馬 暢,彭國良,李 妍* (.吉林醫(yī)藥學院免疫藥理學重點研究室，吉林 吉林 303;.聯(lián)勤保障部隊臨潼康復療養(yǎng)中心，陜西 西安 70699)

全球疾病調(diào)查發(fā)現(xiàn)乳腺癌已經(jīng)成為威脅女性健康的首要疾病。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)統(tǒng)計,2020年全球乳腺癌新發(fā)病例高達226萬例，乳腺癌約占所有女性惡性腫瘤的24.2%，中國女性發(fā)病人數(shù)及死亡人數(shù)均居世界首位[1-2]。乳腺癌的治療多以化療、放療、手術(shù)切除為主。患者治療期間痛苦程度較高，且治療后仍有30%左右的患者會出現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)移，部分患者在治療期間還會出現(xiàn)如心臟毒性、腎毒性、骨髓抑制等毒副作用，影響愈后生活。

紫草素是從中草藥紫草根部提取的一種小分子萘醌類的化合物[3]，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗癌、抗血栓形成、免疫調(diào)節(jié)等作用，具有易獲取、價格低、毒副作用小等優(yōu)勢[4-5]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)是一個大家族[6]，其表達和活性在不同細胞中受到嚴密調(diào)控，可以監(jiān)測腫瘤細胞是否發(fā)生浸潤或遷移。紫草素是否影響腫瘤細胞轉(zhuǎn)移與侵襲尚不明確。本研究以體外培養(yǎng)的小鼠乳腺癌細胞4T1為模型，探討紫草素對乳腺癌細胞增殖的抑制作用，分析相關機制，闡述其在乳腺癌治療中的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小鼠乳腺癌細胞4T1保存于吉林醫(yī)藥學院免疫學實驗室。紫草素購自百靈威科技有限公司；細胞培養(yǎng)液1640購自Gibco公司；MTT、DMSO購自美國Sigma公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；鼠抗人β-actin、MMP-2抗體購自美國Abcam公司；免疫印跡試劑購自索萊寶公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)及藥物處理

液氮罐中取出凍存的4T1細胞，復蘇、傳代至對數(shù)生長期。傳代培養(yǎng)使用含10%胎牛血清的1640液，每周傳代2到3次，按照實驗所需鋪板，培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞濃度為2×104/mL，每孔100 μL接種于96孔板培養(yǎng)12 h，棄去上清每孔加入含紫草素的培養(yǎng)液200 μL，使其終濃度分別為0、12.5、25、50和100 μmol/L，每個藥物濃度設6個復孔。PBS封邊。

1.3 MTT還原法測細胞增殖

在給予藥物紫草素后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，移除上清，按照1∶10加入MTT與血清培養(yǎng)基的混合液(MTT保存使用過程中注意避光)，96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，PBS組為空白組，每孔加入DMSO 200 μL溶解10 min，使用酶標儀室溫下490 nm波長處測定吸光度值，每組實驗重復3次。計算細胞增殖抑制率(inhibition rate,IR)。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡

消化并收集細胞，取每組1×106個細胞進行染色，PBS洗滌兩次，用5 mL 80%冷甲醇溶液固定細胞。檢測分析前離心棄去固定液，用PBS洗滌細胞2次，細胞周期測定使用Triton-100的PI和RNA酶室溫下避光染色30 min；凋亡使用PI避光染色30 min，流式細胞儀(Epics，美國貝克曼)上機檢測。

1.5 免疫印跡分析相關蛋白

取對數(shù)生長期的4T1細胞加入紫草素使終濃度為0、12.5、25、50和100 μmol/L處理細胞24 h，去上清液PBS洗滌細胞2次，消化收集貼壁生長的細胞，加裂解液裂解超聲破碎提取蛋白，免疫印跡分析MMP-2蛋白的表達。

1.6 統(tǒng)計學分析亡

用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用單因素方差分析，結(jié)果用均數(shù)±標準差表示，P<0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 紫草素對4T1細胞增殖的影響

