人表皮生長因子受體2（HER2）是由原癌基因ErbB2編碼的跨膜蛋白，通過受體二聚體或激酶區(qū)磷酸化激活PIK/AKT/mTOR等信號途徑，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥。HER2不僅是胃癌化療的重要靶標，也是選擇化療方式的參考指標，同時也是監(jiān)測化療效果的預后分子。曲妥珠單抗是靶向HER2的人源單克隆抗體，作為HER2陽性胃癌化療的靶向藥物，其通過拮抗HER2信號轉導及抗體依賴細胞介導的細胞毒作用發(fā)揮抗腫瘤作用。盡管曲妥珠能夠延長晚期胃癌患者的總生存期，然而伴隨化療出現(xiàn)的腫瘤獲得性耐藥已不可避免。因此，研究胃癌曲妥珠耐藥機制、闡明逆轉耐藥策略對提高化療有效性具有現(xiàn)實意義。

③建設單位要進一步加強對施工單位水土保持措施施工的管理，特別是在簽訂施工合同時就應該注明各水土保持措施的工程量等；施工單位則應該合理安排各工序的施工順序，注意施工順序的合理性。

Runt相關轉錄因子3（RUNX3）屬于Runt結構域家族成員，在腫瘤增殖、分化及腫瘤微環(huán)境中具有重要生物學功能。近年來，有關RUNX3突變與腫瘤耐藥的研究備受關注，然而RUNX3與胃癌曲妥珠耐藥的關系尚未闡明。我們的前期研究顯示，曲妥珠耐藥胃癌細胞RUNX3與DNA 的結合活性顯著增加，敲除RUNX3可逆轉其耐藥，然而代謝水平RUNX3是通過何種途徑調(diào)控胃癌細胞對曲妥珠耐藥，尚不明確。因此，本實驗以胃癌曲妥珠耐藥細胞（NCI N87R）及RUNX3敲除細胞（NCI N87R/RUNX3）為研究對象，基于超高液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜的代謝組學研究NCI N87R/RUNX3細胞的代謝特征變化，結合生物信息學及功能驗證闡釋RUNX3在胃癌曲妥珠耐藥細胞中的代謝調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

1290型超高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent），Q Exactive Focus四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜儀和Heraeus Freco17型離心機（Thermo Fisher）；BSA124S-CW型電子天平（Sartorius）；JXFSPRP-24型研磨儀（上海凈信）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（Millipore）；PS-60AL超聲儀（雷邦電子）；ACQUITY UPLC HSS T3（Waters）。甲醇、乙腈、乙酸銨、甲酸為HPLC級（CNW Technologies），L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏），曲妥珠抗體（羅氏制藥），谷胱甘肽及輔酶Ⅱ檢測試劑盒（碧云天），其它試劑均為分析純。

1.2 樣本制備及代謝物提取

人源胃癌細胞NCI N87由國家蛋白質(zhì)科學中心惠贈，NCI N87R及NCI N87R/RUNX3為自建細胞系，細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，NCI N87R和NCI N87R/RUNX3培養(yǎng)時加入80 μg/mL的曲妥珠。將細胞均分為2組，一組用于細胞計數(shù)，另一組用于實驗。計數(shù)細胞用PBS洗2次，胰酶消化，充分混勻后計數(shù)。同法收集實驗組細胞，PBS 洗2 次，加入1 mL PBS，用細胞刮刮取細胞，收集細胞懸液，按計數(shù)細胞對實驗細胞數(shù)折算，確保各樣本含有相同的細胞數(shù)且不少于1×10/mL。取等量細胞懸液，離心，細胞沉淀經(jīng)液氮速凍后轉移至-80 ℃保存。按文獻方法提取代謝物，簡單來說，細胞沉淀加入1 mL預冷甲醇-乙腈-水（2∶2∶1，）混合提取液（含內(nèi)標L-2氯苯丙氨酸為1 μg/mL），震蕩30 s；加鋼珠2粒，45 Hz研磨2 min，冰水浴超聲3 min，-20 ℃靜置1 h，4 ℃、12 000離心10 min，上清經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，質(zhì)譜檢測。取等體積待檢樣本（30 μL），充分混合作為質(zhì)控（QC）樣本。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

采用SPSS21.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用獨立樣本檢驗，＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

