王巧萍，粟柯衡，元正菊，常志順，張 薇，張以芳，信愛國(guó)

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)禽與禽病研究所，云南昆明 650224；3.云南瑞栢泰生物科技有限公司，云南昆明 650041）

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）引起的一種發(fā)病急、傳播快的傳染性疾病[1]。DTMUV 最初于1955 年在馬來(lái)西亞吉隆坡的庫(kù)蚊體內(nèi)被分離到，主要引起蛋鴨產(chǎn)蛋率以及種蛋受精率和孵化率下降，生長(zhǎng)速度降低，部分病鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀[2]，甚至死亡。DTMUV 的宿主范圍廣泛，所有品種的鴨、鵝、雞、麻雀、鴿子[3]等均可被感染。DTMUV 接種于小鼠顱內(nèi)后，小鼠的發(fā)病癥狀與禽類相似[4]。DTMUV 屬于黃病毒科黃病毒屬Ntaya 病毒群，而黃病毒科的許多成員如登革熱病毒、森林腦炎病毒、乙腦病毒等都對(duì)人類健康構(gòu)成威脅[5]。鴨坦布蘇病毒病也具有公共衛(wèi)生學(xué)意義，從養(yǎng)鴨場(chǎng)員工的血清中可檢出DTMUV 抗體，說(shuō)明該病毒能夠在人與鴨之間傳播[6]。臨床發(fā)現(xiàn)本病造成的死亡率雖然較低[7]，但感染DTMUV 的鴨會(huì)因繼發(fā)其他機(jī)會(huì)致病菌感染而死亡。迄今為止，DTMUV 給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了至少數(shù)十億元的損失[8]。

DTMUV 引起的臨床癥狀不特異，與高致病性禽流感病毒等病原微生物引起的癥狀類似。用于診斷DTMUV的方法有病毒分離鑒定、血清學(xué)診斷、核酸檢測(cè)技術(shù)等。病毒分離鑒定試驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜，血清學(xué)檢測(cè)中的ELISA 需要酶標(biāo)儀等儀器設(shè)備，而核酸檢測(cè)中的qRT-PCR 和普通RT-PCR對(duì)設(shè)備和操作人員的技術(shù)水平要求高，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，不適合樣品的快速和大規(guī)模檢測(cè)。因此，建立一種能快速檢測(cè)DTMUV 的方法顯得尤為重要。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（reverse transcription loopmediated isothermal amplification，RT-LAMP）是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，根據(jù)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，在體系中加入有強(qiáng)鏈置換活性功能的BstDNA 聚合酶，可以實(shí)現(xiàn)等溫條件下核酸的指數(shù)型擴(kuò)增，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的檢測(cè)[9]。目前，RT-LAMP 的檢測(cè)結(jié)果多通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、濁度法、SYBR Green I 染料法等進(jìn)行肉眼觀察，判斷不夠準(zhǔn)確，且容易發(fā)生污染。本試驗(yàn)根據(jù)DTMUVNS5基因設(shè)計(jì)引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了一種檢測(cè)DTMUV 的熒光RT-LAMP檢測(cè)方法，為DTMUV 的實(shí)驗(yàn)室臨床檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效手段。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

DTMUV、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、I 型鴨肝炎病毒（duck hepatitis virus I，DHV-I）、III 型鴨肝炎病毒（duck hepatitis virus III，DHV-III）、傳染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）、7 日齡建水黃褐鴨，均由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)禽與禽病研究所提供；禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）H5、H7、H9 亞型抗原，購(gòu)自華南農(nóng)大生物藥品有限公司；

RNA 提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal RNA/DNA Extraction Kit，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；FastKing RT Kit（With gDNase）FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 試劑（2×SanTaqPCR Mix）購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；等溫?cái)U(kuò)增試劑Isothermal Master Mix（IMM），購(gòu)于英國(guó)OptiGenie Limited 公司；Genie II 等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)，由云南瑞栢泰生物科技有限公司提供。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

采用VectorNTI 8.0 序列分析軟件，對(duì)已發(fā)表的DTMUVNS5基因（登錄號(hào)為KJ958533）保守序列進(jìn)行對(duì)比分析，利用Lamp designer 軟件設(shè)計(jì)熒光RT-LAMP 引物，包含1 對(duì)外引物（正向外引物DTMUV-F3 和反向外引物DTMUV-B3）、1 對(duì)內(nèi)引物（正向內(nèi)引物DTMUV-FIP 和反向內(nèi)引物DTMUV-BIP）和1 對(duì)環(huán)引物（正向環(huán)引物DTMUV-LF 和反向環(huán)引物DTMUV-LB）。所有引物序列詳見表1，引物由碩擎生物科技有限公司合成。

表1 DTMUV 引物信息

1.3 病毒核酸提取及反轉(zhuǎn)錄

按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA/DNA Extraction Kit 說(shuō)明書提取DTMUV 及其他病毒核酸，用核酸定量?jī)x測(cè)定濃度，按FastKing RT Kit（With gDNase）FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA 于-20 ℃保存，RNA 于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 普通RT-PCR 和qRT-PCR 擴(kuò)增

