糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是糖尿病引起的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致盲的主要原因。糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要病理過程是視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（hRMECs）功能障礙。有研究發(fā)現(xiàn)高血糖介導(dǎo)的炎癥、氧化應(yīng)激可導(dǎo)致hRMECs功能障礙，血管壁削弱的同時內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖，促進(jìn)血管滲漏和功能不全，進(jìn)而引起正常血管的失衡和異常新生血管的形成，最終導(dǎo)致出血、牽拉性視網(wǎng)膜脫離，甚至視力喪失。因此，抑制hRMECs功能障礙和視網(wǎng)膜組織損傷，有助于延緩或阻止DR的病理進(jìn)程。

SIRT1 是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶（NAD+）的去乙?；?，與許多蛋白質(zhì)的翻譯修飾密切相關(guān)，SIRT1通過去除轉(zhuǎn)錄因子中的乙?；?，參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、缺氧誘導(dǎo)因子（hif）、轉(zhuǎn)化生長因子β1 等多種細(xì)胞因子的表達(dá)。因此，它可能參與了多種與DR進(jìn)展相關(guān)的生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、遷移和凋亡。

黃連解毒湯是一種中藥湯劑，因其具有降糖、改善糖尿病腎損傷的作用，臨床上常應(yīng)用于糖尿病的治療。漢黃芩苷是黃連解毒湯中黃芩的主要類黃酮有效成分，具有抗炎、抗氧化的作用。研究發(fā)現(xiàn)漢黃芩苷可以有效改善小鼠關(guān)節(jié)炎和脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷，能通過保護腸屏障功能障礙和抑制NF-κB及NLRP3炎癥小體的激活來減輕結(jié)腸炎。此外，漢黃芩苷通過Toll-like receptor 4、Wnt/β-catenin及hedgehog等信號通路抑制血管形成。以上研究表明漢黃芩苷通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激在多種疾病中發(fā)揮作用。此外，有報道稱漢黃芩苷可通過促進(jìn)SIRT1表達(dá)和抑制p53激活，在大鼠腦水腫發(fā)展中發(fā)揮作用。而MiR-221/SIRT1/Nrf2信號軸也是調(diào)控DR進(jìn)展的主要調(diào)控機制之一。但是關(guān)于漢黃芩甙在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用尚未被報道。

本研究一方面通過高糖誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（hRMECs）構(gòu)建體外DR模型，另一方面通過鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的SD大鼠糖尿病視網(wǎng)膜的損傷構(gòu)建體內(nèi)DR模型，探討漢黃芩苷對在體內(nèi)外對細(xì)胞和視網(wǎng)膜組織損傷的影響及其對SIRT1的調(diào)控作用，為治療糖尿病視網(wǎng)膜病變提供新的方向和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和主要試劑

hRMECs（ATCC）；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（Thermo Fisher）。SPF級雄性SD大鼠40只（上海市實驗動物研究中心），體質(zhì)量250～300 g，周齡8～10周。根據(jù)隨機數(shù)字表法將小鼠分為對照組（Sham組）、模型組（STZ組）、漢黃芩苷組（Wog組）和漢黃芩苷治療組（STZ+Wog 組），10 只/組。鏈脲佐菌素、漢黃芩苷、葡萄糖和甘露醇（西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司）；ROS試劑盒、CCK-8試劑盒（北京碧云天生物科技有限公司）；NO 試劑盒、IL-1β ELISA 檢測試劑盒、IL-6 ELISA檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GSH-ST）試劑盒（上海滬崢生物科技有限公司）；SIRT1兔單克隆抗體、VEGF兔單克隆抗體、HIF-1α兔單克隆抗體、actin兔多克隆抗體以及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白IgG 二抗（Abcam）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與模型構(gòu)建 hRMECs 生長于含10%FBS、100 μg/mL鏈霉素和100 μg/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d更換一次培養(yǎng)基。將處于對數(shù)生長期的hRMECs細(xì)胞分為4組：對照組（NG），用5 mmol/L的葡萄糖處理hRMECs；滲透對照組（MA），用5 mmol/L的葡萄糖加上25 mmol/L 的甘露醇（MA）處理hRMECs；高糖組（HG），用30 mmol/L的葡萄糖處理hRMECs，模擬糖尿病的體外模型；處理組（HG+Wog）：在30 mmol/L的葡萄糖誘導(dǎo)條件下，加入不同濃度的漢黃芩苷（10、20、30、40 μmol/L）處理hRMECs。

