由于缺乏血管、神經(jīng)和淋巴組織，關節(jié)軟骨自我修復的能力受到限制。一旦受損，就會導致關節(jié)腫脹和疼痛，加速骨關節(jié)炎的進展。迄今為止，盡管目前已取得很多進展，但是完全再生透明軟骨以及恢復其原有的機械特性仍然是一個難以實現(xiàn)的目標。免疫反應越來越被認為是影響軟骨修復的關鍵因素。相關研究表明巨噬細胞在生長板損傷后的炎癥期中占主導作用。巨噬細胞主要包括炎性巨噬細胞M1型和修復型巨噬細胞M2型。軟骨在損傷后巨噬細胞被激活成M1型浸潤到損傷局部，并分泌大量促炎癥因子（如TNF-α、IL-1β等），這些炎癥因子可持續(xù)存在，加速了軟骨基質(zhì)的降解。此外，在炎癥微環(huán)境中，間充質(zhì)干細胞發(fā)生異常分化，軟骨細胞開始轉(zhuǎn)化或去分化為成纖維樣細胞，形成機械性能差的纖維軟骨。在修復期，M2巨噬細胞可分泌抗炎因子和軟骨細胞因子，從而抑制炎癥反應，促進軟骨修復。因此，軟骨再生需要對關節(jié)炎癥微環(huán)境進行多維時空調(diào)節(jié)，在炎癥階段促進巨噬細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，將有利于軟骨再生。

間充質(zhì)干細胞（MSCs）已被證明具有免疫調(diào)節(jié)特性和對組織具有修復作用通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境。并且研究表明MSCs的抗炎作用是由于其旁分泌機制，主要涉及外泌體的分泌。外泌體是直徑30～200 nm的由細胞分泌的囊泡，功能類似于親代間充質(zhì)干細胞。此外，外泌體相對與細胞來說較容易儲存和運輸，可以避免細胞移植的許多限制，包括免疫原性和致瘤性。外泌體攜帶各種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和各種非編碼RNA，特別是miRNA，它們通過調(diào)控受體細胞的活性發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。然而，單純的外泌體治療在體內(nèi)的治療效果有限，主要由于外泌體局部濃度以及一過性的釋放而無法保證持續(xù)的作用。因此，亟需開發(fā)一種模擬細胞外基質(zhì)（ECM）的3D支架充當有效的載體。甲基丙烯酸改性的明膠（GelMA）在某些性質(zhì)上與天然ECM相似，具有良好的生物相容性和可調(diào)節(jié)的物理性質(zhì)，在眾多組織工程領域中有廣泛的應用，包括骨骼、軟骨和心臟組織工程等。以GelMA為基材的水凝膠可以作為外泌體的理想載體在神經(jīng)損傷、小兒生長板損傷等領域已得到證實，而在軟骨損傷中卻很少有報道。本研究中，我們旨在體外將甲基丙烯酸改性的明膠水凝膠（GelMA）與骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）來源的外泌體結(jié)合，通過抑制炎癥以及調(diào)節(jié)巨噬細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，從而促進軟骨損傷的修復。我們評估了負載外泌體水凝膠的理化性質(zhì)、細胞生物相容性以及對于巨噬細胞的影響通過體外共培養(yǎng)系統(tǒng)研究了通過調(diào)節(jié)巨噬細胞向M2型極化對于損傷軟骨細胞的作用，并且通過大鼠軟骨損傷模型評估了負載外泌體的水凝膠對軟骨損傷修復的作用。

