孫曉瑩，李國(guó)軍，王延濤，侯喜林

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.上海邁邦生物科技有限公司）

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）感染幼犬引起的一種急性傳染病，以劇烈的嘔吐、出血性腸炎和白細(xì)胞顯著減少以及心肌炎為主要特征，是危害我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一，可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體在疾病診斷，治療和預(yù)防方面的應(yīng)用日益廣泛，使得大規(guī)模培養(yǎng)包括雜交瘤細(xì)胞在內(nèi)的動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體變得十分必要[3-5]。而動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，在懸浮培養(yǎng)條件下，對(duì)環(huán)境變化和剪切力敏感[6]。在搖瓶或生物反應(yīng)器等容器中體外懸浮培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，容器內(nèi)的攪拌和搖晃會(huì)產(chǎn)生剪切力以及培養(yǎng)液出現(xiàn)氣泡，這些均會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損害。細(xì)胞培養(yǎng)最適的pH 值隨培養(yǎng)的細(xì)胞種類不同而不同，大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH 值為7.0～7.4，偏離此范圍可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)將產(chǎn)生有害的影響[7]。

細(xì)胞培養(yǎng)基提供細(xì)胞賴以生存的環(huán)境，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加等，對(duì)于改善細(xì)胞代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、提高抗體表達(dá)水平等均至關(guān)重要[8-10]。在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用最廣泛的剪切保護(hù)劑之一是泊洛沙姆188（Poloxamer 188，P188），以商業(yè)名稱如 Pluronic F-68、Kolliphor? P188 和 SynperonicTM等[11]被人所知。細(xì)胞培養(yǎng)基pH 的維持依靠一種或多種緩沖體系，最常見的包括NaHCO3-CO2、磷酸鹽和HEPES 等，血清也可以作為完全培養(yǎng)基的緩沖液。哺乳動(dòng)物細(xì)胞多數(shù)利用NaHCO3-CO2作為培養(yǎng)基中的緩沖體系，氣相中的CO2濃度應(yīng)與培養(yǎng)液中NaHCO3濃度相對(duì)應(yīng)，如氣相或培養(yǎng)箱空氣中CO2濃度設(shè)定在5%，培養(yǎng)液中NaHCO3的加入量應(yīng)為1.97 g·L-1[12]。然而緩沖體系僅為NaHCO3-CO2的培養(yǎng)基，pH 值非常不穩(wěn)定，培養(yǎng)基儲(chǔ)存或暴露一定時(shí)間后容易偏堿。而HEPES 可以防止暴露于空氣中的培養(yǎng)基的pH 迅速變動(dòng)，能較長(zhǎng)時(shí)間控制pH 在恒定范圍內(nèi)[13]。

通過在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗剪切力的表面活性劑及緩沖物，來(lái)研究培養(yǎng)液中剪切保護(hù)（P188）、緩沖物（HEPES 和 NaHCO3）對(duì) CPV ID3 細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

細(xì)胞株名稱為CPV ID3，屬于雜交瘤細(xì)胞株，能夠穩(wěn)定分泌抗犬細(xì)小病毒單克隆抗體，由哈爾濱元亨生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑

無(wú)血清培養(yǎng)基干粉（不含P188、HEPES 和NaHCO3），源自上海邁邦生物；P188，購(gòu)自 BASF；HEPES，購(gòu)自 SIGMA；NaHCO3、NaOH，國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 配制無(wú)P188，含2 g·L-1NaHCO3的無(wú)血清培養(yǎng)基原液

稱取配制液體培養(yǎng)基終體積70%的超純水（18～25 ℃）于指定容器內(nèi)，緩慢加入培養(yǎng)基干粉，攪拌30 min 直至干粉全部溶解成為混懸液；按照2 g·L-1的量加入NaHCO3粉末，攪拌10 min 直至完全溶解；使用5 mol·L-1NaOH 溶液調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基的pH 值至6.9～7.2；定容至液體培養(yǎng)基終體積的80%，繼續(xù)攪拌 10 min；用 0.22 μm 濾器過濾除菌，2～8 ℃避光儲(chǔ)存，備用。