易太太道：“不買還要聽你這些話！”說著打出一張五筒，馬太太對面的黑斗篷啪啦攤下牌來，頓時一片笑嘆怨尤聲，方剪斷話鋒。

1.2.5 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移 將各組細(xì)胞重懸于無血清的高糖DMEM中，根據(jù)說明書取200 μL細(xì)胞懸液放置在小室上層，下室加入500 μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育24 h后，用干凈棉簽輕輕拭去上室細(xì)胞，甲醇固定20 min并用0.1%結(jié)晶紫染色15 min后，在顯微鏡下觀察并拍照、計算遷移細(xì)胞數(shù)。

后續(xù)實驗中將hRMECs 細(xì)胞分為5 組：對照組（NG），用5 mmol/L 的葡萄糖處理hRMECs；高糖組（HG），用30 mmol/L的葡萄糖處理hRMECs，模擬糖尿病的體外模型；漢黃芩苷組［HG+Wog（30 μmol/L）］，在30 mmol/L的葡萄糖誘導(dǎo)條件下，加入30 μmol/L漢黃芩苷處理hRMECs；HG+Wog（30 μmol/L）+si-NC組，在30 mmol/L葡萄糖和30 μmol/L漢黃芩苷共處理條件下，轉(zhuǎn)染si-NC至hRMECs；HG+Wog（30 μmol/L）+si-SIRT1組，在30 mmol/L葡萄糖和30 μmol/L漢黃芩苷共處理條件下，轉(zhuǎn)染si-SITR1至hRMECs。

炸薯條、醋熘土豆絲、土豆餅、土豆沙拉、土豆泥，這些想想就會讓人垂涎欲滴的美味菜肴都是用土豆做出來的。不過，土豆這種再普通不過的蔬菜卻有著坎坷的歷史。

1.2.2 動物模型構(gòu)建 所有大鼠入組前均給予適應(yīng)性喂養(yǎng)，時間持續(xù)1周；試驗前所有大鼠均禁食12 h，STZ組和STZ+Wog 組腹腔注射腹腔注射0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH=4.5）溶解的STZ，劑量為60 mg/kg，Sham組和Wog組則注射等劑量的檸檬酸緩沖液;在注射48 h后通過血糖儀測定大鼠尾靜脈的血糖，如果血糖在16.7 mol/L以上則表示糖尿病大鼠模型建立成功。模型建立1周后，Wog組和STZ+Wog組給予30 mg/（kg·d）的漢黃芩苷治療，連續(xù)治療6周。模型組和對照組大鼠給予等量的生理鹽水，連續(xù)注射6周。在最后1 d，3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉，并摘除雙側(cè)眼球分離視網(wǎng)膜，一部分用于HE染色，一部分保留在-80 ℃用于其他實驗。

取得綜合所得，需要辦理匯算清繳的情形包括：一）從兩處以上取得綜合所得，且綜合所得年收入額減除專項扣除的余額超過6萬元；（二）取得勞務(wù)報酬所得、稿酬所得、特許權(quán)使用費所得中一項或者多項所得，且綜合所得年收入額減除專項扣除的余額超過6萬元；（三）納稅年度內(nèi)預(yù)繳稅額低于應(yīng)納稅額；（四）納稅人申請退稅。

1.2.4 CCK-8檢測細(xì)胞活性 將處理后的各組細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞密度為4×10/孔。培養(yǎng)24 h后，向細(xì)胞中加入10 μL/孔CCK-8溶液，37 ℃孵育1.5 h后，酶標(biāo)儀檢測波長450 nm處的細(xì)胞吸光度（）。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 為了敲低SIRT1表達(dá)，si-SIRT1干擾序列及其陰性對照（廣州銳博生物）按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000說明書將si-SIRT1干擾序列及其陰性對照分別轉(zhuǎn)染至對應(yīng)細(xì)胞分組中。qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