普通RT-PCR 反應(yīng)體系為25.0 μL，包括2×SanTaqPCR Mix 12.5 μL，RNase-free ddH2O 9.5 μL，上下游引物（濃度均為10 pmol/L）各1.0 μL，cDNA 1.0 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，最后4 ℃冷卻。PCR 結(jié)束后取5.0 μL產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

qRT-PCR 的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件等相關(guān)信息參考文獻(xiàn)[10]。

1.5 熒光RT-LAMP 方法的建立

試驗(yàn)采用25.0 μL 反應(yīng)體系，包括Isothermal Master Mix（IMM）等溫?cái)U(kuò)增試劑15.0 μL，DTMUV-F3（5 μmol/L）1.0 μL，DTMUV-B3（5 μmol/L）1.0 μL，DTMUV-BIP（40 μmol/L）1.0 μL，DTMUVFIP（40 μmol/L）1.0 μL，DTMUV-LB（20 μmol/L）1.0 μL，DTMUV-LF（20 μmol/L）1.0 μL，cDNA 2.0 μL，RNase-free ddH2O 2.0 μL。將反應(yīng)管置于Genie Ⅱ等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)中，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 min，退火從98～80 ℃，0.05 ℃/s。在體系的基礎(chǔ)上，根據(jù)引物的Tm 值將溫度按照54、56、58、60、62、64、66、68 ℃依次遞增，反應(yīng)時(shí)間按照20、25、30 min 多次重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后觀察擴(kuò)增曲線，出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.6 熒光RT-LAMP 特異性試驗(yàn)

用確定的最佳試驗(yàn)條件分別對(duì)DTMUV 陽(yáng)性樣品及其他幾種病毒cDNA 進(jìn)行熒光RT-LAMP 檢測(cè)，觀察擴(kuò)增曲線以明確該方法是否與其他禽類病毒存在交叉反應(yīng)，從而評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.7 熒光RT-LAMP 敏感性試驗(yàn)

將DTMUV cDNA 用RNase-free ddH2O 連 續(xù)10 倍倍比稀釋作為檢測(cè)樣品，按最佳試驗(yàn)條件進(jìn)行熒光RT-LAMP 擴(kuò)增，測(cè)定模板最低檢出量，以判定該方法的敏感性。同時(shí)將其與普通RT-PCR 和qRT-PCR 敏感性進(jìn)行比較。

1.8 熒光RT-LAMP 重復(fù)性試驗(yàn)

將同一批次的DTMUV 細(xì)胞毒cDNA 分裝成3 份，-20 ℃保存。在同一天的3、6、9 h 分別進(jìn)行熒光RT-LAMP 重復(fù)檢測(cè)，每個(gè)樣品做3 個(gè)重復(fù)，此為批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；在試驗(yàn)的第1、3、5 天分別提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行熒光RTLAMP 檢測(cè)，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行重復(fù)，此為批間重復(fù)性試驗(yàn)。

1.9 熒光RT-LAMP 的初步應(yīng)用

經(jīng)測(cè)定，DTMUV 滴度為103.7TCID50/0.1 mL。將40 只7 日齡建水黃褐鴨平均分成4 組。其中，3組為試驗(yàn)組，分別按照0.1 mL/只腿肌注射接種原液（103.7TCID50）以及10-1稀釋（102.7TCID50）和10-2稀釋（101.7TCID50）的病毒液，1 組為對(duì)照組，注入等體積滅菌PBS。攻毒5 d 后處死各組鴨，分別采集每只鴨肝臟作為檢測(cè)樣品，提取樣品RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA 進(jìn)行熒光RT-LAMP 檢測(cè)，同時(shí)用普通RT-PCR 和qRT-PCR 進(jìn)行檢測(cè)并比較陽(yáng)性檢出率。

2 結(jié)果

2.1 熒光RT-LAMP 溫度篩選

經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化，最適反應(yīng)溫度為64～66 ℃，65 ℃為最佳（圖1）。

2.2 熒光RT-LAMP 特異性試驗(yàn)

將DTMUV 與NDV、DHV-I、DHV-III、IBDV 以 及AIV 亞型抗原（H5、H7、H9）的cDNA 在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，僅DTMUV 有“S”型擴(kuò)增曲線（圖2），產(chǎn)生尖峰狀特異性熔解曲線（圖3），而其他幾種病毒cDNA 均無(wú)擴(kuò)增曲線。

2.3 熒光RT-LAMP 敏感性試驗(yàn)及反應(yīng)時(shí)間篩選

將DTMUV 的cDNA（原始質(zhì)量濃度為9 ng/μL）用RNase-free ddH2O 連續(xù)10 倍梯度稀釋作為模板進(jìn)行熒光RT-LAMP 反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熒光RT-LAMP的最低檢測(cè)限為10-5稀釋度，即9×10-2pg/μL，換算成拷貝數(shù)為4×102copies/μL；觀察敏感性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線可知，25 min 之后為擴(kuò)增曲線的平臺(tái)期，20 min 時(shí)部分?jǐn)U增曲線未達(dá)平臺(tái)期，取25 min 為最佳反應(yīng)時(shí)間（圖4）；敏感性試驗(yàn)的熔解曲線均為90.5～90.7 ℃，最大誤差為0.2 ℃，誤差率為0.2%，屬于試驗(yàn)誤差（圖5）；qRT-PCR 的檢測(cè)限為10-5稀釋度，即9×10-2pg/μL，換算成拷貝數(shù)為4×102copies/μL（圖6）；普通RT-PCR 的檢測(cè)限為10-3稀釋度，即9 pg/μL，換算為拷貝數(shù)為4×104copies/μL（圖7）。結(jié)果表明，熒光RT-LAMP 方法的敏感性與qRT-PCR 方法一致，是普通RT-PCR 的100 倍。

