范曉玉，王亞丹，邵平，韓凌，呂重寧*，路金才*

1.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.國(guó)家中成藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 本溪 117004

延胡索藥材為罌粟科（Papaveraceae）植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥根莖，其味辛、苦，性溫，具有活血、行氣、止痛的功效，用于胸脅、脘腹疼痛等證[1-2]。研究表明，延胡索通過(guò)其主要活性成分生物堿（如原阿片堿、延胡索乙素等）發(fā)揮鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等作用，臨床上應(yīng)用廣泛[3-5]。

延胡索與余零子、水半夏、夏天無(wú)、齒瓣延胡索等多種藥材外形極為相似，很容易混淆[6]。以傳統(tǒng)鑒別方法區(qū)分延胡索與其混偽品有一定難度，因此，建立一種快速有效的延胡索鑒別方法對(duì)其臨床用藥安全至關(guān)重要。DNA 分子鑒定技術(shù)是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA 片段來(lái)進(jìn)行物種鑒定的分子診斷技術(shù)[7]。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）最早被應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育和物種的分類(lèi)研究，在藥用植物及其混偽品的鑒別中具有顯著的優(yōu)勢(shì)[8-9]。已有研究將DNA 條形碼技術(shù)用于延胡索及其混偽品的鑒別，許燦新[10]對(duì)延胡索及其同屬的4種混偽品進(jìn)行鑒別，以藥材新鮮塊莖為研究對(duì)象，對(duì)比了ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK4 個(gè)條形碼的鑒別能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITS2 序列可以較好完成延胡索及其混偽品的鑒別；王丹依等[11]也利用ITS2 序列成功鑒別了紫堇屬包括延胡索在內(nèi)的6種植物。

現(xiàn)有研究均以延胡索的植物葉片或者新鮮塊莖為對(duì)象，而市售延胡索飲片都是經(jīng)過(guò)高溫蒸煮、醋炙或醋煮等的炮制加工品，其DNA 降解嚴(yán)重，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增困難，鑒別難度較大[12]。因此，本研究以延胡索加工品為研究對(duì)象，在文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上，采用改良后的試劑盒法提取樣品DNA，選取ITS2 條形碼對(duì)市售延胡索進(jìn)行真?zhèn)舞b別，以評(píng)價(jià)ITS2序列對(duì)延胡索加工品的鑒別能力。

1 材料

1.1 試藥

60 份市售延胡索飲片來(lái)自安徽中藥材市場(chǎng)或延胡索的主要產(chǎn)地浙江、陜西，樣品經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院路金才教授鑒定均為延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥根莖，具體信息見(jiàn)表1。同時(shí)，從GenBank 的Nucleotide 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）下載23 份延胡索及其混偽品序列信息，見(jiàn)表2。

表1 市售延胡索樣品信息

表2 從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載的延胡索及其混偽品序列信息

離心柱型植物基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；ITS2 擴(kuò)增引物、DNAMarker-D[生工生物工程（上海）股份有限公司]；EB 終結(jié)者Green 凝膠核酸染料（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；2×TaqPCR Mix酶（TaKaRa公司）。

1.2 儀器

MM400型混合球磨儀（Resch公司）；Centrifuge 5810/5810 R 型高速離心機(jī)（Eppendorf 公司）；MXRL-E 標(biāo)準(zhǔn)型旋轉(zhuǎn)混勻儀[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司]；Veriti?型梯度PCR 儀（Life Technoligies公司）；DYY-6C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；TOCAN-360 型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（上海領(lǐng)成生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 樣品DNA提取和PCR擴(kuò)增

取75%乙醇擦洗過(guò)的干凈飲片70 mg，平均放入2 個(gè)滅菌后的2 mL 離心管中，加入滅菌鋼珠，磨碎后采用植物基因組DNA 提取試劑盒提取樣品DNA，方法參照說(shuō)明書(shū)。由于藥材經(jīng)過(guò)高溫炮制后DNA 降解嚴(yán)重，難以擴(kuò)增出目的片段。為獲得高質(zhì)量的DNA，本實(shí)驗(yàn)對(duì)試劑盒法提取DNA 進(jìn)行改良，除將樣品質(zhì)量增加至70 mg 外，在加入提取液之前加入核分離液，以除去蛋白質(zhì)及酚類(lèi)物質(zhì)，加速細(xì)胞膜的裂解。同時(shí)適當(dāng)增加水浴時(shí)間（56 ℃，過(guò)夜），使細(xì)胞充分裂解。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，包括2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上游引物ITS2F（5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′）和下游引物ITS3R（5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′）[13]各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃，5 min；94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、45 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，將具有單一明亮目的條帶的產(chǎn)物送往美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.2 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用CodonCode Aligner 軟件對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行拼接、校對(duì)，去除引物及低質(zhì)量區(qū)?；陔[馬爾可夫模型的HMMer注釋方法，去除兩端5.8S和28S區(qū)段后獲得ITS2 間隔區(qū)序列。對(duì)所得序列進(jìn)行美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站的BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）相似性?huà)人鳎页鲎钕嗨菩蛄羞M(jìn)行物種鑒別。利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)，查找變異位點(diǎn)，計(jì)算鳥(niǎo)嘌呤+胞嘧啶（G+C）占比，比對(duì)后的序列基于Kimura 2-parameter（K2P）模型構(gòu)建鄰接（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，同時(shí)NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)各分支的置信度用靴帶法做1000次可信度分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

