陳慧杰 鄧衍明 齊香玉 陳雙雙 馮景 韓勇 王華娣 秦紫藝

摘要：繡球葉片對植物病原體的入侵非常敏感，極易發(fā)生病害，尤其是葉斑病，其發(fā)生會引起葉片呈現(xiàn)大小不一的病斑，嚴(yán)重時會導(dǎo)致葉片病死、脫落，甚至整株死亡，嚴(yán)重影響繡球的生長及開花質(zhì)量。為明確引起繡球葉斑病的病原菌種類，在對繡球葉斑病田間發(fā)病癥狀進(jìn)行觀察的基礎(chǔ)上，采用組織分離培養(yǎng)法從繡球Bailer的病葉上獲得5種病原真菌分離物;通過致病力檢測試驗(yàn)，從5種病原真菌分離物中篩選到強(qiáng)致病力菌株H-3-1;采用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合rDNA-ITS基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析法對病原菌H-3-1進(jìn)行鑒定，表明其為棒孢屬多主棒孢菌;進(jìn)一步通過菌落生長法測定H-3-1的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)病原菌H-3-1菌絲生長的最適溫度為28 ℃，最適pH值為8，最適碳源為乳糖，最適氮源為蛋白胨。結(jié)果為繡球棒孢葉斑病的病原學(xué)研究提供依據(jù)，也可為該病害的科學(xué)防治提供參考。

關(guān)鍵詞：繡球;葉斑病;病原菌鑒定;生物學(xué)特性

中圖分類號： S436.8+1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）07-0106-06

收稿日期：2021-09-07

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31901359）;江蘇省蘇州市科技計(jì)劃（編號：SNG201923）;江蘇省林業(yè)科技創(chuàng)新與推廣項(xiàng)目（編號：SYF2021C0029）。

作者簡介：陳慧杰（1989—），女，河南周口人，博士，助理研究員，從事觀賞植物栽培與植物病理學(xué)研究。E-mail：chenhuijie2020@163.com。

通信作者：鄧衍明，博士，研究員，從事花卉遺傳育種與栽培技術(shù)研究。E-mail：nksdym@163.com。

繡球品種繁多、株型優(yōu)美、花期較長，極具應(yīng)用價值和經(jīng)濟(jì)價值，不僅能用于園林綠化和家庭美化，還可作為盆花、鮮切花、插花、干花及藥用植物，被譽(yù)為世界三大花園植物之一，在花卉產(chǎn)業(yè)中占有重要地位[1-2]。但關(guān)于繡球的研究主要集中于栽培技術(shù)、雜交育種和分子生物學(xué)特性等方面，較少涉及病害[3-5]。事實(shí)上，繡球葉片對植物病原體的侵染非常敏感，極易發(fā)生各種病害，尤其是葉斑病[6]。繡球葉斑病發(fā)生時，葉片呈現(xiàn)圓形或近圓形的葉斑，嚴(yán)重時會出現(xiàn)葉片病死、脫落，甚至整株死亡的現(xiàn)象，很大程度上影響繡球的生長及開花質(zhì)量[1，7]。

葉斑病是一類世界范圍內(nèi)常見的植物真菌病害[8]，主要由真菌門（Eumycota）半知菌亞門（Deuteromycotina）絲孢綱（Hyphomycetes）絲孢目（Hyphomycetales）暗色孢科（Dematiaceae）棒孢屬（ Corynespora ）致病真菌引起[9]。葉斑病于1906年在歐洲種植的黃瓜上被首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[10]，1936年在非洲發(fā)現(xiàn)它能夠引起橡膠落葉[11]。此后，該病害在包括我國在內(nèi)的70多個國家中均有發(fā)生，給300多個屬的500多種植物帶來了危害[12-13]。雖然葉斑病在繡球?qū)僦参锷习l(fā)現(xiàn)的相對較晚，但在我國多地均有發(fā)生，尤其在長江中下游地區(qū)夏季高溫高濕的環(huán)境下極易暴發(fā)，成為危害最嚴(yán)重的病害，極大地降低了繡球產(chǎn)品的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值[6，14]。