質(zhì)譜條件：ESI離子源，正負離子電壓分別為4.0 kV和-3.6 kV；毛細管溫度400 ℃；掃描范圍70～1000 m/z；鞘氣流速45 Arb；輔助氣流速15 Arb；全掃分辨率70 000；二級分辨率17 500；多級模式循環(huán)碰撞能為30±15 V。

目前，國內(nèi)外對湖泊沉積物污染狀況的評價尚缺乏統(tǒng)一的評價方法和標準，本研究采用綜合污染指數(shù)法和有機污染指數(shù)法評價洞庭湖表層沉積物的污染狀況，這兩種方法常被用于湖泊沉積物污染評價研究。

1.4 數(shù)據(jù)預處理、統(tǒng)計分析及差異代謝物辨識

依據(jù)試劑盒檢測NCI N87R與NCI N87R/RUNX3細胞GSH/GSSG水平。每組設定6個復孔，利用酶標儀檢測412 nm 處吸光值，測定含量并計算GSH/GSSG。

正負離子所有QC 樣本的變異偏差在±2 std（圖1A、B），QC 樣本呈正相關且相關系數(shù)r≥0.98（圖1C、D）。PCA顯示，正負離子所有QC處于95%置信區(qū)間，且代表各樣本的點緊密聚集（圖2A、D）。正負離子下QC內(nèi)標的RSD分別為4.47%和3.68%。

數(shù)據(jù)導入MetaboAnalyst 5.0進行多變量分析，所有變量經(jīng)均值中心化和pareto scaling標度化處理。用非監(jiān)督的主成分分析（PCA）建立分類模型，觀察樣本組間聚類趨勢及離群樣本，采用有監(jiān)督的偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）建立模型，并對模型進行7次循環(huán)交互驗證及200次置換檢驗，R2表示模型穩(wěn)定性，Q2表示模型預測能力，并依據(jù)PLS-DA模型中變量投影重要性（VIP）篩選對模型分組貢獻較大的變量；進而使用獨立樣本檢驗和倍數(shù)變化（FC）篩選差異變量，選擇VIP＞1、FC≥1.2或FC≤0.83且＜0.05的變量作為差異變量。使用OSI-SMMS（達碩信息技術）數(shù)據(jù)庫進行差異代謝物辨識，根據(jù)分子質(zhì)荷比、保留時間及二級質(zhì)譜裂解信息對碎片離子匹配度打分，分值大于0.7的代謝物視為定性準確，依據(jù)HMDB數(shù)據(jù)庫對外源性、藥源性物質(zhì)剔除。

將差異代謝物導入MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫作通路分析，剔除＞0.05及通路影響值PIV＜0.1的通路，顯示8條通路在NCI N87R/RUNX3細胞顯著變化，其中谷氨酰胺代謝變化最顯著（=2.1×10），其次為煙酸-煙酰胺及甘油磷脂代謝（=3.7×10，=9.0×10），谷胱甘肽、精氨酸-脯氨酸代謝顯示較小的值（=0.001，=0.002）；而丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝具有最高的通路影響值（PIV=0.621），其次為谷氨酰胺（PIV=0.510）；煙酸-煙酰胺和谷胱甘肽代謝的PIV 分別為0.429 和0.368（圖4，表2）。

廣西與東盟國家的跨境人民幣結算量增長趨勢順應雙邊進出口貿(mào)易持續(xù)上漲趨勢，且在2016年進出口貿(mào)易增速下降的趨勢下仍能保持總量增加的態(tài)勢。但從增速看，2015年和2016年速度明顯放緩，后勁不足。

1.5 通路富集分析與聚類分析

基于MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進行通路富集分析，富集方法為Fisher's Exact Test；拓撲學方法為Relative-betweeness Centrality；富集數(shù)據(jù)庫為KEGG。聚類算法為Pearson correlation 和Average linkage clustering。

