李 超，王淑婷，尼 博，張長(zhǎng)穩(wěn)，王玉英

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.青島水族館，山東青島 266031）

疫苗技術(shù)分為全病毒滅活疫苗、減毒活疫苗、病毒載體嵌合疫苗、基因工程亞單位疫苗、核酸疫苗等多條技術(shù)路線。第一代滅活和減毒活疫苗的生產(chǎn)應(yīng)用已然成熟，第二代基因工程疫苗也先后有產(chǎn)品問世。而信使核糖核酸（mRNA）疫苗屬于第三代疫苗技術(shù)，具有制備工藝簡(jiǎn)單、易規(guī)?；a(chǎn)和針對(duì)病原體變異有效性高等技術(shù)優(yōu)勢(shì)。滅活疫苗、亞單位疫苗安全性高，但免疫原性差，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的能力有限；弱毒疫苗、載體疫苗免疫原性強(qiáng)，能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫與細(xì)胞免疫，但安全性較差，存在核酸整合進(jìn)入宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)，其中弱毒疫苗還存在毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)；核酸疫苗中，DNA疫苗能夠同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫與細(xì)胞免疫反應(yīng)，但其保護(hù)效率通常較低，且也存在核酸整合進(jìn)入宿主基因的風(fēng)險(xiǎn)[1]。研究[2]表明，有的mRNA 本身可作為疫苗佐劑，其作用機(jī)制是通過刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，從而提高機(jī)體免疫力，大大縮減免疫應(yīng)答時(shí)間，增強(qiáng)產(chǎn)生和釋放抗體的能力，具有極大應(yīng)用價(jià)值。

mRNA 疫苗的主要組成部分是人工合成的mRNA 分子，其由5'端帽、5'非轉(zhuǎn)錄區(qū)、編碼抗原的開放閱讀框、3'UTR 和多腺嘌呤尾5 個(gè)部分組成。mRNA 分子可指導(dǎo)細(xì)胞合成抗原，激發(fā)免疫反應(yīng)。由于mRNA 能夠以快速、直接的方式進(jìn)行反應(yīng)合成，因此mRNA 疫苗在面對(duì)突發(fā)性傳染病流行時(shí)，能夠成為理想的候選疫苗類型[3]。本文從mRNA 疫苗的分類、作用機(jī)制、技術(shù)優(yōu)勢(shì)、遞送系統(tǒng)4 個(gè)方面，對(duì)mRNA 疫苗免疫學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為疫苗研發(fā)人員選擇mRNA 疫苗特異高效遞送系統(tǒng)，降低mRNA 疫苗副反應(yīng)，降低mRNA 疫苗成本，提高mRNA 疫苗穩(wěn)定性等技術(shù)方面提供參考。

1 mRNA 疫苗分類

mRNA 疫苗包括非復(fù)制型mRNA（nonreplicating mRNA）疫苗與自擴(kuò)增型mRNA（selfamplifying mRNA，SAM mRNA）疫 苗[2]。兩 種mRNA 疫苗都可以通過cDNA、線性化質(zhì)粒DNA體外轉(zhuǎn)錄而成，經(jīng)呈遞系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，表達(dá)目的抗原。與非復(fù)制型mRNA 疫苗相比，SAM mRNA 疫苗誘導(dǎo)的抗原產(chǎn)量顯著提升，抗原持續(xù)時(shí)間、免疫應(yīng)答時(shí)間大大延長(zhǎng)。同樣是編碼H1N1 HA 蛋白的mRNA，1.25 μg SAM mRNA 疫苗即可達(dá)到與80 μg 非復(fù)制型mRNA 疫苗相同的效果。非復(fù)制型mRNA 疫苗僅編碼抗原蛋白，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但需要成熟的優(yōu)化工藝才能以較低的劑量誘發(fā)有效的免疫應(yīng)答。SAM mRNA 疫苗利用了病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因，用外源靶蛋白基因（抗原基因）替換病毒的結(jié)構(gòu)基因，因而可以在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增，使其編碼的抗原基因大量表達(dá)，且因結(jié)構(gòu)蛋白基因缺失，使病毒不具有原有的感染性和毒性，具有較好的安全性。