1.2.2 配制含 1.0 g·L-1P188，無(wú) HEPES 和 1.5 g·L-1NaHCO3的無(wú)血清培養(yǎng)基原液

稱取配制液體培養(yǎng)基終體積70%的超純水（18～25 ℃）于指定容器內(nèi)，緩慢加入培養(yǎng)基干粉，攪拌30 min 直至干粉全部溶解成為混懸液；加入1.0 g·L-1的P188，1.5 g·L-1的碳酸氫鈉粉末，繼續(xù)攪拌10 min直至完全溶解；使用5 mol·L-1NaOH 溶液調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基的的pH 值至6.9～7.2。定容至液體培養(yǎng)基終體積的90%，繼續(xù)攪拌10 min；用0.22 μm 濾器過濾除菌，2～8 ℃避光儲(chǔ)存，備用。

1.2.3 配制添加劑的濃縮液

100 g·L-1P188，7.5% NaHCO3，5 mol·L-1NaOH，1 mol·L-1HEPES，超純水，以上試劑均需用 0.22 μm濾膜，過濾除菌之后再使用。

1.2.4 研究P188 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

按 1.2.1 方法配制培養(yǎng)原液，設(shè) 1、3、6、9、12、15 g·L-16 個(gè)P188 添加濃度，確保培養(yǎng)基其它成分濃度一致，測(cè)定 pH 和滲透壓，pH 值在 pH 7.2～7.4 之間。

表1 含不同P188 濃度的培養(yǎng)基測(cè)試方案Table 1 Test protocol and osmotic pressure of culture media containing different concentrations of P188

1.2.5 研究NaHCO3、HEPES 對(duì)雜交瘤細(xì)胞影響

按 1.2.2 方法配制培養(yǎng)基原液，設(shè) 1.5、2.0、2.5 g·L-1三個(gè)NaHCO3添加濃度，在每個(gè)NaHCO3添加濃度下再設(shè)四個(gè) HEPES 添加濃度，分別是 0、10、20、25 mmol·L-1的，確保培養(yǎng)基其它成分濃度一致，測(cè)定pH 和滲透壓，pH 值在 7.2～7.4 之間。

表2 含不同NaHCO3 和HEPES 濃度的培養(yǎng)基測(cè)試方案及其滲透壓Table 2 Test protocol and osmotic pressure of culture media containing different concentrations of NaHCO3 and HEPES

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)

采用批次培養(yǎng)方式，種子細(xì)胞液1 000 rpm，離心3 min，棄上清，使用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀接種于125 mL 搖瓶?jī)?nèi)，工作體積30 mL，接種密度0.5×106cells·mL-1，于 5% CO2，36.5 ℃，120 rpm 的搖床內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.7 檢測(cè)方法

培養(yǎng)過程中，每隔24 h 從搖瓶中取200 μL 樣品，檢測(cè)細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、乳酸濃度。使用Counstar 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀來(lái)檢測(cè)細(xì)胞密度和細(xì)胞活率；使用SBA-40E 型葡萄糖-乳酸分析儀檢測(cè)乳酸的濃度。

1.2.8 蛋白表達(dá)量的測(cè)定

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，將樣品于12 000 rpm，離心10 min 后，取上清于-20 ℃凍存。根據(jù) IgG 的 Fc 片段與Protein A 特異性結(jié)合原理，使用HPLC 于280 nm下對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，采用外標(biāo)法對(duì)樣品的抗體表達(dá)量進(jìn)行定量。

1.2.9 計(jì)算方法

μ 為細(xì)胞生長(zhǎng)速率 （d-1），XV為活細(xì)胞密度（106cells·mL-1），t 為培養(yǎng)時(shí)間（d）。

1.2.10 培養(yǎng)基質(zhì)量的評(píng)價(jià)

根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)過程中活細(xì)胞密度、細(xì)胞活率，繪制雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長(zhǎng)速率；測(cè)定培養(yǎng)結(jié)束后收獲樣品中的抗體總表達(dá)量。根據(jù)以上的數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)價(jià)各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPV ID3 細(xì)胞株在含不同濃度P188 的培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)

