異性和組織嗜性，該毒株3'端的變異是否具有相同的有利影響有待進(jìn)一步研究。除此之外，F(xiàn)CV VP1蛋白變異最大的E區(qū)部分，含有病毒大多數(shù)的抗原線性表位，它可作為流行病學(xué)調(diào)查最有力的工具[19]。本研究將3輪空斑純化的病毒分別進(jìn)行E區(qū)的基因擴(kuò)增，在3次擴(kuò)增結(jié)果一致的情況下，對(duì)其E區(qū)進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明，與早期分離株GX01-13相比，NN01-19新增了T448A、T450G、G451Q和T454S四個(gè)抗原突變位點(diǎn)，同一地區(qū)不同時(shí)期的毒株在短短幾年內(nèi)，其抗原位點(diǎn)便發(fā)生了諸多變異。早期疫苗為何不能再提供足夠的防護(hù)，其毒株抗原的不斷變異可能在其中占據(jù)重要原因。與此同時(shí)，更嚴(yán)重的可導(dǎo)致惡性全身系統(tǒng)性疾病的VSFCV毒株也在免疫選擇壓力下開(kāi)始出現(xiàn)和流行，全身多器官病變和高死亡率為其主要特征[20-21]。有研究發(fā)現(xiàn)，VS-FCV具有特征性氨基酸位點(diǎn)，F(xiàn)oley等[15]對(duì)E區(qū)具有VS-FCV突變特征的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)V430T、T438V、N443S、A448K、A452E、D455M 和 K458S與其致病性相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，相比早期分離株GX01-13毒株，NN01-19毒株發(fā)生了3個(gè)位點(diǎn)的突變，其中就包含致病性突變位點(diǎn)（V430T），該位點(diǎn)的改變是否會(huì)增強(qiáng)該毒株的致病性，仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究將近期分離的毒株與早期毒株進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷幾年的遺傳進(jìn)化，F(xiàn)CV基因組發(fā)生了較大變異，雖然在同一個(gè)基因群，但是核苷酸同源性僅為77.9%。有趣的是，該毒株的超變區(qū)（E區(qū)）出現(xiàn)了3個(gè)特征性氨基酸位點(diǎn)的改變，其中430位點(diǎn)氨基酸（V430T）的突變，符合致病性氨基酸突變特點(diǎn)，為后期驗(yàn)證其致病性提供了科學(xué)依據(jù)?？傊粩嗉訌?qiáng)對(duì)FCV的監(jiān)測(cè)，并掌握其流行病學(xué)規(guī)律和分子特征，將為今后篩選疫苗候選毒株奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。