外傷性視神經(jīng)損傷（TON）是一種針對于視神經(jīng)的急性損傷，可導(dǎo)致患者失明。直接或間接的外力作用于視神經(jīng)可立即引發(fā)初級損傷，即大量的炎性細(xì)胞浸潤導(dǎo)致視神經(jīng)管水腫，壓迫毛細(xì)血管引發(fā)缺血性壞死。隨著炎癥的蔓延，凋亡相關(guān)因子上調(diào)誘發(fā)殘存視網(wǎng)膜RGC發(fā)生繼發(fā)凋亡，該過程稱之為二次損傷。視神經(jīng)屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，損傷后將難以修復(fù)再生?，F(xiàn)階段對TON的治療策略主要為降低二次損傷的程度和保護(hù)殘存的RGC，包括高劑量的糖皮質(zhì)激素，視神經(jīng)管手術(shù)減壓和上述兩種治療的組合。雖然上述治療方法在一些情況下能有效減低TON的二次損害程度，但TON發(fā)生常伴隨嚴(yán)重事故或頭面部損害，常錯失治療時機(jī)且一些患者對現(xiàn)有治療方案響應(yīng)不佳，此外長期大劑量注射糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致患者生命質(zhì)量的下降，因此治療TON函待探索新的方案。

隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，一些生物活性物質(zhì)，例如小分子化合物，神經(jīng)生長因子，神經(jīng)保護(hù)因子，干細(xì)胞，外泌體等制劑在動物TON或神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型上展現(xiàn)出令人鼓舞的療效。埃博霉素（EPOs）是一種紫杉醇類小分子化合物，研究發(fā)現(xiàn)此類化合物具有很強(qiáng)的微管穩(wěn)定作用，其與細(xì)胞內(nèi)β-微管蛋白結(jié)合時抑制微管解聚，增強(qiáng)微管柔韌性，阻礙細(xì)胞有絲分裂，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，被運(yùn)用于治療多種腫瘤疾病。由于大多數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷中會涉及到神經(jīng)元微管穩(wěn)態(tài)破壞，微管相關(guān)蛋白異常修飾和累積，纖維瘢痕的形成等分子和病理變化，因此運(yùn)用埃博霉素在微管穩(wěn)定方面的作用來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷和慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病被認(rèn)為是潛力巨大的。研究發(fā)現(xiàn)，TON后視網(wǎng)膜RGC合成能力受到干擾，胞體中微管相關(guān)蛋白Tau（一種微管穩(wěn)定分子）含量降低，而視神經(jīng)軸突中則顯著增加。上述研究表明TON后視神經(jīng)胞體的Tau蛋白合成受阻，不能產(chǎn)生足夠的Tau來穩(wěn)定微管，而隨著微管崩解和Tau清除機(jī)制的喪失，受損軸突中開始累積大量的Tau，最終誘發(fā)形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，阻礙神經(jīng)元的修復(fù)和再生。

由于視覺通路的精妙性和視神經(jīng)損傷病理變化的特殊性，埃博霉素D在視神經(jīng)損傷修復(fù)方面尚未進(jìn)行過探索。因此，本研究構(gòu)建大鼠TON模型，腹腔注射埃博霉素D進(jìn)行治療，觀察藥物治療前后模型動物在視神經(jīng)傳導(dǎo)通路FVEP指標(biāo)，視網(wǎng)膜RGC的數(shù)量，視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中Tau蛋白水平及其磷酸化水平，以及受損部位神經(jīng)元再生信號GAP43的表達(dá)情況。探索TON后外源補(bǔ)償微管穩(wěn)定分子能否減少視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞的繼發(fā)死亡，改善視網(wǎng)膜和視神經(jīng)的微管穩(wěn)定相關(guān)蛋白表達(dá)模式，從而激發(fā)神經(jīng)元的再生。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 本研究采用實(shí)驗(yàn)動物為SPF級雌性健康成年Sprague-Dawley大鼠42只，體質(zhì)量180～200 g。所有實(shí)驗(yàn)動物由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，且本研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理審查并通過（倫理審查批號KMMU2013017），本實(shí)驗(yàn)的動物操作人員具有云南省實(shí)驗(yàn)動物協(xié)會頒發(fā)的從業(yè)資格證。實(shí)驗(yàn)方案考慮了實(shí)驗(yàn)動物福利原則，但因FVEP檢測對動物麻醉狀態(tài)敏感，在不影響動物取食的前提下，為提高測量準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性，故采用左眼手術(shù)操作和右眼進(jìn)行假手術(shù)在同一個體上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)策略。