作為國家各級各類教育機構與組織的體系及其管理規(guī)則，教育制度呈現(xiàn)出“義務教育年限的延長、普通教育與職業(yè)教育的綜合化、高等教育的大眾化、終身教育體系的建構”[7]等改革趨勢?！吧罨逃母铩笔橇暯叫聲r代中國特色社會主義教育制度論的核心關鍵詞[8]。十八屆三中全會提出要“深化教育領域綜合改革”，將綜合改革作為當前我國教育改革與發(fā)展的重要任務。“十三五”規(guī)劃首次明確將“提高教育質(zhì)量”作為未來5年教育工作的重點任務。習近平對深化教育改革提出了明確要求 [9]，貫穿了從基礎教育到職業(yè)教育到高等教育等整個階段，涵蓋了從家庭教育到學校教育到社會教育等全部領域。

1 材料和方法

1.1 軟骨細胞和RAW264.7細胞的獲取

軟骨細胞是從2周齡SD大鼠的膝關節(jié)軟骨組織中按既定方法獲得。SD大鼠從南方醫(yī)科大學實驗動物中心購買。收集的軟骨細胞在加入10%FBS（Gibco）、100 U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素（Gibco）的Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）/F-12 培養(yǎng)基（Gibco）中在5%CO、37 ℃條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)基每隔1 d 更換1 次，我們使用第2 代到第4 代的細胞。RAW264.7細胞取自ATCC細胞庫并在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于5%CO、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細胞的提取和鑒定

根據(jù)之前研究，通過沖洗2周大鼠脛骨和股骨的骨髓腔獲得骨髓間充質(zhì)干細胞。提取的骨髓間充質(zhì)干細胞放在含10%血清的低糖DMEM（Gibco）培養(yǎng)基中，并在37 ℃，5%CO的細胞培養(yǎng)箱中孵育。3～5代（P3-P5）的細胞用于后續(xù)的實驗。分別使用成骨和成脂分化培養(yǎng)基對骨髓干細胞進行培養(yǎng)后，使用茜素紅染色、油紅O染色驗證骨髓間充質(zhì)干細胞的多細胞系分化潛力。

將獲取的骨髓間充質(zhì)干細胞在添加10%無外泌體血清的低糖DMEM（Gibco）中培養(yǎng)。在細胞融合達到50%～60%后，收集上清液進行超速離心。首先，將上清液以300、3000、10 000離心10 min，以分離活/死細胞和細胞碎片。然后，在100 000離心90 min后，在離心管底部的外泌體用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）重懸并儲存在-80 ℃。以上所有離心過程均在4 ℃下進行。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體的分離、鑒定以及染色

2.2比較兩組患兒外漏、低血糖、皮下沉積等并發(fā)癥發(fā)生情況,具體情況(見表2),實驗組共有3例患兒發(fā)生并發(fā)癥,對照組共有7例患兒發(fā)生并發(fā)癥,實驗組患兒并發(fā)癥發(fā)生率均明顯低于對照組。

收集到的外泌體通過表面標記抗體進行鑒定，包括CD9（ProteinTech）和TSG101（Abcam）。分別使用透射電子顯微鏡（TEM）和納米粒子跟蹤分析（qNanosystem,Izon Science）觀察形態(tài)和尺寸分布。根據(jù)說明書使用紅色熒光染料PKH26（Sigma-Aldrich）進行外泌體染色。

通過甲基丙烯酸改性明膠前后的H核磁共振譜圖，發(fā)現(xiàn)MA改性明膠（GelMA）在5.3 ppm 和5.5 ppm 新出現(xiàn)了兩個屬于甲基丙烯酰胺（MA）的質(zhì)子峰（圖2A）。流變性能測試表明，GelMA-Exo 的儲能模量（G’）遠大于損耗模量（G”），并且它的儲存模量為1525±50 Pa（圖2B）。SEM成像結(jié)果顯示水凝膠呈多孔網(wǎng)絡結(jié)構，且外泌體結(jié)合在GelMA水凝膠內(nèi)表面（圖2C）。外泌體的釋放持續(xù)了14 d，超過80%的外泌體從水凝膠中釋放（圖2D～E）。