本評分模型納入預(yù)后因素時未加入雙磷酸鹽的使用，原因是本研究中幾乎所有骨轉(zhuǎn)移患者皆使用過雙膦酸鹽，且雙膦酸鹽的使用對骨轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的影響已基本明確，已成為常規(guī)治療方案[14]。本評分模型的缺點在于只基于一家醫(yī)療機構(gòu)的數(shù)據(jù)，存在選擇偏倚，且納入因素有九個之多，準(zhǔn)確性和實用性尚需更大樣本數(shù)據(jù)的檢驗，需要本機構(gòu)和其他醫(yī)療機構(gòu)在日后臨床工作中進(jìn)行實踐，不斷改進(jìn)，更加準(zhǔn)確的指導(dǎo)臨床。

1.2.6 小管形成實驗檢測血管生成 將300 μL Matrigel均勻鋪在24孔板中，37 ℃靜置1 h后，將各組細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞密度為1×10/孔，37 ℃、5%CO培養(yǎng)24 h后，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.13 Western blot檢測VEGF、HIF-1α、SIRT1蛋白水平 收集各組細(xì)胞和大鼠視網(wǎng)膜組織，用預(yù)冷的全蛋白裂解液冰上裂解10 min后，分別提取細(xì)胞以及視網(wǎng)膜組織的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。定量20 μg上樣，10%凝膠電泳SDS-PAGE 100 mV恒壓，60 mV恒壓轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗4 ℃下孵育過夜，加辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG，室溫下孵育120 min，之后用ECL試劑盒（Solarbio）進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，拍照觀察蛋白印記；并用Image J軟件分析蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.8 ELISA檢測IL-1β、IL-6水平 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于24孔板中，收集各組細(xì)胞上清培養(yǎng)液，隨后按照試劑盒說明書檢測促炎因子IL-1β、IL-6的水平，多功能酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度。

1.2.9 NO含量檢測 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于24孔板中，收集各組細(xì)胞上清培養(yǎng)液，隨后按照試劑盒說明書檢測上清液中NO的含量，使用多功能酶標(biāo)儀在550 nm處測定。

1.2.10 ROS水平檢測 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，按照分組處理各組細(xì)胞后，棄上清，PBS洗滌3次。將視網(wǎng)膜組織同樣用PBS洗滌3次后，通過勻漿法充分勻漿后離心20～30 min（2000 r/min），仔細(xì)收集上清，加入1 mL濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA，37 ℃黑暗條件下孵育20 min。多功能酶標(biāo)儀使用488 nm激發(fā)波長，521 nm發(fā)射波長檢測細(xì)胞和組織中的ROS活性。

在Amos 24.0中輸出標(biāo)準(zhǔn)化路徑系數(shù)圖,結(jié)果顯示,免費開放感知對公園滿意度、地方依賴以及地方認(rèn)同有正向影響,公園滿意度對地方依賴和地方認(rèn)同有正向影響,但是“免費開放→地方認(rèn)同”和“滿意度→地方認(rèn)同”的路徑系數(shù)太小,地方依賴對地方認(rèn)同有正向影響且路徑系數(shù)最大,與預(yù)測測量模型大致相同．在研究后對模型進(jìn)行修改,將“滿意度→地方認(rèn)同”以及“免費開放→地方認(rèn)同”這兩條路徑刪除,得到現(xiàn)模型(圖3)以及變量相互之間的關(guān)系(表3),并進(jìn)行擬合度檢驗,所有指標(biāo)都達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)水平(表4)．

1.2.12 qRT-PCR檢測IL-1β、IL-6 mRNA水平 收集各組細(xì)胞和視網(wǎng)膜組織，使用Trizol（Invitrogen）試劑盒分別從細(xì)胞和視網(wǎng)膜組織中提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒（Invitrogen）合成cDNA。按照說明書使用miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen，Germany）進(jìn)行qRT-PCR。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理，結(jié)果用2值來比較目的基因相對表達(dá)量的差異。實驗所用引物見表1。