2.4 熒光RT-LAMP 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

DTMUV cDNA 的批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，在3 h（圖8）、6 h（圖9）、9 h（圖10）的結(jié)果均為陽(yáng)性；批間重復(fù)性試驗(yàn)的結(jié)果顯示，在第1 天（圖11）、3 天（圖12）、5 天（圖13）的結(jié)果均為陽(yáng)性，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5 人工感染樣品檢測(cè)

將人工感染劑量為103.7、102.7、101.7TCID50的鴨組織采用熒光RT-LAMP、qRT-PCR 和普通RT-PCR 分別進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（表2）顯示，熒光RT-LAMP 和qRT-PCR 的檢測(cè)結(jié)果接近，普通RT-PCR 檢出率最低。

3 討論

本試驗(yàn)針對(duì)DTMUVNS5基因建立的熒光RT-LAMP 方法是將熒光染料插入擴(kuò)增產(chǎn)物的雙鏈DNA 中，產(chǎn)生并發(fā)散熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的累積與LAMP 產(chǎn)物的形成同步，結(jié)果可通過(guò)讀取擴(kuò)增曲線，同時(shí)觀察熔解曲線判斷是否為特異性擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的快速、全封閉式檢測(cè)，避免氣溶膠污染和假陽(yáng)性。相對(duì)于目前常規(guī)采用瓊脂糖凝膠電泳、濁度法、SYBR Green I 染料法、鈣黃綠素顯色法或者羥基萘酚藍(lán)（HNB）等使用肉眼觀察的RT-LAMP 方法，熒光RT-LAMP 方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

試驗(yàn)根據(jù)熔解曲線和Tm 值對(duì)反應(yīng)時(shí)間和溫度進(jìn)行優(yōu)化，避免非特異性擴(kuò)增和引物二聚體對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成的干擾，結(jié)果判定具有客觀性和可靠性。目前國(guó)內(nèi)學(xué)者建立的DTMUV RT-LAMP 檢測(cè)方法[11-14]擴(kuò)增時(shí)間均超過(guò)45 min，普通RT-PCR 需2 h，qRT-PCR 需1 h，而本試驗(yàn)建立的熒光RTLAMP方法僅需25 min，即可實(shí)現(xiàn)核酸的快速擴(kuò)增，適合大規(guī)模樣品檢測(cè)。該方法具有良好的特異性，NDV、DHV-I、DHV-III、IBDV、AIV 亞 型H5、H7、H9 抗原的核酸均不能檢出，而檢測(cè)DTMUV的熔解曲線呈尖峰狀，說(shuō)明產(chǎn)物單一，特異性良好。批內(nèi)和批間重復(fù)性結(jié)果證明其重復(fù)性良好。敏感性方面，對(duì)于同一份cDNA 樣品，熒光RT-LAMP和qRT-PCR 的最低檢測(cè)限均為9×10-2pg/μL，即4×102copies/μL，普通RT-PCR 的檢測(cè)限為9 pg/μL，即4×104copies/μL，熒光RT-LAMP 方法的敏感性與qRT-PCR 方法一致，是普通RT-PCR 的100倍，說(shuō)明熒光RT-LAMP 的敏感性良好，且其敏感性高于其他學(xué)者對(duì)DTMUV 建立的RT-LAMP方法[15-16]。初步應(yīng)用該方法，檢測(cè)人工接種試驗(yàn)鴨的肝臟，對(duì)感染劑量為103.7TCID50的樣品，熒光RT-LAMP、qRT-PCR 和普通RT-PCR 陽(yáng)性檢出率均為100%（10/10）；對(duì)感染劑量為102.7TCID50的樣品，熒光RT-LAMP 和qRT-PCR 方法檢出率均為100%（10/10），普通RT-PCR 檢出率為80%（8/10）；對(duì)于感染劑量為101.7TCID50的樣品，普通RT-PCR 檢出率為50%（5/10），qRT-PCR 陽(yáng)性檢出率為100%（10/10），熒光RT-LAMP 陽(yáng)性檢出率為90%（9/10），說(shuō)明熒光RT-LAMP 可用于組織感染樣品的檢測(cè)，且其檢出率高于普通RT-PCR，與qRT-PCR 接近。

試驗(yàn)根據(jù)DTMUVNS5基因建立的熒光RT-LAMP 檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性、重復(fù)性和敏感性，65 ℃ 25 min 即可完成快速檢測(cè)，為DTMUV的臨床檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)支持。