莊柯瑾 ，李佳鈺 ，周榮榮 ，梁得福 ，張東杰 ，3，4

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品及加工品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心；3.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室；4.國家雜糧工程技術(shù)研究中心）

豌豆是我國最重要的雜豆品種之一，據(jù)統(tǒng)計，豌豆被種植于84 個不同的國家，其總產(chǎn)量可達到全球雜豆類總產(chǎn)量的36%[1]。豌豆營養(yǎng)成分豐富，其中碳水化合物含量和蛋白質(zhì)含量較高，脂肪含量較低，此外還含有豐富的維生素和礦物質(zhì)[2]。豌豆的淀粉含量相對較高，因此傳統(tǒng)的豌豆制品多以淀粉類食品及其相關(guān)產(chǎn)品為主。豌豆纖維也可以作為較好的日糧營養(yǎng)素，有研究表明豌豆纖維可以通過調(diào)節(jié)血糖應(yīng)答、脂質(zhì)代謝和腸道代謝等方式改善機體健康[3]。豌豆蛋白是一種相對新穎的植物蛋白，其必需氨基酸含量相對較高、致敏性較低，同時還可以預(yù)防心血管疾病。此外，豌豆的氨基酸組成符合FAO/WHO 推薦的氨基酸攝入標準，被認為是優(yōu)質(zhì)的蛋白來源，近年來已被應(yīng)用于功能性食品中，有很好的應(yīng)用前景和利用價值[4]。

熱處理（蒸制或煮制）是最常見的食品加工方式，也是最常用的蛋白質(zhì)改性的方法之一。熱處理過程會對食品的營養(yǎng)成分及功能性質(zhì)產(chǎn)生不同程度的影響。熱處理不僅可以減少豆腥味、提高豆類消化率，還可以鈍化一些抗營養(yǎng)因子[5]。作為重要的營養(yǎng)成分，熱處理后蛋白質(zhì)的理化特性變化備受關(guān)注。目前，國內(nèi)外學(xué)者對豌豆蛋白的研究主要集中在提取制備和應(yīng)用方面[6-9]，但很少有針對熱處理對豌豆蛋白影響方面的研究。

日常食用豌豆過程中，熱處理是不可缺少的烹飪流程，豌豆經(jīng)過熱處理后一定會伴隨著蛋白的變性，進而對豌豆蛋白的功能性質(zhì)和消化性能產(chǎn)生的影響，此外熱處理還可能會對豌豆中淀粉和膳食纖維含量的測定產(chǎn)生影響。因此，對豌豆進行蒸制和煮制熱處理，分析這兩種熱處理方式對脫脂豌豆粉的功能性質(zhì)及體外消化性能的影響，同時將熱處理的試驗結(jié)果與未經(jīng)過熱處理的結(jié)果進行對比分析，找出適合的豌豆熱處理方式，為豌豆的精深加工和在食品行業(yè)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

試驗所用豌豆種子為黑龍江主栽豌豆品種，購于瑞澤豐農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司。

試驗所使用的試劑包括 KH2PO4、NaHCO3、NaCl、MgCl2·6H2O、（NH4）2CO3、NaOH、HCl、CaCl2·2H2O 和石油醚（沸點60~90 ℃），均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

試驗所使用的酶包括豬胰蛋白酶（1∶2 500）、豬胃蛋白酶（1∶30 000）和豬胰凝乳蛋白酶（1∶1 500），均購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

試驗所使用的儀器設(shè)備均列于表1。

表1 試驗儀器設(shè)備Table 1 Instruments and equipment used in the experiment

1.3 試驗方法

1.3.1 豌豆熱處理

豌豆熱處理參考李金華[10]的試驗方法略作修改。取80 g 清洗干凈的豌豆，在蒸餾水中浸泡1 h 后進行30 min 蒸制處理；另取等量清洗干凈的豌豆，以1∶3 的比例加入蒸餾水，浸泡 1 h 后進行 30 min 煮制處理；蒸制和煮制處理后的豌豆均達到食用要求。

1.3.2 脫脂豌豆粉的制備

將蒸制和煮制處理后的豌豆平鋪于托盤上，同時稱取等量未經(jīng)過熱處理的豌豆，將上述三組樣品同時放入鼓風(fēng)干燥箱中，于40 ℃下烘干12 h。隨后將三組干燥后的豌豆分別放置于高速粉碎機中進行粉碎處理，處理后的豌豆粉轉(zhuǎn)移至燒杯中，按1∶5（m/V）的比例加入石油醚進行脫脂，待明顯分層后，將石油醚倒入回收瓶中，重復(fù)上述步驟進行第二次脫脂。將脫脂后的三組豌豆粉放入通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干待用。

