李昂 王順 劉桃源 衣同輝 李淑艷 潘洪明

【摘要】 目的：研究BMAP-28對(duì)乳腺癌Bcap37細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法：體外培養(yǎng)Bcap37細(xì)胞，設(shè)置對(duì)照組（BMAP-28濃度為0 μg/mL）和實(shí)驗(yàn)組（BMAP-28濃度分別為20、40、60、80 μg/mL）。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bcap37細(xì)胞的增殖情況;DAPI染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)得BMAP-28對(duì)Bcap37細(xì)胞的增殖具有抑制作用，BMAP-28的IC50=49.19 μg/mL。DAPI染色可見(jiàn)隨著B(niǎo)MAP-28濃度的增加，細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，凋亡形態(tài)明顯。流式細(xì)胞術(shù)顯示細(xì)胞凋亡率逐漸增高，趨勢(shì)和DAPI染色結(jié)果一致（P<0.01）。結(jié)論：BMAP-28能顯著抑制乳腺癌Bcap37細(xì)胞的增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，有望成為臨床乳腺癌治療的新型抗癌藥物。

【關(guān)鍵詞】 BMAP-28 乳腺癌 增殖 凋亡

Study on Anti-tumor Activity of BMAP-28 on Breast Cancer Bcap37 Cells/LI Ang， WANG Shun， LIU Taoyuan， YI Tonghui， LI Shuyan， PAN Hongming. //Medical Innovation of China， 2022， 19（10）： 0-016

[Abstract] Objective： To study the effects of BMAP-28 on the proliferation and apoptosis of breast cancer Bcap37 cells. Method： Bcap37 cells were cultured in vitro， the control group （BMAP-28 concentration was 0 μg/mL）

and the experimental group （BMAP-28 concentrations were 20， 40， 60， 80 μg/mL） were set up. CCK-8 assay was used to detect the cell proliferation of breast cancer Bcap37 cells， DAPI staining was used to observe the morphological changes of cell apoptosis， flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of cells. Result： CCK-8

assay showed that BMAP-28 can inhibit the proliferation of breast cancer Bcap37 cells， IC50=49.19 μg/mL. DAPI staining showed that with the increase of BMAP-28 concentration， the number of cell apoptosis increased， and the apoptotic morphology was obvious. Flow cytometry showed that the rate of cell apoptosis increased and the trend was consistent with the result of DAPI staining （P<0.01）. Conclusion： BMAP-28 can significantly inhibit the proliferation of breast cancer Bcap37 cells and promote the apoptosis of cancer cells， which is hopefully to be a new type of anticancer agents for clinical breast cancer treatment.

[Key words] BMAP-28 Breast cancer Proliferation Apoptosis

First-authors address： School of Medical Technology， Qiqihar Medical University， Qiqihar 161006， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.10.004

癌癥是全球范圍最受關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（international agency for research on cancer，IARC）最新發(fā)布的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新發(fā)癌癥病例1 930萬(wàn)例，死亡1 000萬(wàn)例。而在女性當(dāng)中，乳腺癌（占新發(fā)病例的11.7%）首次超過(guò)肺癌（11.4%），成為女性癌癥中最常見(jiàn)的類(lèi)型[1]。一些常規(guī)的化療藥物不僅利用率低，癌癥復(fù)發(fā)率高，且常伴有細(xì)胞耐藥性[2]。

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是少于50個(gè)氨基酸組成的小分子短肽，通常帶正電荷，且呈兩親性[3]。它是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，能殺滅細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)及病毒等[4]。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的AMPs同時(shí)具有抗腫瘤活性[5-6]。BMAP-28是牛中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種牛骨髓抗菌肽，屬于Cathelicidin家族，于1996年首次被發(fā)現(xiàn)[7]。該肽由28個(gè)氨基酸組成，其N(xiāo)-末端呈兩親性-螺旋構(gòu)象（殘基1-18），C-末端是疏水尾部（殘基19-27），帶有7個(gè)正電荷[8]。早期研究報(bào)道BMAP-28具有廣譜抗菌活性，能夠抑制多種革蘭陰性、革蘭陽(yáng)性細(xì)菌及其他耐藥菌[9-10]，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)BMAP-28還具有不同程度的抗腫瘤活性。本課題通過(guò)研究BMAP-28對(duì)乳腺癌Bcap37細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為癌癥的臨床研究及新型抗乳腺癌藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 研究起止時(shí)間：2021年3-8月。乳腺癌細(xì)胞系Bcap37由大連理工大學(xué)惠贈(zèng);BMAP-28購(gòu)自安徽國(guó)肽生物有限公司;DMEM-H（美國(guó)Gibco公司）;胎牛血清（美國(guó)Clark公司）;CCK-8試劑盒（南京碧云天生物技術(shù)有限公司）;DAPI染色液（北京索萊寶有限公司）;Annexin V-FITC/PI試劑盒（北京博奧森技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Bcap37細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，PBS沖洗后用0.25%胰酶消化，再用配制好的培養(yǎng)基吹打并制備成單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖能力 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Bcap37細(xì)胞，按5×103個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板。設(shè)置對(duì)照組（BMAP-28濃度0 μg/mL）、實(shí)驗(yàn)組（BMAP-28終濃度分別為20、40、60、80 μg/mL），每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。每孔加入100 μL相應(yīng)濃度的BMAP-28，對(duì)照組加入相同體積DMEM-H培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，孵育2 h后測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值。每組不同濃度取3個(gè)復(fù)孔的OD值計(jì)算細(xì)胞活力。計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），并篩選最佳作用時(shí)間。