1.6 還原型/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）測定

數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard 轉為mzML 格式，利用XCMS（參數(shù)設置如下：profmethos:binlin;method:centWave;ppm:60;peakwidth:8～30 scans;prefilter:9（3,100）；noise threshold:20；mzdiff:0.05 amu）進行保留時間校準、峰識別、峰匹配、峰積分，刪除缺失值超過50%的變量，生成包括質(zhì)荷比（m/z）、保留時間（RT）及峰面積的數(shù)據(jù)矩陣，采用最小值法填充缺失值，樣本總面積法歸一化。數(shù)據(jù)采集前連續(xù)檢測QC樣本3次，并在每組樣本檢測結束后插入QC 1次，檢測過程每7個樣本插入QC 1次，將QC數(shù)據(jù)中相對標準偏差（RSD）＞30%的變量剔除。

1.7 還原性/氧化性輔酶II（NADPH/NADP）測定

細胞計數(shù)后加入200 μL NADPH/NADP提取液，吹打促使細胞完全裂解，4 ℃、12 000離心10 min，收集上清，依據(jù)試劑盒檢測450 nm處NADPH/NADP。

1.8 統(tǒng)計學方法

色譜條件：1290型超高液相色譜儀搭載HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），正離子模式：流動相A為0.1%甲酸-水；流動相B為乙腈；負離子模式：流動相A為5 mmol/L乙酸銨-水；流動相B為乙腈。洗脫條件：0～1 min，1%B；1～8 min，99%B；8～10 min，99%B；10～10.1 min，1%B；10.1～12.0 min，1%B；流速0.5 mL/min；柱溫35 ℃，自動進樣器溫度4 ℃；進樣量為5 μL。

2 結果

2.1 質(zhì)控分析

根據(jù)工程投資估算和運行收益分析，1臺1000 MW機組汽輪機回熱系統(tǒng)優(yōu)化投資費用總計1075萬元，機組運行綜合收益306.7萬元/a，靜態(tài)投資回收期約為3.5 a，具有較高的經(jīng)濟性。

2.2 代謝輪廓分析

公司一切進入正軌，許多事情都不用周橋親力親為，他只需最后拍板，按理說他應該開心才對，但事實恰好相反，他什么事情都要操心，員工們給的意見他也不愛聽，總覺得屬下不聽他的話。

2.3 差異代謝物篩選及鑒定

根據(jù)火山圖結合VIP值鑒定差異代謝物81個（圖3A,B），其中正離子42個，負離子39個（表1）。采用熱圖顯示差異代謝物的變化水平，其中43 個代謝物在NCI N87R/RUNX3中顯著增加，38個代謝物顯著降低（圖3C）；代表性化合物的質(zhì)譜鑒定（圖3D，E）。

2.4 代謝通路富集分析

企業(yè)在國外的海外施工項目涉及的領域范圍比較廣，同時也要求管理人員具有扎實的物資管理方面的經(jīng)驗，還需要具備一定的語言溝通能力，了解到國際市場和國際貿(mào)易過程中的相關的政策以及相關的法規(guī)方面的基本常識。同時，也有效的應對海外項目施工現(xiàn)場管理過程中出突發(fā)情況，及時有效的處理相關的情況，可以推動項目施工工程的順利發(fā)展，也是現(xiàn)代國外項目進行的一大趨勢，施工現(xiàn)場的管理人員需要全面加強相關方面的學習，比如語言、市場營銷、法律法規(guī)等方面知識的學習可以提高相關的管理人員的專業(yè)發(fā)水平。

2.5 敲除RUNX3導致NCI N87R細胞代謝失調(diào)

富集結果顯示，NCI N87R/RUNX3細胞中谷氨酰胺通路代謝物，包括谷氨酰胺、谷氨酸、ADP、AMP、GMP、腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤核苷及鳥嘌呤的水平降低（＜0.001）；從代謝物水平看，谷氨酰胺、鳥嘌呤水平回調(diào)至親本細胞相應代謝物水平；而ADP、AMP、次黃嘌呤和鳥嘌呤核苷低于親本細胞相應代謝物水平（圖5A）。NCI N87R/RUNX3細胞糖酵解代謝物磷酸二羥丙酮（DHAP）、三磷酸甘油酸（G3P）和磷酸烯醇丙酮酸（PEP）顯著降低（＜0.001），且與親本細胞相應代謝物水平相當（圖5B）；嘧啶代謝物UMP、尿嘧啶及UDP顯著增加（＜0.001），且向敏感細胞相應代謝物水平轉歸，而乳清酸鹽與敏感細胞變化相反（圖5C）；脯氨酸-精氨酸通路中SMA、脯氨酸、肌酸和瓜氨酸水平均升高（＜0.001，圖5D）。