2 mRNA 疫苗技術(shù)優(yōu)勢(shì)

mRNA 疫苗具有諸多優(yōu)勢(shì)：抗原表達(dá)效率高，因無需進(jìn)入細(xì)胞核即可完成翻譯，其翻譯效率是DNA 疫苗的數(shù)倍；安全性高，生產(chǎn)過程中不使用病原及抗生素，且不存在整合進(jìn)入宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)，因而提高了生物安全性；免疫原性強(qiáng)，能夠同時(shí)激活體液免疫與細(xì)胞免疫，滿足抵御各類病原體的需要；可編譯性強(qiáng)，能夠以設(shè)想方式編碼目的抗原，從而實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。當(dāng)機(jī)體接種mRNA 疫苗后，其將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并能夠在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯，從而成功激活體內(nèi)的免疫應(yīng)答。mRNA 疫苗不進(jìn)入細(xì)胞核即可進(jìn)行反應(yīng)，而DNA 疫苗只有到達(dá)細(xì)胞核才能發(fā)揮效果，因此mRNA 疫苗不存在整合機(jī)體基因組的風(fēng)險(xiǎn)，不會(huì)導(dǎo)致基因整合突變，即不存在轉(zhuǎn)基因生物安全風(fēng)險(xiǎn)，理論上比DNA 核酸疫苗安全性更高。同時(shí)，mRNA 疫苗生產(chǎn)不需要用細(xì)菌或細(xì)胞作為培養(yǎng)基，因此病原微生物污染風(fēng)險(xiǎn)較低[4]。mRNA 分子還具有免疫佐劑效用，可以有效激活機(jī)體的免疫應(yīng)答，作為佐劑時(shí)以被Toll樣受體識(shí)別方式來刺激機(jī)體免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生腫瘤壞死因子（TNF-α）和干擾素（IFN-γ）等細(xì)胞因子，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答[4]。mRNA 疫苗的制備生產(chǎn)采用全合成制備技術(shù)，不同品種mRNA 疫苗使用的生產(chǎn)工藝和儀器設(shè)備均是相同的，因此研發(fā)周期較短，成本較低，易于標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；a(chǎn)[5]。此外，在mRNA 疫苗的研發(fā)制備生產(chǎn)過程中，即使發(fā)現(xiàn)或?qū)ふ业叫碌牟≡w抗原蛋白，也不需要調(diào)整規(guī)模化生產(chǎn)過程，不需要更改生產(chǎn)設(shè)施、設(shè)備及其他工藝條件，僅需調(diào)整mRNA 表達(dá)序列，因此mRNA 疫苗的生產(chǎn)具有較高的靈活性和效率[5-8]。

mRNA 疫苗區(qū)別于其他疫苗的另一個(gè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)是其可引發(fā)機(jī)體主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類免疫通路和MHC Ⅱ類免疫通路的呈現(xiàn)，可引發(fā)機(jī)體細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)。mRNA 分子能夠在機(jī)體細(xì)胞質(zhì)中瞬時(shí)表達(dá)抗原蛋白，這些被瞬時(shí)表達(dá)的抗原蛋白大量積聚，被加工成抗原多肽，裝載至MHC Ⅰ類免疫通路中。mRNA 分子也可在MHC Ⅱ類免疫通路中作為抗原蛋白來源，在mRNA 分子瞬時(shí)表達(dá)抗原蛋白分泌和循環(huán)后，直接從細(xì)胞質(zhì)穿梭至溶酶體。此外，機(jī)體細(xì)胞漿中少量的mRNA 分子即可將大量的抗原蛋白遞呈至細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞[9-11]。

3 mRNA 疫苗遞送系統(tǒng)

mRNA 在機(jī)體外的高效合成技術(shù)以及在機(jī)體內(nèi)的高效遞送技術(shù)是現(xiàn)階段開發(fā)和應(yīng)用mRNA 疫苗的兩大核心技術(shù)[12-15]。在體內(nèi)環(huán)境中，mRNA半衰期短、穩(wěn)定性差，直接進(jìn)入機(jī)體容易被體內(nèi)廣泛存在的RNA 酶降解。而合適的載體材料可確保mRNA 疫苗具有極高的穩(wěn)定性和可控的安全性，可將mRNA 高效遞送到機(jī)體細(xì)胞內(nèi)。mRNA 疫苗只有進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中，才能發(fā)揮抗原效應(yīng)，這是其發(fā)揮疫苗關(guān)鍵效力的重要基礎(chǔ)[15]。研究[16]表明，只有小于1 000 Da 的分子才可進(jìn)行被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)運(yùn)一般是在細(xì)胞膜上進(jìn)行。mRNA 相對(duì)分子質(zhì)量較大時(shí)，攜帶負(fù)電荷，且由磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)組成的細(xì)胞膜同樣攜帶負(fù)電荷，因此mRNA 分子可被包裹形成納米微粒，在載體幫助下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