1.2.7 單層細(xì)胞膜通透性檢測 將5×10細(xì)胞接種在Transwell小室上室中，37 ℃、5%CO培養(yǎng)至細(xì)胞融合成單層后，按上述實驗分組處理各組細(xì)胞。在上室加入100 μL的異硫氰酸熒光素-右旋糖酐（FITC-Dextran），下室加入600 μL不含血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 h后，取下室100 μL培養(yǎng)基置于96孔板中，多功能酶標(biāo)儀在492 nm處測定熒光強度。

1.2.14 蘇木精伊紅（HE）染色實驗 大鼠眼球切除術(shù)后，4%多聚甲醛浸泡固定48 h，梯度乙醇脫水視網(wǎng)膜，石蠟包埋切片后用二甲苯脫蠟，依次用濃度下降的乙醇（99.9%、97%、75%、50%）和蒸餾水沖洗。切片用蘇木精染色1～3 min，1%鹽酸乙醇分化20 s用PBS沖洗30 s。切片用伊紅染色1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯清洗后密封。各組切片在高倍光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)完整性、視網(wǎng)膜組織厚度以及有無增生并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

漢黃芩苷結(jié)構(gòu)式如圖1A，CCK-8實驗結(jié)果顯示0～40 μmol/L的漢黃芩苷單獨處理對hRMECs細(xì)胞活性影響無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05，圖1B）。高糖處理后，漢黃芩苷可濃度依賴性地抑制hRMECs異常增殖（＜0.05，圖1C）。Transwell小室實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖誘導(dǎo)下的hRMECs遷移能力增加（＜0.001）；與高糖組相比，漢黃芩苷的處理抑制高糖條件下hRMECs的遷移，且該影響呈濃度依賴性（＜0.05，圖1D）。

1.2.11 GSH-ST活性檢測 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，按照分組處理各組細(xì)胞后，棄上清，加入500 μL PBS制成細(xì)胞混懸液，超聲裂解后，按照試劑盒說明書檢測GSH-ST含量，采用多功能酶標(biāo)儀在540 nm處測定吸光度。

2 結(jié)果

2.1 漢黃芩苷呈濃度依賴性抑制高糖誘導(dǎo)的hRMECs異常增殖和遷移

所有實驗均進(jìn)行3 次平行實驗，并用GraphPad Prism8.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 漢黃芩苷呈濃度依賴性抑制高糖條件下hRMECs的小管形成和細(xì)胞膜通透性

小管形成實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖環(huán)境促進(jìn)hRMECs的小管形成能力（＜0.05）；與高糖組相比，不同濃度的漢黃芩苷抑制高糖誘導(dǎo)hRMECs的小管形成，且呈劑量依賴性（＜0.05，圖2A）。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖組新血管相關(guān)蛋白（VEGF、HIF-1α）表達(dá)升高（＜0.05）；與高糖組相比，漢黃芩苷處理后，新血管相關(guān)蛋白（VEGF、HIF-1α）表達(dá)降低，且隨著劑量增大，抑制作用愈發(fā)明顯（＜0.001，圖2B）。單層細(xì)胞膜通透性檢測實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高糖組細(xì)胞膜通透性增加（＜0.001）；與高糖組相比，經(jīng)10 μmol/L漢黃芩苷處理后細(xì)胞膜通透性未發(fā)生明顯改變，經(jīng)20、30、40 μmol/L漢黃芩苷處理后，細(xì)胞膜通透性隨漢黃芩苷濃度梯度增加而降低（＜0.001，圖2C）。

2.3 漢黃芩苷呈濃度依賴性減輕高糖誘導(dǎo)的hRMECs的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)