2.6 NCI N87R/RUNX3 細 胞GSH/GSSG 及NADPH/NADP降低

試劑盒檢測結果顯示，NCI N87R細胞GSH/GSSG及NADPH/NADP 比值較親本細胞顯著增加（圖6A，B），而NCI N87R/RUNX3細胞GSH/GSSG比值較耐藥組顯著降低（＜0.05，圖6A），NADPH/NADP的比值趨于降低（=0.07，圖6B）。

結果顯示，組間PCA分離明顯，組內(nèi)樣本聚集良好（圖2A、D）。PLS-DA模型顯示，正離子模式44.4%的變量（R2X）可解釋NCI N87R與NCI N87R/RUNX3組間99.7%的差異（R2Y），交叉有效性驗證預測能力為95.1%［Q2（cum）］（圖2B）；負離子模式45.1%的變量（R2X）可解釋NCI N87R 與NCI N87R/RUNX3 組間99.8%的差異（R2Y），交叉有效性驗證預測能力為95.8%［Q2（cum）］（圖2E），兩種模式下R2（Y）與Q2（cum）的差值小于0.3，Q2（cum）大于50%。置換檢驗顯示，正負離子R2Y建模值與真實值（綠色圖）組成的回歸線截距分別為0.735和0.752；Q2建模值與真實值（藍色圖）組成的回歸線截距分別為-0.526和-0.591（圖2C、F）。

2.7 差異代謝物-調(diào)控基因網(wǎng)絡分析

基于OmicsNet數(shù)據(jù)庫構建差異代謝物-調(diào)控基因的關系，結果顯示，整個網(wǎng)絡由65個節(jié)點分子（Nodes）和127條邊界線（Edges）構成，其中節(jié)點包括23種代謝物和42個調(diào)控基因，其中谷氨酸、AMP及ADP組成網(wǎng)絡的中心（圖7A）。在此基礎上，構建谷氨酰胺代謝通路子網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺的3 個調(diào)控基因GLS、NADSYN1和GNPNAT1在NCI N87R/RUNX3細胞中的表達均降低（圖7B）。而谷氨酸被13個基因所調(diào)控，其中表達上調(diào)基因3個（PLCB3、NFKB1和TSTD1），下調(diào)基因10 個（GLS、NADSYN1、GNPNAT1、GLA、CALB2、GCA、BIRC5、BCL2、GGH 和ASS1），其中GLS、NADSYN1和GNPNAT1為谷氨酸和谷氨酰胺共同調(diào)控基因。SRC 為AMP、ADP、GMP、鳥嘌呤核苷和鳥嘌呤的共調(diào)節(jié)基因。此外，還發(fā)現(xiàn)了鳥嘌呤核苷、鳥嘌呤、GMP、AMP 的調(diào)控基因，其中多數(shù)基因在NCI N87R/RUNX3細胞中表達下調(diào)（圖7B）。甘油磷脂、煙酸-煙酰胺及丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酰胺代謝紊亂，這些通路均與能量代謝中心三羧酸（TCA）循環(huán)密切相關（圖8）。

3 討論

腫瘤耐藥極具復雜性和異質(zhì)性，而代謝失調(diào)是導致其耐藥的重要特征和直接體現(xiàn)。因此，探究耐藥細胞失調(diào)的代謝特征，不僅有助于深入了解腫瘤細胞增殖的原因，而且能夠為逆轉腫瘤耐藥提供依據(jù)。本研究顯示，敲除RUNX3可導致耐藥細胞代謝途徑改變，其中谷氨酰胺代謝及糖酵解途徑抑制；而嘧啶、精氨酸-脯氨酸代謝激活；甘油磷脂、煙酸-煙酰胺及丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酰胺代謝紊亂，這些通路均與能量代謝中心三羧酸（TCA）循環(huán)密切相關。此外，與細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)相關的谷胱甘肽代謝抑制，包括GSH/GSSG 和NADPH/NADP比值降低，提示能量代謝紊亂及氧化還原穩(wěn)態(tài)改變可能是RUNX3逆轉NCI N87R細胞對曲妥珠單抗耐藥的潛在機制。