圖1 結(jié)果顯示No.2 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在接種后第3 天達(dá)到最大活細(xì)胞密度，然后直接開始下降，平臺(tái)期不明顯；No.1、No.3、No.4、No.5、No.6 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均在第3 天達(dá)到最大活細(xì)胞密度，之后存在一個(gè)明顯的平臺(tái)期（第3～4 天），第4 天活細(xì)胞密度開始明顯下降；No.7實(shí)驗(yàn)組的平臺(tái)期為第3～4 天，在第4 天達(dá)到最大活細(xì)胞密度，說明隨著培養(yǎng)基中的P188 含量的增加，細(xì)胞達(dá)到最高活細(xì)胞密度所需的時(shí)間越長(zhǎng)。

圖1 不同P188 濃度的培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of cells in medium with different P188 concentrations

表3 結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)基中P188 濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)速率越小，第5 天收獲時(shí)的細(xì)胞活率越高，說明培養(yǎng)基中P188 濃度越高，細(xì)胞高密度維持時(shí)間越長(zhǎng)。與不含P188 的培養(yǎng)基No.1 對(duì)照組相比，5天內(nèi)No.2~No.7 實(shí)驗(yàn)組抗體表達(dá)量分別提高了3.15%、9.53%、16.54%、19.54%、24.65%、25.08%，說明隨著培養(yǎng)基中P188 濃度的增加，抗體表達(dá)量越高，其中No.6 和No.7 實(shí)驗(yàn)組的抗體表達(dá)量最高。與No.1 對(duì)照組相比，No.2~No.7 實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯提高，均在0.84~0.9 d-1之間，與No.2 實(shí)驗(yàn)組相比，No.3 與No.7 組，細(xì)胞生長(zhǎng)速率隨著培養(yǎng)基中P188 濃度的增加，逐漸降低。此外，培養(yǎng)基中P188 濃度為1g·L-1時(shí)，最高活細(xì)胞密度最大，細(xì)胞生長(zhǎng)速率值最大。

表3 不同P188 濃度的培養(yǎng)基中細(xì)胞批式培養(yǎng)過程的主要參數(shù)比較Table 3 Comparison of the main parameters in batch culture of cells in medium containing different P188 concentrations

2.2 CPV ID3 細(xì)胞株在不同濃度的NaHCO3 和HEPES 環(huán)境中的生長(zhǎng)表現(xiàn)

圖2（a）所示為細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示細(xì)胞在接種后的24 h 內(nèi)有一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)延遲期，然后進(jìn)入細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第3～4 天為平臺(tái)期，最大活細(xì)胞密度均在接種第4 天達(dá)到最大值，第5 天細(xì)胞活率開始下降。圖2（b）所示為細(xì)胞在不同濃度的NaHCO3和HEPES 培養(yǎng)基中的乳酸積累量變化曲線，結(jié)果顯示在培養(yǎng)過程中，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，乳酸不斷積累，乳酸累積量在第2 天基本達(dá)到最大值，第3、第4 天略有增長(zhǎng)，第 5 天開始下降，其中第 2 天 No.8～No.11 實(shí)驗(yàn)組的乳酸含量平均值為17.8 mM，No.12～No.15 實(shí)驗(yàn)組的乳酸含量平均值為22.5 mM，No.16～No.19 實(shí)驗(yàn)組的乳酸含量平均值為27 mM，說明實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中NaHCO3濃度越高，細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乳酸的增長(zhǎng)速率越快，乳酸累積值越高。

圖2 不同濃度NaHCO3 和HEPES 培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線和乳酸積累曲線（a）生長(zhǎng)曲線（b）乳酸積累曲線Fig.2 The growth curve and lactic acid accumulation curve of cells in different NaHCO3 and HEPES concentration medium（a）growth curve（b）lactic acid accumulation curve