1.4 外泌體-水凝膠體系的構建

在50 ℃下將稱取的5 g明膠（Gel，Sigma-Aldrich）加入到50 mL PBS溶液中，進行攪拌直至明膠完全溶解。然后量取4 mL 的甲基丙烯酸酐（MA，Sigma-Aldrich）以0.5 mL/min的速度緩慢滴加到明膠溶液中，在以上條件下磁力攪拌連續(xù)反應3 h后終止反應。隨后將溶液置入透析袋（12 000～14 000）中，在50 ℃下的純水中進行透析6 d。將透析后的溶液在2000 r/min下進行離心10 min，取上層清液，在冷凍干燥機中進行凍干6 d，最終得到泡沫狀的甲基丙烯酸改性明膠樣品（GelMA）。將GelMA在50 ℃下溶解在重水（DO）中，采用核磁共振譜儀進行驗征是否改性成功。將凍干的GelMA 溶解于濃度為0.5%()的光引發(fā)劑Irgacure 2959（Sigma-Aldrich）溶液中，制備成濃度為10%()的單體預聚溶液。將200 μg外泌體與60 μL水凝膠溶液充分混合，在紫外輻射（6.9 mW/cm2，360～480 nm）下聚合15 s以獲得外泌體-水凝膠體系（GelMA-Exo）。

1.5 材料表征

研究揭示了在不同的企業(yè)生命周期階段，碳信息披露對企業(yè)融資約束的影響存在差異化。啟示企業(yè)在努力構建全面規(guī)范的碳信息披露體系的同時，應結(jié)合企業(yè)所處的生命周期，做好企業(yè)碳信息披露的戰(zhàn)略規(guī)劃安排，以實現(xiàn)企業(yè)價值在不同生命周期階段的最大化。

1.6 外泌體釋放曲線的測定

根據(jù)之前的研究，使用雙茚二酮酸(BCA)試劑盒（Beyotime）評估累積釋放和每日釋放情況。將上述制備的GelMA-Exo 在37 ℃條件下在PBS 溶液中孵育。在第1、3、7、14天收集上清，使用BCA法進行游離外泌體的檢測，外泌體總量減去上清液中游離外泌體的量就是水凝膠負載的外泌體的總量。

鋁合金的納標重點是：高純鋁合金材料及其相應成套的測試標準。高純鋁合金材料對鋁合金的成分控制的非常嚴格，使得合金的疲勞度、斷裂性能以及抗腐蝕性能都有明顯提高，因此它是飛機采用損傷容限設計及可靠性設計的理想化材料，也是航空鋁合金的主要發(fā)展方向。鋁合金的預拉伸板、鍛件規(guī)范、擠壓管材等國家軍用標準的制定，為飛機重要主承力結(jié)構零件的制造提供了原材料的保障，進而滿足了飛機批量生產(chǎn)的需要。目前我國飛機發(fā)動機制造過程中直接使用GJB的鋁合金標準，鋁合金的棒、線、管材使用GB。而對于鎂合金的GB，實際運用在制造、生產(chǎn)鋼棒與鑄造合金中。

1.7 外泌體的攝取

為證實水凝膠中含有的外泌體可被細胞吞噬，將RAW264.7細胞與GelMA-Exo共培養(yǎng)24 h。24 h后，吸取出培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，然后用4%多聚甲醛固定20 min。激光共聚焦顯微鏡（Leica）下免疫熒光（IF）染色觀察外泌體的吞噬情況（細胞骨架用Actin-Tracker Green 染色（Beyotime），細胞核用Hoechst 33342染色（Beyotime））。