ROS和NO實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖條件促進(jìn)ROS和NO生成（＜0.001）；與高糖組相比，漢黃芩苷處理抑制高糖條件下ROS和NO的生成，且該抑制作用呈濃度依賴性（＜0.001，圖3A、B）。GSH-ST檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖誘導(dǎo)抑制抗氧化酶GSHST產(chǎn)生（＜0.001），與高糖組相比，漢黃芩苷呈劑量依賴性促進(jìn)高糖環(huán)境下GSH-ST 的生成（＜0.001，圖3C）。qRT-PCR和ELISA結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖誘導(dǎo)促進(jìn)炎癥因子（IL-1β，IL-6）產(chǎn)生（＜0.001）；與高糖組相比，隨著漢黃芩苷劑量的增大，IL-1β、IL-6表達(dá)水平逐漸降低（＜0.001，圖3D、E）。

2.4 漢黃芩苷上調(diào)SIRT1在高糖環(huán)境下hRMECs中的表達(dá)

Western blot 實驗顯示，與對照組相比，高糖組SIRT1表達(dá)降低（＜0.001）；與高糖組相比，10～30 μmol/L漢黃芩苷處理后SIRT1 表達(dá)呈濃度依賴性升高（＜0.001），而與HG+Wog（30 μmol/L）組相比，HG+Wog（40 μmol/L）組的細(xì)胞中SIRT1的蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05，圖4）。因此選用30 μmol/L漢黃芩苷進(jìn)行后續(xù)研究。

這種雕刻不再是一棵樹對自然的反映，而是通過雕塑的介入，用其代表著人的行為去塑造自然。簡單地說，就是通過雕塑的運轉(zhuǎn)，令它擁有改造自然的功能，這件雕塑與變化的自然重新組合成更大的動態(tài)雕塑。大自然也變成動態(tài)雕塑作品的組成部分，自然不再是作品周圍的環(huán)境，而是作品的必要組成部分。

2.5 漢黃芩苷通過上調(diào)SIRT1減輕高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞活力和遷移

為驗證漢黃芩苷是否通過調(diào)控SIRT1表達(dá)而影響高糖條件下hRMECs，首先對SIRT1 進(jìn)行敲低。Western blotting檢測干擾序列的干擾效率，實驗結(jié)果顯示si-SIRT1-1和si-SIRT1-2均能降低SIRT1表達(dá)（＜0.001，圖5A）。由于si-SIRT1-2的干擾效率較高，故選擇si-SIRT1-2進(jìn)行下一步研究。CCK-8實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與高糖組相比，30 μmol/L 漢黃芩苷抑制高糖環(huán)境下hRMECs的異常增殖（＜0.05），而抑制SIRT1表達(dá)能夠在一定程度上減輕漢黃芩苷的抑制作用，但無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05，圖5B）。Transwell小室實驗結(jié)果顯示，與高糖組相比，30 μmol/L漢黃芩苷抑制高糖誘導(dǎo)hRMECs遷移（＜0.05），而抑制SIRT1表達(dá)能夠在一定程度上減輕漢黃芩苷的抑制作用（＜0.001，圖5C）。

2.6 漢黃芩苷通過上調(diào)SIRT1抑制高糖誘導(dǎo)的hRMECs管形成和細(xì)胞膜通透性

小管形成實驗結(jié)果顯示，和高糖組相比，30 μmol/L漢黃芩苷抑制高糖誘導(dǎo)的hRMECs小管形成（＜0.05），而抑制SIRT1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)漢黃芩苷對小管形成的抑制作用（＜0.05，圖6A）。Western blotting實驗顯示，和高糖組相比，30 μmol/L 漢黃芩苷抑制新血管相關(guān)蛋白（VEGF、HIF-1α）表達(dá)（＜0.05），而抑制SIRT1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)漢黃芩甙對VEGF、HIF-1α蛋白表達(dá)的抑制作用（＜0.05，圖6B）。細(xì)胞膜通透性實驗結(jié)果顯示，和高糖組相比，30 μmol/L漢黃芩苷可抑制高糖誘導(dǎo)的hRMECs細(xì)胞膜通透性（＜0.05），而抑制SIRT1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)漢黃芩苷對hRMECs細(xì)胞膜通透性的抑制作用（＜0.05，圖6C）。

2.7 漢黃芩苷通過上調(diào)SIRT1 減輕高糖誘導(dǎo)的hRMECs的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)