市售延胡索飲片共60份利用ITS2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示約80%（47 份）的樣品能夠擴(kuò)增出明顯單一、完整的條帶（部分凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1）。其中擴(kuò)增失敗的13 份樣品可能與其炮制加工方法有關(guān)，《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）2020 年版中規(guī)定延胡索的加工過(guò)程為“置沸水中煮至恰無(wú)白心時(shí)，取出，曬干”[2]，藥材經(jīng)高溫處理后往往會(huì)導(dǎo)致DNA嚴(yán)重降解，難以擴(kuò)增出目的片段。

圖1 市售延胡索樣品ITS2序列電泳圖（1～14號(hào)樣品）

3.2 基于ITS2序列的物種鑒定

將注釋得到的47 條ITS2 序列在中藥材DNA 條形碼鑒別系統(tǒng)（http://www.tcmbarcode.cn/china/）和GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性搜索，完成結(jié)果鑒定。以主要單倍型C1（YH8）為例，鑒定結(jié)果顯示（圖2），數(shù)據(jù)庫(kù)中與之最匹配的物種為C.yanhusuo，序列描述顯示鑒別覆蓋率為99%，使用MEGA 6.0軟件將其與參考序列KX896711 進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)219位A-G變異，延胡索主要單倍型219位為A，數(shù)據(jù)庫(kù)中單倍型219 位為G。該結(jié)果表明，ITS2序列能夠準(zhǔn)確鑒定市售延胡索飲片。本次實(shí)驗(yàn)所得序列完全符合要求，全部鑒定為正品延胡索。

圖2 市售延胡索樣品ITS2單倍型C1（YH8）序列與參考序列比對(duì)結(jié)果

3.3 延胡索藥材ITS2序列特征分析

共得到延胡索加工品的ITS2序列47條，長(zhǎng)度為238～242 bp，比對(duì)后長(zhǎng)度為242 bp，C+G 平均占比為70.51%，種內(nèi)變異較多，主要分布在序列的前半段，共存在17 個(gè)變異位點(diǎn)，分別為36、39、42、73位點(diǎn)C-G 變異，44、57 位點(diǎn)G-C 變異，46、70 位點(diǎn)A-G 變異，49 位點(diǎn)T-A 變異，52、55 位點(diǎn)T-A/G 變異，54、197 位點(diǎn)G-A 變異，74 位點(diǎn)T-C 變異。48、58、65 位點(diǎn)為簡(jiǎn)并堿基。有2 處插入/缺失，分別為35-36、67-68 位點(diǎn)。利用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行比對(duì)分析，歸納為5 種主要的單倍型（C1～C5），并提交至GenBanK 數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為MH260614-18，序列信息見(jiàn)圖3。

圖3 市售延胡索樣品ITS2序列主要單倍型（C1～C5）信息

3.4 NJ系統(tǒng)聚類(lèi)分析

實(shí)驗(yàn)中獲得的延胡索ITS2 序列種內(nèi)變異較大，為進(jìn)一步確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，基于K2P 模型構(gòu)建了延胡索的5 個(gè)單倍型與從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的23條ITS2序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖4所示，實(shí)驗(yàn)獲得的延胡索5 個(gè)主要單倍型與數(shù)據(jù)庫(kù)下載的延胡索的14 個(gè)ITS2 序列單聚為一大支，支持率為95%，而且不同種都能各聚為小枝，能較好地區(qū)分；東北延胡索單獨(dú)聚為一支，支持率為82%，此外，齒瓣延胡索與夏天無(wú)聚為一支，支持率為62%，與延胡索和東北延胡索分處不同的分支。NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，延胡索ITS2 序列和參考序列緊密聚合在一起，具有良好的單系性，能夠明顯區(qū)分其混偽品。

圖4 延胡索及其混偽品的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

4 討論

延胡索具有悠久的用藥歷史，臨床應(yīng)用廣泛，由于地方用藥習(xí)慣及藥材價(jià)格的升高，市場(chǎng)上出現(xiàn)了以次充好、摻假等情況，《中國(guó)藥典》2020 年版僅以延胡索乙素作為單一的檢測(cè)指標(biāo)，但目前延胡索的主要混偽品齒瓣延胡索、東北延胡索和夏天無(wú)也含有延胡索乙素，且東北延胡索和齒瓣延胡索均有一定的毒性[14]，因此有必要對(duì)市售延胡索飲片進(jìn)行鑒定，避免藥材混用、誤用的情況。

傳統(tǒng)的中藥鑒別方法主要為性狀鑒別、顯微鑒別和理化鑒別，其中性狀鑒別容易受主觀因素的影響，顯微和理化鑒別需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，耗時(shí)耗力[15]，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，逐漸將分子生物技術(shù)應(yīng)用到藥用植物的鑒別中，該方法主要是依據(jù)藥材的DNA 差異來(lái)完成對(duì)藥材的鑒別，已有研究將DNA 條形碼技術(shù)用于延胡索及其混偽品的鑒別，通常以延胡索新鮮塊莖為研究對(duì)象，但市售延胡索藥材都是經(jīng)過(guò)高溫蒸煮或醋炙等的加工品，其DNA 降解嚴(yán)重，PCR 擴(kuò)增困難，不利于進(jìn)行分子生物鑒別。本研究以延胡索炮制加工品為研究對(duì)象，以ITS2 作為DNA 條形碼成功擴(kuò)增出完整、符合要求且變異位點(diǎn)豐富的序列。除此之外，基于ITS2 條形碼序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，延胡索加工品與其混偽品分屬于不同的分支，而同一物種緊密的聚集在一起，表明ITS2 條形碼序列能夠準(zhǔn)確鑒別延胡索加工品及其混偽品，驗(yàn)證了ITS2 條形碼的鑒別能力，可以為保障延胡索的臨床安全合理應(yīng)用提供依據(jù)。