1.3.3 脫脂豌豆粉淀粉含量的測定

脫脂豌豆粉淀粉含量的測定參考于翠翠[11]的試驗方法略有改動。分別稱取1.3.2 中未處理、蒸制處理和煮制處理的脫脂豌豆粉，按1∶20（m/V）的比例加入蒸餾水，放入磁力攪拌器中攪拌36 h 后進行離心（4 000 r·min-1，10 min），除去上清液后將得到的沉淀用蒸餾水沖洗2 次，隨后將沉淀倒入平皿中，放置于鼓風(fēng)干燥箱中，于40℃下烘干12 h。

1.3.4 脫脂豌豆粉膳食纖維含量的測定

分別稱取1.3.2 中未處理、蒸制處理和煮制處理的脫脂豌豆粉1 g（精確至0.01 g），按照GB 5009.88-2014（食品安全國家標準-食品中膳食纖維的測定）[12]對上述三種不同處理方式下脫脂豌豆粉的膳食纖維含量進行測定。

1.3.5 脫脂豌豆粉蛋白含量的測定

分別稱取1.3.2 中未處理、蒸制處理和煮制處理的脫脂豌豆粉1 g（精確至0.01 g），按照GB 5009.05-2016（食品安全國家標準-食品中蛋白質(zhì)的測定）[13]中凱氏定氮法對上述三種不同處理方式下脫脂豌豆粉的蛋白質(zhì)含量進行測定。

1.3.6 脫脂豌豆粉蛋白溶解性的測定

脫脂豌豆粉蛋白溶解性的測定參考李曉明[14]的試驗方法略有改動。分別稱取1.3.2 中未加熱、蒸制處理和煮制處理的豌豆粉1.25 g（各7 份，精確至0.001 g）至三角瓶中，加入25 mL 磷酸鹽緩沖溶液，用 HCl/NaOH 將溶液 pH 值分別調(diào)至 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，用磁力攪拌器對溶液攪拌 1 h 后進行離心（4 000 r·min-1，15 min），取上清液，按照GB 5009.05-2016 凱氏定氮法[12]對上清液中蛋白質(zhì)含量進行測定。溶解性指數(shù)用NSI（%）表示，計算公式如下：

1.3.7 脫脂豌豆粉蛋白乳化性能的測定

脫脂豌豆粉蛋白的乳化性能包括乳化性和乳化穩(wěn)定性，參照張舒[15]的試驗方法略有改動。為考察熱處理方式和蛋白濃度對脫脂豌豆粉蛋白乳化性能的影響，稱取1.3.2 中未加熱、蒸制處理和煮制處理的豌豆粉各 4 份（0.3、0.9、1.5、2.1 g，精確至 0.01 g），分別溶于30 mL 蒸餾水中，得到質(zhì)量濃度為1%、3%、5%、7%的溶液，用高剪切分散乳化機均質(zhì)30 s，加入5 mL 花生油，均質(zhì) 90 s，快速記錄乳濁液的體積，離心（3 000 r·min-1，5 min）后快速記錄乳化層體積。隨后在85 ℃水浴條件下保溫20 min，冷卻至室溫后離心（3 000 r·min-1，5 min），重新記錄加熱后乳化層體積。乳化性EA（%）和乳化穩(wěn)定性ES（%）的計算公式如下：

式中，V1代表均質(zhì)后乳濁液的體積（mL）；V2代表離心后乳化層的體積（mL）；V3代表加熱后乳化層的體積（mL）。

1.3.8 脫脂豌豆粉蛋白起泡性能的測定

脫脂豌豆粉蛋白的起泡性能包括起泡性和起泡穩(wěn)定性，參照Mirmoghtadaie 的試驗方法略有改動[16]。為考察熱處理方式和蛋白濃度對脫脂豌豆粉蛋白起泡性能的影響，分別稱取1.3.2 中未加熱、蒸制處理和煮制處理的豌豆粉各 5 份（1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 g，精確至0.01 g），分別溶于100 mL 蒸餾水中，得到質(zhì)量濃度為1%、3%、5%、7%、9%的懸浮液，吸取5 mL配制好的懸浮液放置于離心管中，用高速分散機均質(zhì)2 min，記錄泡沫體積，隨后記錄樣品靜置20 min后的體積變化。起泡性FC（%）和起泡穩(wěn)定性FS（%）的計算公式如下：