ROS和NO實驗結(jié)果顯示，與高糖組相比，30 μmol/L漢黃芩苷抑制高糖誘導(dǎo)的ROS和NO生成（＜0.001），而抑制SIRT1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)漢黃芩苷對高糖環(huán)境下ROS和NO生成的抑制作用（＜0.001，圖7A、B）。GSH-ST檢測結(jié)果顯示，與高糖組相比，30 μmol/L漢黃芩苷可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的GSH-ST生成（＜0.001），而抑制SIRT1表達(dá)逆轉(zhuǎn)其生成（＜0.01，圖7C）。qRT-PCR和ELISA結(jié)果顯示，與高糖組相比，30 μmol/L漢黃芩苷可抑制高糖條件下IL-1β、IL-6的生成（＜0.001），而抑制SIRT1表達(dá)逆轉(zhuǎn)上述作用（＜0.001，圖7D、E）。

北京大學(xué)教務(wù)長、哲學(xué)系主任的徐炳昶甚至提出了全國教育農(nóng)業(yè)化的主張。1933年初，他以“旭生”為名在《獨立評論》中連續(xù)發(fā)表《教育罪言》系列文章，指出當(dāng)前教育制度不適合國情需要，應(yīng)當(dāng)提倡農(nóng)村教育代替都市教育，“中國是以農(nóng)立國的，我們相信不惟今日如是，即將來亦仍如是”，“由無限農(nóng)村組成的中國，應(yīng)該創(chuàng)造出來一種農(nóng)村的教育；至于從前所用的都市教育應(yīng)行廢棄”，改革中國教育方法“一定是與生產(chǎn)聯(lián)合，尤其要與農(nóng)業(yè)相聯(lián)合”[10]。

對圖2所示區(qū)域進(jìn)行多次不同目標(biāo)、不同負(fù)荷情況下的電動汽車最優(yōu)出行路徑規(guī)劃結(jié)果進(jìn)行對比。由于區(qū)域比較小，取電動汽車總?cè)萘繛檩^小的16kWh，

2.8 漢黃芩苷降低DR大鼠視網(wǎng)膜損傷并上調(diào)SIRT1的表達(dá)

HE染色結(jié)果顯示，Sham組和Wog組視網(wǎng)膜各層排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰完整，血管內(nèi)膜由一層完整且連續(xù)的內(nèi)皮細(xì)胞組成，沒有增生。而與對照組（Sham組）相比，STZ組誘導(dǎo)了顯著的視網(wǎng)膜組織損傷，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜組織厚度明顯增加（＜0.05），在30 mg/kg漢黃芩苷治療后有效緩解了糖尿病引起的大鼠視網(wǎng)膜增厚（＜0.05，圖8A）。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，STZ促進(jìn)了視網(wǎng)膜組織中新血管相關(guān)蛋白（VEGF、HIF-1α）表達(dá)（＜0.001），而漢黃芩苷的處理很大程度上降低了視網(wǎng)膜組織中VEGF和HIF-1α蛋白的表達(dá)（＜0.001，圖8B）。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，漢黃芩苷可抑制STZ誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜組織中炎癥因子（IL-1β、IL-6）和ROS的生成（＜0.001，圖8C、D）。此外，Western blot的結(jié)果顯示，與STZ誘導(dǎo)組相比，漢黃芩苷的處理上調(diào)了視網(wǎng)膜組織中SIRT1表達(dá)（＜0.05，圖8E）。

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3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，同時也是造成成年人視力損傷和致盲的重要眼部疾病之一。研究顯示持續(xù)高糖環(huán)境可導(dǎo)致hRMECs功能障礙，如細(xì)胞異常增殖、遷移、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等。因此，本研究一方面通過高糖誘導(dǎo)hRMECs異常增殖、遷移、小管形成、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，另一方面通過STZ誘導(dǎo)構(gòu)建SD大鼠糖尿病視網(wǎng)膜的損傷模型，分別模擬糖尿病視網(wǎng)膜病變在體內(nèi)外的病理狀態(tài)。