迄今為止，與黃瓜[15-17]等蔬菜植物相比，觀賞植物上有關(guān)葉斑病病原鑒定及病原生物學(xué)特性的研究均較少，關(guān)于繡球葉斑病的研究更少且不夠深入系統(tǒng)，多集中在病害調(diào)查及自然條件下繡球品種的葉斑病抗性比較等方面[1]。因此，本研究通過對江蘇省南京地區(qū)繡球葉斑病的病原菌進(jìn)行分離、鑒定，以及對病原菌rDNA的ITS區(qū)序列進(jìn)行分析，從而明確了南京地區(qū)繡球葉斑病的病原菌為棒孢菌，并進(jìn)一步研究了該病原菌菌絲生長的相關(guān)生物學(xué)特性，旨在為繡球棒孢葉斑病的病原學(xué)研究提供依據(jù)，也為該病害的科學(xué)防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 繡球葉斑病癥狀觀察與病樣采集

2020年9月于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院繡球種質(zhì)資源圃中進(jìn)行繡球葉斑病的癥狀觀察、記錄和拍照，重點(diǎn)觀察病害部位、病斑大小、形狀和顏色，并采集具有葉斑病典型特征的病葉樣品，供下一步進(jìn)行病原菌的分離使用。

1.2 病原菌分離、純化與保存

用自來水沖洗采集的葉片，在超凈工作臺上剪取病健交界處的小塊組織（約2 mm×2 mm），浸入70%乙醇中消毒10 s，再轉(zhuǎn)入15%過氧化氫（H 2O 2）中消毒15 min，隨后在無菌水中沖洗，并重復(fù)此消毒過程2次。將葉片置于滅過菌的濾紙上，吸干水分，接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上。將接種后的培養(yǎng)基置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 2～3 d，當(dāng)培養(yǎng)基上植物材料周圍出現(xiàn)小菌落時，在菌落邊緣切取小圓餅（直徑約5 mm），接種于新的PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)一步挑單孢培養(yǎng)直至純化。純化后，將菌株再次接種到新的PDA平板培養(yǎng)基上備用。保存時，沿菌落邊緣切取直徑約為5 mm的菌餅3個，置入裝有30%甘油（500 μL）和馬鈴薯葡萄糖液體（PDB）培養(yǎng)基（500 μL）的2 mL離心管中[18]。

1.3 病原菌致病力檢測

采集繡球Bailer（ Hydrangea macrophylla ?‘Bailer’，商品名為Endless Summer，中文譯為無盡夏）相同葉位（從上往下數(shù)第3葉位）、大小相似、新鮮健康的葉片，置于自來水下流水沖洗30 min進(jìn)行表面消毒。然后將葉片置入鋪有2層濕潤濾紙（無菌水潤濕）的培養(yǎng)皿中，再在葉面的相同位置接種直徑 5 mm 的菌餅，每個菌株5次重復(fù)。取相同大小的PDA培養(yǎng)基圓餅置于健康葉片相同部位作為對照。將接種后的培養(yǎng)皿放入25 ℃培養(yǎng)箱中先進(jìn)行暗培養(yǎng)，48 h后置于溫度周期為25 ℃/18 ℃、光周期為16 h/8 h的條件下培養(yǎng)。在接種后0、5、10、15 d分別觀察并記錄葉片的發(fā)病情況，根據(jù)葉片的發(fā)病程度和病斑直徑篩選出致病力最強(qiáng)的菌株[18]。

1.4 病原菌形態(tài)觀察與分子鑒定

觀察強(qiáng)致病力菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，并在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)和子實(shí)體的有無、大小等。將篩選出的強(qiáng)致病力菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d;在無菌操作臺上用滅過菌的牙簽刮取少量表面菌絲，采用真菌DNA提取試劑盒（廣州歐米伽生物科技公司）提取其基因組DNA。將提取后的DNA用引物ITS1F/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠、純化后進(jìn)行測序。采用NCBI-Blast進(jìn)行序列比對，并用Mega 5.05軟件構(gòu)建Neighbor Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹[19]。

1.5 病原菌生物學(xué)特性研究

1.5.1 碳源對病原菌菌絲生長的影響

以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將其中的蔗糖分別等量替換成葡萄糖、果糖、淀粉和乳糖等不同碳源;取直徑約5 mm的菌餅置于不同碳源的培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng) 7 d 后，用十字交叉法[20]測定菌落直徑，每個處理重復(fù)3次。

1.5.2 氮源對病原菌菌絲生長的影響

以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將其中的硝酸鈉分別等量替換成蛋白胨、酵母浸粉、磷酸氫二胺和甘氨酸等不同氮源;取直徑約為5 mm的菌餅置于不同氮源的培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，用十字交叉法測定菌落直徑，每個處理重復(fù)3次。