紫草素以濃度依賴方式抑制乳腺癌細胞4T1生長，藥物作用72 h的半數(shù)抑制率(IC50)值約為50 μmol/L(圖1)。

圖 1 不同濃度紫草素對4T1細胞增殖的抑制作用

2.2 紫草素對4T1細胞周期與凋亡的影響

不同濃度紫草素(0、12.5、25、50和100 μmol/L)處理4T1細胞24 h后，流式細胞術(shù)分析細胞周期(表1)。與對照組比較，紫草素組處理組顯著使細胞阻滯于G0/G1期細胞，而S期和G2/M期細胞百分率不同程度降低。

2.3 紫草素對4T1細胞MMP-2表達的影響

不同濃度紫草素(0、12.5、25、50和100 μmol/L)處理4T1細胞免疫印跡技術(shù)檢測MMP-2表達的結(jié)果見圖2，顯示紫草素對MMP-2表達具有抑制作用。

圖 2 紫草素對4T1細胞MMP-2表達的影響

3 討 論

2000-2021年，乳腺癌的發(fā)病率急速增高，但死亡率卻有所降低。乳腺癌早期的治療相較于晚期更容易，生存率也更高，而腫瘤晚期的浸潤與遷移會直接導致患者死亡率增加[1-2]。乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，分為管腔A、管腔B、HER2過表達、受體轉(zhuǎn)移性乳腺癌(metastatic breast cancer，MBC)和三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)。TNBC是指雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子均為陰性的乳腺癌，占所有乳腺癌的10%～17%。TNBC在具有較強的浸潤和遷移性，治療上相較于其他類型的乳腺癌更難，且對于晚期TNBC幾乎無法治愈，篩選合適的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物是治療的捷徑。

表 1 紫草素對4T1細胞周期與凋亡的影響

紫草素有明顯的抗腫瘤作用，它可以抑制胃癌MGC803細胞、甲狀腺癌細胞的增殖，誘導卵巢癌HO-8910細胞的凋亡，促進人乳腺癌MCF-7發(fā)生自噬[4-5]。徐洋等研究發(fā)現(xiàn)紫草素可通過抑制STAT3-MMP2信號通路抑制人胃癌MGC803遷移[6]。為探究紫草素影響乳腺癌細胞的藥理學機制，采用TNBC細胞小鼠乳腺癌細胞4T1，具備較強遷移能力的腫瘤，有利于研究紫草素的抗腫瘤機制。本實驗的結(jié)果顯示，紫草素能夠抑制乳腺癌細胞4T1的增殖，且呈一定程度的濃度依賴性，這與安興晨等的研究結(jié)果一致[7]。為進一步探討紫草素抑制乳腺癌細胞增殖的原因，采用流式細胞術(shù)測定了不同濃度紫草素作用后4T1細胞的細胞周期與凋亡。結(jié)果顯示細胞周期阻滯于G0/G1期的占比增多，處于S期與G2/M期的細胞呈不同程度的降低，且細胞凋亡的數(shù)量增多。王瑜等研究紫草素可以通過PI3K/AKT信號通路上調(diào)p53基因的表達而誘導SMMC-7721細胞凋亡的發(fā)生[8]。為研究紫草素是否會影響腫瘤細胞遷移，實驗采用免疫印跡的方法測定了對照組與不同濃度紫草素給藥后的乳腺癌4T1細胞的MMP-2與β-actin蛋白。MMP-2是檢測腫瘤細胞遷移的標志物[9]，其含量與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移有直接的聯(lián)系。實驗結(jié)果顯示，與空白組相比較，藥物組MMP-2/β-actin的蛋白含量顯著降低。提示紫草素可能影響小鼠乳腺癌4T1細胞的遷移與浸潤，對TNBC轉(zhuǎn)移后的治療有幫助，為藥物進一步研究提供了實驗數(shù)據(jù)的支持。

綜上所述，紫草素可以通過濃度依賴的方式抑制4T1細胞的增殖，通過MMP-2信號通路導致細胞周期阻滯于G0/G1期，抑制乳腺癌細胞4T1的侵襲轉(zhuǎn)移，誘導凋亡的發(fā)生，從而為抗乳腺癌藥物的研發(fā)提供實驗依據(jù)。