抗原呈遞細(xì)胞將mRNA 分子轉(zhuǎn)運(yùn)至機(jī)體內(nèi)的靶細(xì)胞時(shí)需要避免酶的干擾，避免其發(fā)生降解。mRNA 疫苗成功表達(dá)的關(guān)鍵是避免mRNA 酶的降解，從而保證其完整性。采用納米載體包裹的mRNA 疫苗可通過靜脈注射方式的原因是其能夠很好抵御酶的降解[17-20]。對(duì)于mRNA 疫苗來說，遞送系統(tǒng)的選擇至關(guān)重要。遞送系統(tǒng)分為非靶向遞送系統(tǒng)和靶向遞送系統(tǒng)。非靶向遞送是指運(yùn)輸進(jìn)入機(jī)體的mRNA 非特異性地進(jìn)入各類細(xì)胞或組織，通常使用脂質(zhì)納米顆粒來完成；靶向遞送則是指通過結(jié)合抗體或核酸適配體等方式，將mRNA 靶向遞送到特定的細(xì)胞或組織。

靶向遞送系統(tǒng)主要有抗原抗體特異性結(jié)合和核酸適配體及其受體特異性結(jié)合兩種模式，其原理是在運(yùn)載mRNA 的納米顆粒中加入靶向特定細(xì)胞表面分子的抗體或者核酸適配體，通過抗原-抗體作用或核酸適配體-受體的高親和力結(jié)合，來實(shí)現(xiàn)mRNA 向目的細(xì)胞的特異性運(yùn)輸[21]。非靶向遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)納米顆粒（LNP）、多聚體納米顆粒和蛋白衍生物-mRNA 復(fù)合體。LNP 通常由4個(gè)部分組成，分別是陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)連接的聚乙二醇（PEG）、膽固醇和天然磷脂。陽離子脂質(zhì)能夠與mRNA 一起組裝成病毒大小的顆粒，并協(xié)助mRNA 在細(xì)胞質(zhì)中的釋放；PEG 可延長(zhǎng)制劑的半衰期；膽固醇主要起穩(wěn)定劑的作用；而天然磷脂則構(gòu)建起脂質(zhì)單層結(jié)構(gòu)，將陽離子脂質(zhì)-mRNA 包裹于其中。

脂質(zhì)載體對(duì)mRNA 分子的包封率高，對(duì)機(jī)體細(xì)胞的靶向性強(qiáng)、親和性好，生物相容性高。同時(shí)，有一部分脂質(zhì)載體可以將mRNA 疫苗，以非侵入性方式在機(jī)體內(nèi)進(jìn)行靶向遞送。基于脂質(zhì)載體的遞送系統(tǒng)能夠包裹mRNA 分子，憑借其包封率高的特點(diǎn)，保護(hù)mRNA 分子免受mRNA 酶降解的干擾[5]。目前，能夠進(jìn)行mRNA 疫苗遞送的另外一種非病毒載體材料主要有多聚物、陽離子脂質(zhì)、細(xì)胞穿透肽、樹形分子及其衍生物、陽離子脂質(zhì)聚合納米顆粒、多聚腺苷酸結(jié)合蛋白等。但mRNA 疫苗遞送系統(tǒng)的自身穩(wěn)定性差，對(duì)機(jī)體細(xì)胞有毒副作用，載體對(duì)mRNA 包封率低等一系列問題還有待進(jìn)一步解決[3]。

4 mRNA 疫苗免疫學(xué)機(jī)制

mRNA 疫苗基于“中心法則”，將含有編碼特定抗原的mRNA 序列進(jìn)行優(yōu)化、化學(xué)修飾以及基因純化加工，通過接種進(jìn)入機(jī)體，在機(jī)體細(xì)胞中翻譯產(chǎn)生編碼蛋白，從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，補(bǔ)充接種機(jī)體的蛋白含量，產(chǎn)生機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而預(yù)防傳染病[22]。mRNA 疫苗可經(jīng)MHC Ⅰ類以及MHCⅡ類2 種抗原提呈途徑，引發(fā)體液免疫與細(xì)胞免疫反應(yīng)[23]。mRNA 疫苗經(jīng)注射進(jìn)入機(jī)體后，可被抗原遞呈細(xì)胞捕獲，先啟動(dòng)機(jī)體先天免疫應(yīng)答，后啟動(dòng)機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答，從而全面激活體液免疫與細(xì)胞免疫。mRNA 疫苗可在抗原遞呈細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白，當(dāng)抗原蛋白經(jīng)溶酶體處理為抗原肽后，這些肽段又被MHC 遞呈給CD4+、CD8+T 細(xì)胞或者通過釋放被B 細(xì)胞識(shí)別，從而激活細(xì)胞免疫與體液免疫。mRNA 疫苗在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可模擬病毒感染，從而引起機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫[24]。