1.5.3 溫度對病原菌菌絲生長的影響

取直徑約為5 mm的菌餅置于PDA培養(yǎng)基上，分別置于25、28、37、42 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測定菌落直徑，每個處理重復(fù)3次。

1.5.4 pH值對病原菌菌絲生長的影響

用 0.1 mol/L 鹽酸溶液和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值分別為5、6、7、8、9、10的PDA培養(yǎng)基，取直徑約5 mm的菌餅置于各培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測定菌落直徑，每個處理重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2007對試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與整理，并采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著分析（SSR法， P <0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 繡球葉斑病癥狀

繡球葉斑病主要危害繡球的葉片，在繡球的全生育期均可發(fā)病，且老葉發(fā)病更為嚴(yán)重。發(fā)病葉片初始時呈褪綠色小點(diǎn);中期時逐漸形成直徑一般為 2～3 mm 的圓形或近圓形病斑，病斑邊緣呈灰紫色;發(fā)病后期，病斑連成一片，葉片變黃、脫落，甚至整株枯死（圖1）。

2.2 繡球葉斑病主要病原菌

將繡球Bailer葉斑病發(fā)病葉片組織中分離到的菌株進(jìn)行科赫法則驗(yàn)證，得到5種繡球葉斑病的病原菌：H-3-1、H-4、H-6-1、H-7、H-8-1。將這些菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基上，由圖2可知，各菌落突起絮狀，由大量孢子生成而呈粉質(zhì)。其中，H-3-1和H-4菌落正面顏色呈灰色，H-6-1、H-7、H-8-1菌落正面顏色呈白色。

2.3 強(qiáng)致病力菌株的篩選

由圖3可知，分別用菌株H-3-1、H-4、H-6-1、H-7、H-8-1侵染繡球Bailer健康離體葉片10 d時，病斑直徑開始呈現(xiàn)明顯差異;侵染 15 d 時，菌株H-3-1侵染離體葉片的病斑平均直徑最大，為4.60 cm，而其他4個菌株的葉片病斑平均直徑分別只有2.75、3.07、1.23、1.38 cm，故H-3-1 的致病力最強(qiáng)。

2.4 強(qiáng)致病力菌株H-3-1的形態(tài)特征

繡球葉斑病強(qiáng)致病力菌株H-3-1的菌落在PDA平板培養(yǎng)基正面呈灰褐色，突起絮狀，由大量孢子生成而呈粉質(zhì)（圖4-a）;菌落背面呈淺黃至黃褐色（圖1-b）。在顯微鏡下觀察，可見菌絲致密、有分枝（圖4-c）;分生孢子形態(tài)呈圓柱形或倒棍棒形，半透明至淺褐色，具有假隔膜（圖4-d）。故從形態(tài)學(xué)特征的角度，繡球葉斑病強(qiáng)致病力菌株H-3-1 符合棒孢屬（ Corynespora ?spp.）菌株特征。

菌株H-3-1的ITS基因測序結(jié)果與NCBI核酸序列比對后結(jié)果表明，該菌株與多主棒孢菌（ Corynespora cassiicola ）（KF928286.1）菌株的相似性為100%，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一支（圖5）。結(jié)合菌株形態(tài)特征，確定該菌株為多主棒孢菌（ C. cassiicola ），命名為H-3-1。

2.5 強(qiáng)致病力菌株H-3-1的生物學(xué)特性

繡球葉斑病強(qiáng)致病力菌株H-3-1在不同碳源、氮源、溫度和pH值條件下的菌絲生長情況如圖6所示。H-3-1在不同碳源條件下的菌絲生長速度依次表現(xiàn)為乳糖 > 果糖 > 葡萄糖 > 蔗糖> 淀粉，但在前4種碳源中菌絲的生長速度無顯著差異，只有淀粉中菌絲生長速度顯著低于果糖和乳糖處理處理;H-3-1在不同氮源條件下的生長速度表現(xiàn)為蛋白胨>磷酸氫二銨>硝酸鈉>甘氨酸>酵母浸粉，但5種處理間差異并不顯著;H-3-1在不同溫度條件下的生長速度依次表現(xiàn)為28 ℃>25 ℃>37 ℃>42 ℃，其中28 ℃培養(yǎng)下的生長速度顯著快于其他溫度，故28 ℃是最適生長溫度;H-3-1的最快生長pH值為8，在該pH值下的生長速度顯著快于pH值為5的生長條件，但與其他處理間無顯著差異。