谷氨酰胺代謝為腫瘤細胞糖酵解及氧化磷酸化提供了原料，也可通過調(diào)控糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)誘導腫瘤耐藥。谷氨酰胺經(jīng)轉運體轉入細胞，并在谷氨酰胺酶（GLS）、谷氨酸脫氫酶（GDH）及天冬氨酸轉氨酶催化下轉化為α-酮戊二酸，后者不僅為其它代謝提供了中間產(chǎn)物，而且為TCA循環(huán)提供能量。另一方面，α-KG催化逆向生成乙酰輔酶A，可作為脂質(zhì)合成原料，從而影響脂質(zhì)代謝。作為線粒體催化酶，GLS在NCI N87R/RUNX3細胞的表達下降，且谷氨酸和谷氨酰胺水平降低，說明谷氨酰胺代謝受到抑制，這不僅對耐藥細胞能量代謝產(chǎn)生影響，而且影響其它通路發(fā)生改變，提示抑制谷氨酰胺代謝是RUNX3逆轉胃癌曲妥珠耐藥的潛在機制。

谷子:① 草本植物,是我國北方的糧食作物;② 谷子的沒有去殼的籽實,也叫粟,有的地區(qū)叫粟子。(注:②中的“谷子”應該改為“這種植物”)

作為維持機體氧化還原系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的關鍵小分子活性肽，GSH通過調(diào)節(jié)代謝酶的活性維持GSH與GSSG的水平以達到胞內(nèi)氧化還原平衡，然而，持續(xù)高水平的GSH導致腫瘤細胞DNA修復能力增強，進而促進其耐藥。因此，降低GSH或者靶向GSH系統(tǒng)代謝酶可有效逆轉腫瘤耐藥。相比NCI N87R細胞，盡管GSH、GSSG在NCI N87R/RUNX3細胞中的水平增加，然而GSH/GSSG降低，提示GSH系統(tǒng)在NCI N87R/RUNX3細胞具有復雜的調(diào)節(jié)機制。GSH系統(tǒng)還可通過調(diào)節(jié)NADPH/NADP水平維系胞內(nèi)氧化還原平衡，而GSH/GSSG及NADPH/NADP降低提示NCI N87R/RUNX3細胞氧化應激增加，還原勢下降。

能量代謝重編程是腫瘤耐藥的顯著特征之一，盡管糖酵解產(chǎn)生的ATP凈值不及氧化磷酸化多，然而腫瘤細胞仍以高速率的糖酵解為主要方式，以獲得增殖所需的ATP，且糖酵解代謝中間體在代謝調(diào)控及抵抗氧化應激方面具有重要作用。雖然本實驗構建的網(wǎng)絡關系中沒有發(fā)現(xiàn)調(diào)控糖酵解的相關基因，然而糖酵解關鍵分子DHAP、G3P及PEP在NCI N87R/RUNX3細胞顯著降低，提示敲除RUNX3導致耐藥細胞糖酵解抑制。

核苷酸代謝失衡不僅與腫瘤發(fā)生及轉移有關，而且可通過影響代謝酶的表達促進腫瘤耐藥。作為核苷酸代謝的重要組成部分，嘧啶代謝為腫瘤細胞DNA、RNA的合成提供了原料，其產(chǎn)生的β-丙胺酸及β-氨基異丁酸是腫瘤代謝所需的營養(yǎng)物質(zhì)；精氨酸-脯氨酸代謝與腫瘤免疫及轉移能力關系密切。相比耐藥細胞，NCI N87R/RUNX3細胞嘧啶、精氨酸-脯氨酸通路分子的水平顯著增加，推測這些代謝物可能對NCI N87R/RUNX3細胞起到能量代償作用。此外，胞磷膽堿、磷酸二羥丙酮、膽堿、乙酰膽堿和磷酸甘油酸在NCI N87R/RUNX3細胞中顯著增加，而溶血性磷脂酰膽堿水平降低，說明NCI N87R/RUNX3細胞甘油磷脂代謝發(fā)生了紊亂。綜上所述，本研究表明，敲除RUNX3對胃癌曲妥珠耐藥細胞代謝產(chǎn)生重要影響，而了解這些代謝特征有助于進一步認識RUNX3在胃癌曲妥珠耐藥中的作用。