1.8 材料生物相容性評價

進行體外生物相容性實驗，包括細胞活力、增殖和粘附實驗。為了進行活/死染色試驗，將密度為1×10的軟骨細胞種植在12孔培養(yǎng)板上，與各組材料共培養(yǎng)24 h，然后以1 mL∶3 μL∶5 μL（PBS:calcein-AM（Invitrogen）∶PI（Invitrogen））的比例制備活/死液，每組加入，并且在37 ℃下孵育30 min后激光顯微鏡觀察。將1×10軟骨細胞分別與各組軟骨細胞共培養(yǎng)1、3、7 d后，分別加入100 μl/mL 的CCK-8溶液（Beyotime）培養(yǎng)2 h。然后在96孔板上加入100 μL 上清液，用酶標儀（BioTech）測定吸光度。最后用以下方法檢測細胞與水凝膠的粘附性：簡單地說，密度為1×10/孔的細胞培養(yǎng)3 d，用4%的多聚甲醛固定，用Actin-Tracker Green和Hoechst 染色，并用共聚焦顯微鏡觀察細胞的形態(tài)。

1.9 GelMA-Exo/RAW264.7細胞/軟骨細胞共培養(yǎng)體系的建立

為了檢測系統(tǒng)免疫微環(huán)境對軟骨細胞的影響，用Transwell室（ThermoFisher）建立了GelMA-Exo/RAW264.7細胞/軟骨細胞共培養(yǎng)體系。實驗前用IL-1β（10 ng/mL）處理軟骨細胞24 h。GelMA-Exo與1×10RAW264.7細胞共培養(yǎng)，置于下室，1×10軟骨細胞置于上室。1.0 μm孔徑的聚碳酸酯膜將兩層膜隔開，不影響細胞因子的自由通過。

在經(jīng)濟發(fā)展的新形勢下，涉農(nóng)企業(yè)面臨的內(nèi)外部環(huán)境發(fā)生著改變，這就要求企業(yè)能夠適時調(diào)整并優(yōu)化完善公司治理結(jié)構，在加強黨的領導下提高涉農(nóng)企業(yè)公司治理的自主創(chuàng)新能力，提升治理效率，從而實現(xiàn)涉農(nóng)企業(yè)穩(wěn)定發(fā)展，助推我國農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化實現(xiàn)、農(nóng)村繁榮和農(nóng)民增產(chǎn)增收。

1.10 基因表達測定

GelMA組與對照組各項指標相比差異沒有統(tǒng)計學意義（＞0.05，圖5A）。GelMA-Exo組和Exo組顯著上調(diào)軟骨細胞的COL-2和SOX-9水平，下調(diào)MMP-13的表達（＜0.05,圖5A）。q-PCR結(jié)果還顯示GelMA-Exo組在第7天的治療效果明顯優(yōu)于Exo組（＜0.05，圖5A）。免疫熒光染色分析與q-PCR結(jié)果一致，GelMA-Exo組COL-2蛋白表達最高，而MMP-13蛋白表達最低（＜0.05，圖5B～C）。

利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM,ZEISS）觀察了水凝膠的內(nèi)部形貌和結(jié)構。用安東帕MCR 301流變儀在恒定應變（5%）對水凝膠進行頻率掃描，掃描頻率為0.1～10 Hz，以檢測水凝膠材料的儲能模量（G’）和損耗模量（G”）。

1.11 Western blotting檢測

細胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑（Thermo Fisher）的RIPA緩沖液（CWBIO）中研磨成勻漿。上清液在冰上裂解30 min，在4 ℃下12 000 r/min離心30 min收集。用BCA試劑盒（Beyotime）測定總蛋白濃度。將等量（40 μg）的蛋白上載于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF,Thermo Fisher）膜上，用5%脫脂乳封閉PVDF膜1 h，然后用一抗孵育過夜（表2）。然后將PVDF膜與二抗孵育1 h，然后應用增強化學發(fā)光（ECL）試劑盒（Thermo Fisher）進行。在每一步之前，使用TBST緩沖鹽水清洗膜3次。使用ImageJ軟件進行分析。

1.12 免疫熒光檢測

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)標準差表示。采用GraphPad Prism 5軟件進行Tukey 檢驗的單因素方差分析。所有實驗至少重復3次。＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.13 大鼠膝關節(jié)軟骨損傷模型的構建