不同的RNA 序列可編碼不同的蛋白質(zhì)，因而確定主要抗原蛋白是研發(fā)mRNA 疫苗的核心環(huán)節(jié)[24]。向mRNA 分子中添加修飾過的核苷酸，可提高翻譯效率和自身穩(wěn)定性，延長(zhǎng)半衰期[25]。mRNA 疫苗的接種途徑可分為肌肉注射、皮下注射、靜脈注射、鼻內(nèi)噴霧等不同方式[24]。mRNA疫苗進(jìn)入機(jī)體后，編碼的蛋白質(zhì)將被翻譯并呈遞給免疫系統(tǒng)。該過程類似于RNA 病毒感染的自然過程及其連續(xù)誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。外源 mRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后會(huì)發(fā)生與內(nèi)源性mRNA相似的反應(yīng)。mRNA 在細(xì)胞質(zhì)中被翻譯成蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)經(jīng)過翻譯后修飾，通過靶向序列或跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)入亞細(xì)胞間隔，比如分泌途徑、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、線粒體或過氧化物酶體。體外轉(zhuǎn)錄后再加帽、加尾是mRNA 疫苗公認(rèn)的生產(chǎn)方法[26-28]。它類似于真核細(xì)胞胞漿中自然加工和成熟的mRNA。當(dāng)被接種疫苗部位的細(xì)胞吸收后，mRNA 被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)；接著，通過核糖體合成 mRNA 編碼的蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行翻譯后修飾，產(chǎn)生正確折疊的功能蛋白質(zhì)。mRNA 疫苗可以使其編碼的蛋白或肽瞬時(shí)表達(dá)，并持續(xù)幾天或幾周，使得 mRNA 更容易被控制。不同的接種途徑對(duì)于mRNA 接觸的細(xì)胞類型和激發(fā)免疫應(yīng)答的能力起著重要作用，相對(duì)于皮下注射，未經(jīng)修飾的裸mRNA 疫苗經(jīng)淋巴結(jié)注射，其誘導(dǎo)T 細(xì)胞免疫的效力可以大幅度增高[29-30]。

5 討論

mRNA 疫苗集眾多優(yōu)點(diǎn)于一身，如安全性高、免疫原性強(qiáng)、可編譯性強(qiáng)、設(shè)計(jì)速度快、產(chǎn)量大、成本低、易于儲(chǔ)存等，在新冠疫情防控中被視作一種革命性的疫苗技術(shù)[31-32]。自新冠疫情暴發(fā)以來，英國(guó)緊急批準(zhǔn)使用輝瑞和BioNTech 公司聯(lián)合研發(fā)的mRNA 疫苗（BNT162b2），從而成為首個(gè)批準(zhǔn)緊急使用mRNA 疫苗的國(guó)家；美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了針對(duì)新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的mRNA 疫苗，臨床試驗(yàn)證明，mRNA 疫苗具有良好的安全性和有效性[33-36]。除疫病防控外，mRNA 疫苗正在被越來越多地用于醫(yī)療領(lǐng)域，如腫瘤、罕見疾病的治療等。

mRNA 是一個(gè)包含負(fù)電荷的大分子，它無法穿過由陰離子脂質(zhì)構(gòu)成的細(xì)胞膜，而且在體內(nèi)，它會(huì)被先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞吞噬，或者被核酸酶降解，因此需要?jiǎng)?chuàng)新遞送載體[37-42]。在保證安全性的前提下，為將mRNA 疫苗更好地應(yīng)用于臨床，聚焦于進(jìn)一步增強(qiáng)mRNA 疫苗穩(wěn)定性，適當(dāng)降低mRNA疫苗過高的免疫原性，優(yōu)化和完善其遞送系統(tǒng)[43]。隨著mRNA 技術(shù)和LNP 遞送技術(shù)的不斷完善，這一新型疫苗技術(shù)將有助于解決傳統(tǒng)小分子和抗體療法無法解決的問題，為癌癥、罕見疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等疾病提供更有效、更持久的治療技術(shù)選擇。相信mRNA疫苗技術(shù)將會(huì)具有更廣泛的適用空間，成為人類對(duì)抗眾多疾病的有力武器。