1.2.3 DAPI實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞凋亡情況 細(xì)胞處理及分組方式同1.2.2。取6孔板以5×104個(gè)/孔密度接種細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。BMAP-28作用24 h后用PSB沖洗2次，每孔加入適量4%多聚甲醛溶液，置于-20 ℃冰箱固定20 min。棄去固定液，用PBS沖洗2次后，每孔加入適量DAPI染色工作液，室溫下避光孵育10 min。PBS沖洗2～3次后，熒光顯微鏡下拍照觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞處理及分組方式同1.2.2。細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于6孔板。BMAP-28作用24 h后，離心收集各組細(xì)胞。按照試劑盒操作流程進(jìn)行Annexin V-FITC和PI染色，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組中正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖情況 BMAP-28作用24、48 h后，對(duì)Bcap37細(xì)胞增殖的抑制趨勢(shì)均增強(qiáng)，且隨著濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸降低。實(shí)驗(yàn)組不同濃度24、48 h細(xì)胞活力與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0繪制24、48 h時(shí)BMAP-28濃度抑制曲線（圖1）。采用非線性回歸分析，計(jì)算出BMAP-28作用Bcap37細(xì)胞24 h的IC50=49.19 μg/mL。

2.2 DAPI實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞形態(tài)變化 與對(duì)照組相比，不同濃度的BMAP-28作用24 h后，可見(jiàn)細(xì)胞邊界逐漸收縮變圓，細(xì)胞形態(tài)變得模糊形成碎片，細(xì)胞核大小不一，核內(nèi)部分染色質(zhì)出現(xiàn)斷裂或皺縮形成團(tuán)塊。且隨藥物濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量減少，凋亡細(xì)胞增多，見(jiàn)圖2。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 對(duì)照組（0 μg/mL）、實(shí)驗(yàn)組（20、40、60、80μg/mL）細(xì)胞凋亡率依次為（3.983±1.556）%、（11.423±1.776）%、（31.767±5.159）%、（37.400±2.651）%、（44.833±4.826）%，隨著B(niǎo)MAP-28濃度的增高，凋亡細(xì)胞數(shù)量隨之增多，趨勢(shì)和DAPI染色結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)組不同濃度（20、40、60、80μg/mL）細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。從20 μg/mL開(kāi)始，BMAP-28對(duì)Bcap37細(xì)胞殺傷作用逐漸增大，見(jiàn)圖3。

3 討論

目前乳腺癌已超越肺癌，成為當(dāng)今全球第一大癌癥類(lèi)型[11]?？鼓[瘤藥物的開(kāi)發(fā)一直是癌癥治療的重點(diǎn)課題，分子靶向治療與免疫療法在癌癥治療中取得一定成效，但不良反應(yīng)及細(xì)胞耐藥性問(wèn)題仍然難以解決[12-13]?？咕挠捎谄浞肿恿啃?、易于人工合成、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注[14]。對(duì)BMAP-28早期的研究主要集中在抗細(xì)菌、真菌及抗病毒活性。如BMAP-28能抑制多殺性巴氏桿菌（P.Multocida）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）及牛皰疹病毒1型（BoHV-1）和5型（BoHV-5）等病原體的生長(zhǎng)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)BMAP-28還對(duì)淋巴細(xì)胞瘤、甲狀腺癌等腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[9，15-16]。

無(wú)限增殖是惡性腫瘤最基本的生物特征之一，也是引起癌癥患者死亡的根本原因[17]。本研究通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)證明，隨著B(niǎo)MAP-28濃度的增加，Bcap37細(xì)胞存活率逐漸減小，說(shuō)明BMAP-28具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用。凋亡是細(xì)胞生理性死亡的過(guò)程，而腫瘤細(xì)胞由于調(diào)控機(jī)制等發(fā)生改變，往往能夠逃避凋亡機(jī)制，獲得無(wú)限增殖的能力[18]。因此促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，是一些新型抗癌藥物研究的重要方向之一。細(xì)胞凋亡的完整實(shí)現(xiàn)涉及廣泛的蛋白質(zhì)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相互作用，以及一系列信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)作用[19]。Caspase-3和Caspase-9是早期細(xì)胞凋亡細(xì)胞的標(biāo)志。前期已有學(xué)者證明BMAP-28能激活甲狀腺癌TT細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9途徑，其蛋白和mRNA水平表達(dá)量均顯著增加，標(biāo)志著凋亡程序的啟動(dòng)[16]。另外，BMAP-28還可以誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的開(kāi)放導(dǎo)致線粒體功能紊亂，并促使細(xì)胞色素C（Cyt-C）的釋放誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DAPI染色后可見(jiàn)Bcap37細(xì)胞邊界逐漸收縮變圓，形態(tài)變得模糊形成碎片，細(xì)胞核大小不一，核內(nèi)部分染色質(zhì)斷裂或皺縮形成團(tuán)塊，提示BMAP-28能夠促進(jìn)Bcap37細(xì)胞的凋亡。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)BMAP-28促進(jìn)了Bcap37細(xì)胞發(fā)生凋亡，并呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)（P<0.01）。

綜上所述，BMAP-28能顯著抑制Bcap37細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡，然而其分子機(jī)制尚不清楚，將在下一步的研究中繼續(xù)探討。

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（收稿日期：2021-08-17） （本文編輯：程旭然）