12 只8 周齡雌性SD 大鼠分為4 組，即假手術組（Sham）、單純損傷組（SI）、GelMA 組和GelMA-Exo組。首先，分別使用腹腔注射吡嗪（6 mg/kg）和氯胺酮（70 mg/kg）進行麻醉后，左腿刮毛，用碘伏徹底消毒。在無菌條件下切開內(nèi)側(cè)髕骨皮膚和肌肉暴露股骨髁。隨后，使用15 g針沿股骨縱軸鉆一個直徑2 mm的孔，使其損傷表面軟骨。每只老鼠經(jīng)處理后，縫合切口并再次消毒。然后把老鼠關在單獨的籠子里，讓它們自由地獲得食物和水。術后4周對所有大鼠實施安樂死。

1.14 組織學評價

治療4周后處死大鼠，采集關節(jié)軟骨標本。組織用多聚甲醛固定24 h，在10%EDTA（pH 7.4）中脫鈣21 d后，進行石蠟包埋、切片。切片在二甲苯中脫蠟，通過一系列分級的乙醇洗滌再水化后，使用蘇木精和伊紅（H&E）以及Masson染色評估軟骨修復情況。

1.15 統(tǒng)計學分析

首先樣品用4%多聚甲醛在PBS 中固定30 min。然后，用0.2%Triton X-100（Biofroxx）處理細胞或組織10 min，在室溫下用3%牛血清白蛋白（BSA，Biofroxx）封閉1 h，最后加入一抗在4 ℃條件下過夜。此后，樣品用PBS 洗滌3次，室溫下與二抗孵2 h，并進行Hoechst（Beyotime）染色。最后，在共聚焦顯微鏡下觀察染色情況。相關抗體列在表2中。

2 結(jié)果

2.1 骨髓干細胞及其外泌體表征

在光學顯微鏡下，骨髓間充質(zhì)干細胞表現(xiàn)為典型的紡錘體形態(tài)（圖1A）。用茜素紅、油紅染色表明提取的骨髓間充質(zhì)干細胞具有多細胞系分化潛力（圖1B）。通過透射電鏡觀察，其形態(tài)為圓形或橢圓形，細胞膜結(jié)構完整（圖1C）。粒徑分析表明直徑主要集中在89 nm 左右，與外泌體的粒徑分布一致（圖1D）。蛋白免疫印跡結(jié)果分析表明，納米粒子表達了外泌體特異性標記CD9和TSG101（圖1E）。

2.2 材料的合成與表征

β2-MG是由淋巴細胞或者其他有核細胞分泌一種內(nèi)源性低分子量血清蛋白質(zhì)。血清中的99.9%的β2-MG會被近曲小管細胞重吸收和降解，不再向血液中反流，以此保持β2-MG在體內(nèi)的恒定。但當近曲小管輕度受損時，尿液中β2-MG會顯著增加[7]，可見人體腎臟的損傷程度與β2-MG具有明顯的對應關系。

2.3 生物相容性評估

活/死染色顯示各組均可見大量活細胞（綠色），少量死細胞（紅色）（圖3A）。CCK-8分析結(jié)果表明，軟骨細胞增殖隨著培養(yǎng)時間的延長而增加。在第3天和第7天，GelMA-Exo和Exo組軟骨細胞活性顯著高于對照組和GelMA組（＜0.05，圖3B）。細胞骨架成像顯示，各組的軟骨細胞都具有較大的擴張面積（圖2C）。