式中V1代表攪打前的蛋白溶液體積（mL）；V2代表攪打后的蛋白溶液體積（mL）；V3代表攪打后的泡沫體積（mL）；V4代表靜置 20 min 后的泡沫體積（mL）。

1.3.9 脫脂豌豆粉蛋白體外消化性能測定

參考Brodkorb[17]的試驗方法對脫脂豌豆粉蛋白體外消化性能進行測定，具體試驗步驟如下：

（1）模擬液的制備

①口腔模擬液（SSF） 由 15.1 mL KCl、3.7 mL KH2PO4、6.8 mL NaHCO3、0.5 mL MgCl（2H2O）6、0.06 mL（NH4）2CO3、0.09 mL HCl 組成。

②胃模擬液（SGF）由 0.9 mL KH2PO4、6.9 mL KCl、12.5 mL NaHCO3、11.8 mL NaCl、0.4 mL MgCl（2H2O）6、0.5 mL（NH4）2CO3、1.3 mL HCl 組成。

③腸模擬液（SIF）由 6.8 mL KCl、0.8 mL KH2PO4、42.5 mL NaHCO3、9.6 mL NaCl、1.1 mL MgCl（2H2O）6、0.7 mL HCl 組成。

（2）消化試驗步驟

①模擬口腔消化：稱取0.5 g（精確至0.001 g）凍干得到的豌豆蛋白，加入5 mL 去離子水，將其與4.0 mL SSF、25 μL CaCl2（H2O）2和 975 μL 去離子水組成的模擬口腔液等體積混合，用HCl/NaOH 溶液將混合液pH 值調(diào)至7.0，將樣品放入全溫振蕩器中，于37 ℃下消化2 min。

②模擬胃部消化：將步驟①得到的口腔消化液（10 mL）與含 7.5 mL SGF、5 μL CaC1（H2O）2、0.2 mL HCl和695 μL 去離子水的模擬胃液等體積混合，隨后加入1.6 mL 胃蛋白酶，用HCl 溶液將混合液pH 值調(diào)為3.0，將樣品放入全溫振蕩器中，于37 ℃下消化2 h。

③模擬腸道消化：等步驟②得到的胃部消化液（20 mL） 與 含 11 mL SIF、40 μL CaC12（H2O）2、0.15 mL NaOH 和1.31 mL 去離子水組成的模擬腸液等體積混合，加5 mL 胰蛋白酶和2.5 mL 胰凝乳蛋白酶，用HCl/NaOH 溶液將混合液pH 值調(diào)至7.0，將樣品放入全溫振蕩器中，于37 ℃下消化2 h。樣品從全溫振蕩器取出后，即刻將消化液置于0 ℃下滅酶30 min，隨后將滅酶后的消化液離心（10 000×g，20 min），取上清液進行冷凍干燥，即得到消化產(chǎn)物。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗重復(fù)3 次，試驗結(jié)果以平均值±標準差表示，采用SPSS 20.0 對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和 Duncan’s 檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方式下測得的脫脂豌豆粉淀粉、膳食纖維及蛋白含量

不同處理方式下測得的脫脂豌豆粉淀粉、膳食纖維及蛋白含量見表2。由表可知，雖然未加熱處理測得的淀粉、膳食纖維和蛋白含量略高于蒸制和煮制處理后測得的含量，但不同處理方式下測得的這三種營養(yǎng)成分含量之間并沒有顯著差異（P≥0.05），這說明熱處理并沒有對脫脂豌豆粉的淀粉、膳食纖維及蛋白含量產(chǎn)生影響。

表2 不同處理方式下測得的脫脂豌豆粉淀粉、膳食纖維及蛋白含量Table 2 Protein content of defatted pea flour measured under different treatments

2.2 不同處理方式對脂豌豆粉蛋白功能性質(zhì)的影響

2.2.1 不同處理方式對脫脂豌豆粉蛋白溶解性的影響

由圖1 可以看出，不同處理方式下脫脂豌豆粉的蛋白溶解度隨溶液pH 值的增加呈上升趨勢，豌豆蛋白的等電點在4.0 左右，當(dāng)?shù)鞍兹芤旱膒H 值接近等電點時，溶解性最低。且圖中顯示，蒸制和煮制加熱處理均會使脫脂豌豆粉的蛋白溶解性增加，其中蒸制處理的效果更加明顯。有研究表明，熱處理可以顯著提高豆類蛋白的溶解性[18]。且隨著熱處理溫度的增加，蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。加熱后蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開、基團暴露，這是溶解性增加的主要原因[19]。