表4 結(jié)果顯示對(duì)于培養(yǎng)基中NaHCO3濃度的研究，從細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)方面來(lái)看，隨著培養(yǎng)基中NaHCO3濃度越高，細(xì)胞的最高活細(xì)胞密度和細(xì)胞生長(zhǎng)速率越高、收獲時(shí)的細(xì)胞活率越低；從抗體表達(dá)量方面來(lái)看，培養(yǎng)基中NaHCO3含量越高，細(xì)胞生長(zhǎng)速率越大，細(xì)胞密度維持時(shí)間越短，抗體表達(dá)量越低。對(duì)于培養(yǎng)基中HEPES 濃度的研究，從細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)方面來(lái)看，培養(yǎng)基中NaHCO3濃度一定時(shí)，HEPES 濃度越高，蛋白表達(dá)量越高。

表4 不同濃度NaHCO3 和HEPES 培養(yǎng)基中細(xì)胞批式培養(yǎng)過程的主要參數(shù)比較Table 4 Comparison of the main parameters in batch culture of cells in medium containing different NaHCO3 and HEPES concentration

3 討論

3.1 P188 對(duì)CPV ID3 細(xì)胞株的影響

與細(xì)胞培養(yǎng)基中的其他營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑相比，剪切保護(hù)劑是獨(dú)特的添加劑，被廣泛用于保護(hù)細(xì)胞免受培養(yǎng)過程中的氣泡和攪動(dòng)所帶來(lái)的損害。在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用最廣泛的剪切保護(hù)劑之一是P188，P188是一種非離子表面活性劑，平均分子量為8.4 kDa，親水-親脂平衡（HLB）為 29.16[14]。Peng H 等研究認(rèn)為P188 是通過降低液體表面張力，增加氣泡的誘導(dǎo)時(shí)間等方面，減小氣泡破裂期間的剪切力，增加細(xì)胞與氣泡的附著時(shí)間，降低細(xì)胞的流動(dòng)性，從而增加細(xì)胞對(duì)剪切力的抵抗力[15]。

在培養(yǎng)基其他營(yíng)養(yǎng)成分含量和培養(yǎng)條件一定時(shí)，培養(yǎng)基中 P188 濃度在 0～15 g·L-1范圍內(nèi)，添加一定量的P188 對(duì)細(xì)胞密度和活率的維持及抗體表達(dá)量有積極的影響，且隨著P188 濃度越高，培養(yǎng)液的粘度越大，培養(yǎng)后期細(xì)胞高密度維持時(shí)間越長(zhǎng)，也反應(yīng)出P188 對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用；P188 通過提高細(xì)胞對(duì)剪切力的抵抗力，延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，從而增加細(xì)胞的抗體表達(dá)量。此外，試驗(yàn)采用的是批次培養(yǎng)方式，如果進(jìn)行流加培養(yǎng)，鑒于P188 對(duì)細(xì)胞密度和活率維持有積極作用，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抗體表達(dá)量應(yīng)該可以提高得更多[16-17]。

3.2 NaHCO3 和 HEPES 對(duì) CPV ID3 細(xì)胞株的影響

CPV ID3 雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞株屬于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，因此，培養(yǎng)基使用了NaHCO3和HEPES 兩種緩沖物質(zhì)，采用開放式培養(yǎng)，使細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2及時(shí)逸出培養(yǎng)瓶，再通過培養(yǎng)箱中5%CO2濃度，與培養(yǎng)基中的NaHCO3構(gòu)成緩沖體系，從而調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 值。但在細(xì)胞培養(yǎng)操作過程中，取樣觀察細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)基脫離了5% CO2的環(huán)境，CO2氣體逸出，pH 會(huì)迅速升高，會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利的影響；若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH 在7.2 左右。HEPES 是一種非離子兩性緩沖液，在pH 7.2～7.4 范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力[13]。培養(yǎng)基在空氣中暴露時(shí)，培養(yǎng)基中HEPES 濃度越高，培養(yǎng)基pH 值越穩(wěn)定。因此無(wú)血清培養(yǎng)基中緩沖物質(zhì)最好既含有NaHCO3又含有HEPES。