漢黃芩苷的抗氧化應(yīng)激以及抗炎作用在多種疾病中都得到了廣泛的驗證。漢黃芩苷可顯著抑制多糖刺激所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)；通過調(diào)控MLCK/pMLC2信號通路保護腸道屏障功能障礙，緩解結(jié)腸炎；對非酒精性脂肪肝小鼠炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激也表現(xiàn)出積極的治療作用。但目前其在糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用尚未見報道。本研究通過CCK-8實驗和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)漢黃芩苷能夠抑制高糖誘導(dǎo)的hRMECs異常增殖和遷移。小管形成實驗結(jié)果表明漢黃芩苷能夠抑制高糖誘導(dǎo)的hRMECs小管形成。VEGF是血管生成的關(guān)鍵因子，HIF-1α能夠促進(jìn)VEGF表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管生成。本研究通過Western blotting 檢測細(xì)胞VEGF、HIF-1α表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)漢黃芩苷能夠降低VEGF、HIF-1α表達(dá)，說明漢黃芩苷可抑制異常的高糖誘導(dǎo)的hRMECs 的血管形成。此外，qRT-PCR 和ELISA 檢測試劑盒發(fā)現(xiàn)漢黃芩苷抑制高糖誘導(dǎo)hRMECs炎癥相關(guān)因子（IL-1β、IL-6）的產(chǎn)生，減輕高糖誘導(dǎo)hRMECs的炎癥反應(yīng)。同時可顯著抑制高糖誘導(dǎo)hRMECs 氧化應(yīng)激相關(guān)因子（ROS、NO）的產(chǎn)生，促進(jìn)GSH-ST生成，減輕高糖誘導(dǎo)hRMECs的氧化應(yīng)激。此外，體內(nèi)實驗的結(jié)果也顯示漢黃芩苷可抑制STZ誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜組織損傷、VEGF、HIF-1α、ROS以及炎癥因子的表達(dá)水平。因此，上述研究結(jié)果表明漢黃芩苷能夠緩解糖尿病視網(wǎng)膜病變引起的細(xì)胞和組織損傷。

SIRT1作為一種負(fù)責(zé)細(xì)胞調(diào)控的蛋白質(zhì)去乙酰化的酶，通過組蛋白、非組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的脫乙酰作用抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡以及各種其他代謝途徑，被認(rèn)為是治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的潛在靶點。本研究通過漢黃芩苷的干預(yù)治療，發(fā)現(xiàn)漢黃芩苷上調(diào)了高糖誘導(dǎo)的hRMECs中SIRT1表達(dá)，這與他人研究在治療蛛網(wǎng)膜下腔出血中發(fā)現(xiàn)漢黃芩苷可促進(jìn)SIRT1的表達(dá)結(jié)果一致，從而得出漢黃芩苷可能通過上調(diào)SIRT1表達(dá)減輕高糖誘導(dǎo)hRMECs的異常增殖、遷移、血管形成、細(xì)胞膜通透性、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。本研究在視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SIRT1 的干擾質(zhì)粒下調(diào)SRIT1的表達(dá)，檢測漢黃芩苷對高糖誘導(dǎo)hRMECs的治療作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾SIRT1表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)漢黃芩苷對高糖誘導(dǎo)hRMECs的異常增殖、遷移、小管形成、細(xì)胞膜通透性、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)抑制作用。此外，在動物實驗中，漢黃芩苷的處理顯著提高了STZ誘導(dǎo)的DR大鼠視網(wǎng)膜組織中srit1的表達(dá)水平。該結(jié)果進(jìn)一步證實漢黃芩苷通過上調(diào)SIRT1減輕糖尿病視網(wǎng)膜病變所致的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和組織損傷。

綜上所述，本研究首次證明了漢黃芩苷通過上調(diào)SIRT1在糖尿病視網(wǎng)膜病變中發(fā)揮作用，該研究為開發(fā)糖尿病視網(wǎng)膜病變的臨床治療藥物提供了新的發(fā)現(xiàn)，同時也為SIRT1可作為糖尿病視網(wǎng)膜病變治療的靶點提供了實驗依據(jù)。