圖1 不同處理方式下脫脂豌豆粉的蛋白溶解性Fig.1 Protein solubility of defatted pea flour in different treatments

齊寶坤的研究結(jié)果表明，80 ℃的熱處理溫度并不會增加蛋白溶解性，因為這時蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，這樣的變化會導(dǎo)致溶解度降低。若將加熱溫度升高至100 ℃時，其溶解性會有所增加，這是因為在更高的溫度下，蛋白質(zhì)的α-螺旋含量增加，β-折疊含量下降[20]。而當(dāng)受熱溫度過高時，會形成較大的蛋白顆粒聚集體，且熱處理溫度越高，蛋白聚集體尺寸更大，反而會降低蛋白質(zhì)的溶解性，這也是試驗中煮制熱處理組脫脂豌豆粉的蛋白溶解性低于蒸制熱處理組的主要原因[21]。

2.2.2 不同處理方式對脫脂豌豆粉蛋白乳化性能的影響

蛋白質(zhì)由于同時具有疏水基團和親水基團而具有乳化性。熱處理會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進而改變其乳化性能。除熱處理溫度外，蛋白濃度也會對蛋白質(zhì)的乳化性產(chǎn)生影響。由圖2 可以看出，三種處理方式下蛋白質(zhì)的乳化性均隨著蛋白濃度的增加不斷增加。但也有研究結(jié)果顯示，當(dāng)大豆分離蛋白的濃度小于10%時，經(jīng)過短時間熱處理后，蛋白質(zhì)的乳化性有很大程度提高，而當(dāng)將大豆分離蛋白濃度增加至10%后，短時間熱處理反而降低了其乳化性。可能是由于過高的蛋白濃度反而更容易形成蛋白聚集體，從而會降低蛋白質(zhì)的乳化性[22-23]。

圖2 不同處理方式下脫脂豌豆粉的蛋白乳化性Fig.2 Protein emulsibility of defatted pea flour in different treatments

從圖2 中還可以看出，與未處理組相比，所有蛋白濃度下熱處理后的豌豆蛋白乳化能力均顯著增加（P＜0.05），特別是蒸制熱處理使乳化性增加程度更加明顯。這是因為隨著溫度的增加，豌豆蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如疏水相互作用和二硫鍵等非共價鍵被破壞，蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團被暴露[24]，使得油-水界面處的蛋白吸附能力增強，進而增加了豌豆蛋白的乳化性[25]。蒸制熱處理是豌豆與水蒸氣直接接觸的過程，而煮制熱處理是豌豆與水直接接觸的過程，因此受熱溫度更高，而過高的熱處理溫度會導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)進一步展開，此時蛋白之間可能形成了分子聚集體，這使得蛋白表面疏水性減弱，降低了油-水界面的穩(wěn)定性，導(dǎo)致其乳化性和蒸制處理的豌豆蛋白相比有所降低[18]。

不同處理方式下脫脂豌豆粉的蛋白乳化穩(wěn)定性也隨蛋白濃度的增加而增加（圖3），這是由于當(dāng)?shù)鞍诐舛仍黾訒r，油-水界面的吸附層由單分子層變成多分子層，此時的界面膜會比低蛋白濃度時形成的界面膜更加緊密，且具有更高的強度，因此會使乳化穩(wěn)定性增強。相同蛋白濃度下，蒸制處理后蛋白的乳化穩(wěn)定性顯著高于煮制處理組（P＜0.05），且這兩種熱處理組的乳化穩(wěn)定性均顯著高于未處理組（P＜0.05），這與張舒[14]對綠豆蛋白乳化穩(wěn)定性的研究結(jié)果相同。有研究表明，蛋白質(zhì)的乳化性和乳化穩(wěn)定性與溶解性之間存在正相關(guān)性[26]，這也與試驗得出的分析結(jié)果相同。與蒸制熱處理相比，豌豆煮制過程中受熱溫度過高，此時分子運動更急劇烈，分子之間相互接觸的幾率更大，因此使乳化穩(wěn)定性有所降低[27-28]。

圖3 不同處理方式下脫脂豌豆粉的蛋白乳化穩(wěn)定性Fig.3 Protein emulsion stability of defatted pea flour in different treatments