3 結(jié)論與討論

關(guān)于植物病原真菌的鑒定，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法常通過菌株和孢子形態(tài)特征的觀察進(jìn)行[21]。由于寄主、培養(yǎng)條件等因素的變化，病原真菌的形態(tài)特征也會發(fā)生一定程度的改變，這給傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法帶來了一定困難[22]。然而，病原真菌rDNA的ITS區(qū)段序列既具保守性，又在科、屬、種水平上具有特異性[23]。因此，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，通過rDNA-ITS序列分析技術(shù)進(jìn)行植物病原真菌的診斷、檢測及系統(tǒng)進(jìn)化分析，使得病原真菌的分類與鑒定更加準(zhǔn)確[24]。如崔曉霞等在對甜葉菊葉斑病病原菌分離、鑒定的研究中，采用了形態(tài)學(xué)觀察和系統(tǒng)進(jìn)化分析相結(jié)合的方法，確定了甜葉菊葉斑病的致病菌株為炭疽菌（ Colletotrichum ?spp.）和鏈格孢菌（ Alternaria ?spp.）[25];鐘文文等通過形態(tài)學(xué)特征觀察和rDNA-ITS基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合科赫法則和葉部解剖特征觀察，明確劍蘭葉斑病的病原真菌為葡萄殼小圓孢菌（ Coniothyrium vitivorum ?Miura）[26]。本研究在形態(tài)觀察的基礎(chǔ)上，結(jié)合rDNA-ITS序列分析及致病力檢測，從繡球‘Bailer’的發(fā)病葉片中成功分離并鑒定了繡球葉斑病強(qiáng)致病力菌株多主棒孢菌H-3-1。

關(guān)于葉斑病主要病原菌的研究表明，多主棒孢菌、 Cercosospora ?spp.、 Myrothecium roridum、Glomerella cingulata、Phoma exigua、Botrytis cinerea 均能引起葉斑病的發(fā)生，其中，多主棒孢菌占葉斑病分離菌株的一半以上，是葉斑病最主要的病原菌之一[27]。本研究中，通過致病力檢測、形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定，表明分離出的繡球葉斑病強(qiáng)致病力菌株H-3-1為多主棒孢菌。這是首次分離鑒定出繡球葉斑病強(qiáng)致病力病原菌株并明確其分類學(xué)地位。已有研究表明，病原菌多主棒孢菌入侵葉片不需要傷口，可通過葉片氣孔自然侵入，還可通過空氣或雨水傳播，且寄主范圍廣，對不良環(huán)境的抵抗力強(qiáng)，能夠以菌絲、厚垣孢子、分生孢子等形態(tài)在土壤、種子、保護(hù)地的越冬植物上過冬[12，28]。因此，應(yīng)根據(jù)病原物的這些特點(diǎn)，有針對性地采取繡球葉斑病科學(xué)的防治措施。

本研究發(fā)現(xiàn)，繡球葉斑病強(qiáng)致病力菌株H-3-1菌絲生長的最適溫度是28 ℃，最適pH值為8，這些研究結(jié)果與張笛等在甜瓜、黃瓜上分離出的棒孢葉斑病菌的研究結(jié)果[20，29]一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)以乳糖為碳源、蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基更有利于病原菌H-3-1菌絲的生長，這一點(diǎn)與已有報(bào)道不同。王爽等在甜瓜棒孢葉斑病菌的研究中發(fā)現(xiàn)，菌絲生長的最適碳源為乳糖，最適氮源為硝酸鈉[29];張笛等在黃瓜棒孢葉斑病菌的研究中發(fā)現(xiàn)，菌絲生長的最適碳源為甘露醇，最適氮源為甘氨酸[20]。這部分研究結(jié)果與已有報(bào)道的差異可能與病原菌對不同地理環(huán)境和不同來源寄主的適應(yīng)性不同有關(guān)[30]。通過對病原菌生物學(xué)特性及該病害的流行、蔓延時間可以推測出，該病菌具有喜溫好濕的特點(diǎn)。因此，本研究中分離與鑒定出的繡球棒孢葉斑病病菌強(qiáng)致病力菌株H-3-1及其生物學(xué)特性的研究，不僅為該病的診斷與防治提供了科學(xué)的理論依據(jù)，也為今后開展繡球棒孢葉斑病病菌致病物質(zhì)和致病機(jī)制研究提供了重要的參考。

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