2.4 GelMA-Exo促進RAW264.7細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化

裝載在GelMA 水凝膠上的外泌體能夠被RAW264.7細胞吞噬并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用（圖4A）。第3天，q-PCR結(jié)果顯示，M2表型標記（Arg-1和IL-10）在GelMA-Exo組和Exo組的表達值顯著高于對照組（＜0.05，圖4B）。而GelMA組與對照組差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05，圖4B）。在第7天時，q-PCR結(jié)果顯示GelMAExo顯著提高了Arg-1和IL-10的表達水平，而iNOS和TNF-α的表達水平降低（＜0.05，圖4B）。與q-PCR分析一致，第7天免疫熒光結(jié)果顯示與對照組相比，GelMAExo組iNOS陽性細胞比例較低，而Arg-1陽性細胞比例較高（＜0.05，圖4C～D）。

2.5 GelMA-Exo通過改善免疫微環(huán)境促進IL-1β?lián)p傷的軟骨細胞的修復

首先使用一種RNA提取試劑盒提取細胞總RNA（Omega），然后使用EVO MLV RT試劑盒將其（Accurate Biotechnology）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用LightCycler 480 SYBR Green Master Mix（TaKaRa）進行qRT-PCR分析。內(nèi)參選擇GAPDH。用2法測定基因的相對表達量。分別進行了3次獨立的實驗。引物序列見于表1。

2.6 GelMA-Exo明顯促進大鼠軟骨損傷的修復

動物模型建立4周后，采集動物膝關節(jié)標本進行HE和Msaaon染色（圖6）。染色顯示假手術組關節(jié)軟骨清晰，表面光滑完整。單純損傷組關節(jié)軟骨損傷區(qū)域出現(xiàn)較大的軟骨缺損、斷裂，基本很少有再生的軟骨。相比于單純損傷組，GelMA組和GelMA-Exo組修復效果良好，且GelMA-Exo組修復效果大于GelMA組。

我國古籍浩如瀚海，不可斗量，屬于地名專著的卻寥如晨星，含有地名內(nèi)容的絕大多數(shù)信息散落于各種古代文選中，至于地名命名原則更是大海撈針，然而正是由于陳橋驛先生的深入探求，才確立了我國古代著作中出現(xiàn)的地名命名原則。

3 討論

研究認為軟骨損傷所產(chǎn)生的炎癥環(huán)境對軟骨細胞的死亡和肥大、細胞外間質(zhì)破裂、異位骨形成以及軟骨損傷進展到骨關節(jié)炎是至關重要的。M1巨噬細胞及其分泌的炎癥因子能抑制骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖、活性以及軟骨分化，從而加速ECM 的降解。研究表明CD14巨噬細胞和促炎細胞因子能抑制骨關節(jié)炎滑膜衍生干細胞（SDSC）向軟骨分化，并且他們發(fā)現(xiàn)IL-1β和TNF-α顯著抑制SDSCs 中軟骨形成基因的表達。mTORC1通過驅(qū)動M1巨噬細胞的極化來促進肥大軟骨細胞的發(fā)育和成熟?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明M1巨噬細胞不利于軟骨修復，促進巨噬細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化將有利于軟骨損傷的修復。

本文考慮到主客觀賦權法存在的缺點與不足，立足于主客觀結(jié)合賦權方法的現(xiàn)狀，采用層次分析法與熵權法相結(jié)合的賦權方法，確定了汾河流域節(jié)水灌溉水平綜合評價體系中各個指標的綜合權重，將專家的經(jīng)驗知識和各個數(shù)據(jù)信息充分結(jié)合，既體現(xiàn)了專家的個人意向，實現(xiàn)了專家個人偏好的合理表達，又能反映指標的客觀特性，具有較強的實用性和可操作性。可為相關評價體系指標權重的確定提供參考。