2.2.3 不同處理方式對脫脂豌豆粉蛋白起泡性能的影響

蛋白的起泡性能包括起泡性和起泡穩(wěn)定性。起泡性是指蛋白質(zhì)的攪打起泡能力，是由于蛋白質(zhì)的存在降低了氣-液界面張力而導(dǎo)致泡沫形成的能力；起泡穩(wěn)定性是指蛋白起泡后保持穩(wěn)定的能力。蛋白質(zhì)的起泡能力是衡量其是否能夠作為奶油、冰激淋或蛋糕等泡沫型食品原材料的主要考慮因素[29]。

圖4 為不同處理方式下脫脂豌豆粉的蛋白起泡性，由圖可知，三種處理方式下蛋白的起泡性均隨著蛋白濃度的增加而增強，這是因為蛋白濃度越高，溶液粘度越大，較大的粘度有助于在界面形成蛋白膜，有利于起泡性的增強[30]。圖5 為不同處理方式下脫脂豌豆粉的蛋白起泡穩(wěn)定性，可以看出，隨著蛋白濃度的增加，蛋白的起泡穩(wěn)定性也呈增加趨勢，這是由于蛋白含量的增加使蛋白之間形成了更加穩(wěn)固的吸附膜，有助于泡沫穩(wěn)定。從圖4 和圖5 中可以看出，蒸制組脫脂豌豆粉的蛋白起泡性能均顯著優(yōu)于煮制處理組，這是由于煮制處理過程中，過高的溫度使蛋白質(zhì)形成了更大的分子聚集體，使氣-液界面形成蛋白膜的穩(wěn)定性有所下降。

圖4 不同處理方式下脫脂豌豆粉的蛋白起泡性Fig.4 Protein foaming capacity of defatted pea flour in different treatments

圖5 不同處理方式下脫脂豌豆粉的蛋白起泡穩(wěn)定性Fig.5 Protein foam stability of defatted pea flour in different treatments

2.3 不同處理方式對脫脂豌豆粉蛋白體外消化性能的影響

不同處理方式下脫脂豌豆粉的蛋白體外消化率如圖6 所示，可以看出，三種處理方式下脫脂豌豆粉的蛋白體外消化率之間存在差異，這與白明昧[31]對大豆蛋白的研究結(jié)果一致。未加熱處理、蒸制處理和煮制處理的脫脂豌豆粉蛋白體外消化率分別為71.43±0.23%、84.82±0.17%和71.76±0.30%。與未加熱處理組相比，蒸制處理組蛋白的體外消化率顯著增加了18.75%（P＜0.05），煮制處理組蛋白的體外消化率略高于未加熱組，但兩組之間并沒有存在顯著差異（P≥0.05）。

圖6 不同處理方式下脫脂豌豆粉的蛋白體外消化率Fig.6 Protein in vitro digestibility of defatted pea flour under different treatments

三組處理方式下消化率存在差異的原因可能是由于熱處理后豌豆蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度改變。熱處理會使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使蛋白暴露出更多的酶切位點，進而增加了蛋白消化率。蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與其體外消化率密切相關(guān)，有研究表明，熱處理后蛋白質(zhì)的α-螺旋含量增加，β-折疊含量下降[32]，且蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量與體外消化率呈正相關(guān)，β-折疊含量與體外消化率呈負相關(guān)[31]，這與試驗的研究結(jié)果相同。而煮制加熱由于豌豆受熱溫度過高，導(dǎo)致蛋白大量聚集，延長了酶消化時間，進而使相同時間下脫脂豌豆粉的蛋白消化率降低[33]。

3 結(jié)論

熱處理對脫脂豌豆粉的淀粉、纖維素和蛋白含量沒有顯著影響，但是會顯著影響脫脂豌豆粉的蛋白功能性質(zhì)和體外消化性能。熱處理后，脫脂豌豆粉的蛋白溶解性顯著增加，且乳化性和乳化穩(wěn)定性也呈現(xiàn)顯著的增加趨勢，同時脫脂豌豆粉的蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性也顯著增加。與煮制熱處理相比，蒸制熱處理對脫脂豌豆粉蛋白的功能性質(zhì)的改變更加明顯。此外，蒸制熱處理后，脫脂豌豆粉蛋白的體外消化率顯著高于未處理組和煮制處理組。綜上，蒸制熱處理方式更有利于改善脫脂豌豆粉的蛋白功能性質(zhì)及體外消化吸收功能。接下來我們會進一步分析熱處理對脫脂豌豆粉蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化，進一步確定熱處理引起其功能性質(zhì)變化的主要原因。