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中每增加1 g·L-1的P188，培養(yǎng)基的滲透壓增加約 1 mOsm·kg-1，P188 對(duì)滲透壓的影響不大；在培養(yǎng)基中NaHCO3濃度為1.5 g·L-1的基礎(chǔ)上，每增加 0.5 g·L-1的 NaHCO3，培養(yǎng)基的滲透壓約增加10 mOsm·kg-1，可見用NaHCO3調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 值時(shí)，會(huì)對(duì)滲透壓有較大的影響；HEPES 濃度在0～25 mM 含量范圍內(nèi)，每增加5 mM 的HEPES，培養(yǎng)基的滲透壓增加 5～7 mOsm·kg-1，HEPES 也在一定程度上提高了培養(yǎng)基的滲透壓。溶液的滲透壓，依賴于溶液中溶質(zhì)粒子的數(shù)量，通常以滲透壓摩爾濃度（Osmolality）來(lái)表示，它反映的是溶液中各種溶質(zhì)對(duì)溶液滲透壓貢獻(xiàn)的總和[18]。細(xì)胞需在適當(dāng)?shù)臐B透壓環(huán)境中生長(zhǎng)，因此滲透壓是培養(yǎng)基必要的質(zhì)量控制項(xiàng)目之一，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度設(shè)計(jì)范圍應(yīng)為260～320 mOsm·kg-1，基本上模擬了培養(yǎng)基加血清的滲透壓濃度（290 mOsm·kg-1）[13]。

從滲透壓角度來(lái)看試驗(yàn)的抗體表達(dá)量結(jié)果，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基HEPES 濃度在0～25 mM 范圍內(nèi)，HEPES濃度與培養(yǎng)基滲透壓和抗體表達(dá)量成正比；而培養(yǎng)基中 NaHCO3濃度在 1.5～2.5 g·L-1范圍內(nèi)，NaHCO3濃度與培養(yǎng)基滲透壓，乳酸生成量成正比，與抗體表達(dá)量成反比。這一結(jié)果也與Ozturk S S、張立等[19-20]的研究結(jié)果相類似。Ozturk S S 等[19]研究認(rèn)為在高滲透壓條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)速率下降和單細(xì)胞抗體生成速率提高；張立等[20]認(rèn)為隨著乳酸濃度的升高，培養(yǎng)基滲透壓提高，單細(xì)胞抗體生成速率提高，但高乳酸濃度會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，使細(xì)胞密度降低，最終單抗總表達(dá)量下降[20-21]。所以NaHCO3濃度與抗體表達(dá)量成反比的因素之一可能是培養(yǎng)基中NaHCO3濃度對(duì)細(xì)胞乳酸生成的影響造成的：培養(yǎng)基中NaHCO3濃度越高，乳酸的生成速率越快，乳酸濃度越高，進(jìn)而抗體表達(dá)量越低。此外，由于檢測(cè)手段的局限，NaHCO3和HEPES 對(duì)CPV ID3 細(xì)胞株的影響，可能有很多其他的因素沒有觀察到。

由于 NaHCO3濃度在 1.5 ～2.5 g·L-1范圍內(nèi)，NaHCO3濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)速率，最高活細(xì)胞密度和乳酸積累量成正比，與抗體表達(dá)量成反比。平衡這幾種作用，2 g·L-1NaHCO3為較優(yōu)選擇。在 NaHCO3濃度一定時(shí)，HEPES 濃度與抗體表達(dá)量成正比，與最高活細(xì)胞密度成反比；當(dāng)HEPES 濃度為10 mM 時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速率最大；當(dāng) HEPES 濃度大于 10 mM 時(shí)，HEPES 濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)速率成反比，而且HEPES 價(jià)格很高，平衡這些因素，10 mM 的HEPES 濃度為較優(yōu)選擇。因此，針對(duì)于CPV ID3 細(xì)胞株，培養(yǎng)基中的NaHCO3和HEPES 的最適濃度分別為2 g·L-1和10 mM。

4 結(jié)論

針對(duì)CPV ID3 細(xì)胞株，在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加P188 可以延長(zhǎng)細(xì)胞密度維持時(shí)間，提高抗體表達(dá)量；培養(yǎng)基中的NaHCO3和HEPES 的最適濃度分別為2 g·L-1和 10 mM。