外泌體攜帶各種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和各種非編碼RNA，特別是miRNA，具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用。此外，BMSCs來源的外泌體已被證明可以誘導細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和蛋白激酶B通路的快速磷酸化，促進細胞增殖和遷移，與CCK8結(jié)果一致。有學者將骨髓干細胞來源的外泌體注射到大鼠關節(jié)腔內(nèi)用于緩解關節(jié)炎的進展。然而，骨髓干細胞外泌體是否可以通過調(diào)控免疫而促進軟骨損傷的修復卻很少有文獻報道。本研究利用GelMA水凝膠聯(lián)合骨髓干細胞來源外泌體，用于軟骨損傷的治療。材料學表征表明我們成功合成了GelMA水凝膠，是一個穩(wěn)定的粘彈性固體，彈性模量滿足體內(nèi)應用的條件，并且外泌體成功負載到GelMA水凝膠上。GelMA水凝膠在某些性質(zhì)上與天然ECM相似，具有良好的生物相容性，可充當外泌體的理想載體，與實驗結(jié)果一致。GelMA水凝膠的多孔表面和親水特性也有利于細胞粘附。此外，動物實驗表明GelMA水凝膠也能促進軟骨的修復，這可能歸功于它的ECM成分。外泌體在GelMA水凝膠內(nèi)釋放持續(xù)了14 d，且超過80%的外泌體從水凝膠中釋放出來，這確保了最佳的生物治療效果。相比于外泌體一過性的釋放，水凝膠的緩釋作用能使外泌體長時間發(fā)揮生物學功能。將RAW 細胞與不同樣品共培養(yǎng)，Exo 組和GelMA-Exo組在第3天沒有差異而第7天出現(xiàn)差異，表明緩釋的外泌體具有更強的調(diào)節(jié)作用。

在軟骨損傷過程中，靜息的巨噬細胞可被刺激分化為M1和M2亞群，M1亞群主要參與炎癥的早期階段，而M2亞群主要參與修復階段。M1巨噬細胞表面的模式識別受體蛋白和Toll樣受體蛋白可識別關節(jié)腔內(nèi)的損傷相關分子模式，激活NF-κB 信號通路，從而促進炎癥因子的釋放。本研究表明負載外泌體的GelMA水凝膠可以有效抑制iNOS和TNF-α的表達，并促進巨噬細胞由M1型向M2轉(zhuǎn)化。根據(jù)我們先前的研究，外泌體內(nèi)所含的各種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及非編碼RNA，特別是miR-199a，它可以通過抑制NF-κB 通路來調(diào)節(jié)免疫功能。

進一步我們通過建立Transwell 共培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn)負載外泌體的GelMA水凝膠能夠通過調(diào)控免疫進而促進SOX-9 和COL-2 的表達，而抑制MMP-13 的表達。SOX-9被認為是軟骨形成的關鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，可以調(diào)節(jié)軟骨形成相關標志物（II型膠原）的表達和GAG 基質(zhì)的形成。M1型巨噬細胞釋放的TNF-α和IL-1β等促炎因子可以通過降低炎癥環(huán)境中軟骨形成轉(zhuǎn)錄因子SOX9 mRNA的水平來抑制軟骨形成基因的表達。此外，炎癥免疫細胞產(chǎn)生的炎癥因子如IL-1β、iNOS 和TNF-α會導致基質(zhì)蛋白酶如MMP-1和MMP-13過度表達，進而導致軟骨細胞凋亡和基質(zhì)降解。M2巨噬細胞，也稱為創(chuàng)傷修復巨噬細胞，其分泌的許多抗炎分子，包括Arg-1、IL-10等，為軟骨細胞修復創(chuàng)造了一個必要的抗炎環(huán)境，抑制了MMP-13的表達，從而促進了損傷軟骨細胞的修復。

綜上，本研究將骨髓干細胞來源的外泌體負載到GelMA水凝膠上，體外實驗表明負載在水凝膠上的外泌體可以通過抑制炎癥并且可以通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的M2極化來減輕炎癥對軟骨細胞的抑制作用，從而促進軟骨ECM的合成。同時，體內(nèi)實驗表明負載外泌體的GelMA有利于大鼠軟骨損傷的修復。本研究將有望為臨床治療軟骨損傷提供一種新思路。