（2）若國主能肅溫，又良哲恭清儉聖讓者，皇極建也。（《太上說玄天大聖真武本傳神呪妙經(jīng)註》卷一，《中華道藏》30/532）

1）基肥用量。一般矮化幼齡樹畝施優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥2 000～2 500 kg；喬化幼齡樹畝施優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥1 500～2 000 kg；成齡矮化樹畝施優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥2 500～3 000 kg；成齡喬化樹畝施優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥 2 000～2 500 kg。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 42只健康SD大鼠隨機(jī)分成治療組和溶劑（DMSO）對照組，21只/組，在同等條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。從治療組和對照組中隨機(jī)分別隨機(jī)挑選3只個體行FVEP模型構(gòu)建（需在TON建模前1周進(jìn)行），F(xiàn)VEP模型構(gòu)建方法參照本實(shí)驗(yàn)室前期研究。SD大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔注射（0.4 g/kg，約0.4 mL）麻醉后，備皮固定于腦定位儀上，用組織剪分離暴露顱骨，直至清晰辨認(rèn)前后囟門，調(diào)整定位儀確定電極植入點(diǎn)（陰極為前囟點(diǎn)向前3 mm，陽極為向后7 mm左右旁開3 mm），用顱鉆在電極點(diǎn)處植入電極并覆蓋牙科義齒樹脂，待凝固后，向每只大鼠行大腿一次性肌注200 000 U/mL濃度的青霉素G鉀200 μL。完成FVEP模型后恢復(fù)1 周以備TON建模，期間觀察是否感染。TON建模前日首次給予1.0 mg/kg 劑量腹腔注射埃博霉素D 或等量DMSO溶劑，次日建立大鼠外傷性視神經(jīng)損傷模型，模型構(gòu)建方法參考本實(shí)驗(yàn)室前期研究。大鼠麻醉后（方法同前），左眼滴若干滴鹽酸奧布卡因，剪開左眼外眥約2 mm，向后方鈍性分離眼外直肌，暴露視神經(jīng)3～4 mm，用50 g的夾持鑷在眼球后約2 mm處鉗夾視神經(jīng)10 s。右眼為假手術(shù)眼，僅分離暴露視神經(jīng)，不行鉗夾損傷。首次注射后3 d/次注射治療至28 d，溶劑對照組給予相同體積的DMSO腹腔注射。TON建模中左眼行視神經(jīng)夾挫傷處理，右眼行假手術(shù)處理。

1.2.7 Western blot 檢測TON 大鼠視神經(jīng)及視網(wǎng)膜中Tau 及pTau-396/404 蛋白水平 本研究運(yùn)用Western blotting探索TON后不同時間點(diǎn)（3、7、28 d）藥物對比溶劑組對損傷眼視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中Tau及其磷酸化pTau-396/404的改變情況。此外考慮到埃博霉素對微管的強(qiáng)力穩(wěn)定作用，正常眼可能會受到藥物的影響，因此我們以溶劑組3d時間點(diǎn)的假手術(shù)右眼作為正常對照，探索藥物對正常眼的是否產(chǎn)影響。Western blot檢測流程為：按快速制備試劑盒說明書配制10%PAGE凝膠；上樣并電泳，90 V 30 min后120 V 90 min，待溴酚藍(lán)指示劑剛跑出玻璃夾層即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜90 V 90 min；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后分別切取內(nèi)參及目的條帶，于搖床上用PBS-Tween洗膜5次，5 min/次；5% BSA，37 ℃搖床封閉1 h，于搖床PBS-Tween洗膜5次，5 min/次；于搖床4℃過夜孵育一抗，GAPDH（1∶1000），Anti-Tau（phospho S396）（1∶2000），Anti-Tau（phospho S404）（1∶2000），Anti-Tau 抗體（Tau-5）（1∶2000）；次日，于搖床PBS-Tween洗膜5次，5 min/次；添加二抗（1∶20 000）室溫?fù)u床孵育1 h，于搖床PBS-Tween洗膜5次，5 min/次；隨后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影。蛋白樣本檢測進(jìn)行獨(dú)立3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用Image J軟件進(jìn)行灰度掃描，經(jīng)內(nèi)參校準(zhǔn)后進(jìn)行蛋白表達(dá)差異分析。

1.2.6 RGC計數(shù) 本研究將拍攝的固定顯微倍數(shù)下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層作為測量目標(biāo)，用Photoshop CS6 的測量工具測量各攝片中無脫片、破碎、折疊、撕裂等一系列異常情況視網(wǎng)膜長度。對每個個體的每枚眼球切片統(tǒng)計全視網(wǎng)膜約12～15 張具有重疊區(qū)的攝片，累積得出各眼球的有效視網(wǎng)膜總長。以DAPI 指示細(xì)胞核，以NeuN 指示RGC，必須滿足共定位的亮點(diǎn)才判定為RGC。且NeuN的亮點(diǎn)強(qiáng)度所反映出的RGC數(shù)目，根據(jù)DAPI 細(xì)胞核大小進(jìn)行確定。由于RGC數(shù)量變量在個體內(nèi)部左右眼的差異比在個體之間的差異小。因此，RGC 的計數(shù)以右眼假手術(shù)組眼球進(jìn)行對照，統(tǒng)計左眼損傷后相較于對照右眼時的RGC的丟失率，即（左眼-右眼）/右眼。

觀察組1、2的腓總神經(jīng)、脛后神經(jīng)CSA、D1、D2等數(shù)值與對照組相比均較高，且P＜0.05；而觀察組2各數(shù)值與觀察組1相比較高，且P＜0.05。見表。

1.2.4 視網(wǎng)膜/視神經(jīng)組織冰凍切片制作 處死大鼠后快速取出眼球，用1 mL 注射器沿角膜中央刺入2 mm并注入4%多聚甲醛固定液，灌洗眼球內(nèi)液體，待眼球內(nèi)液體全部置換后置入含有2 mL 4%多聚甲醛的EP 管內(nèi)，用棉花壓住管口保持眼球完全浸入液體。等待眼球自然沉底后將眼球浸入20%蔗糖溶液中脫水2 h，隨后置入30%蔗糖溶液中繼續(xù)脫水約24 h。待30%蔗糖溶液中眼球沉底后，取出眼球，沿眼球冠狀面分離出眼球角膜、虹膜及晶狀體，將包埋劑填充至眼球內(nèi)，并側(cè)放在事先預(yù)冷好的-25 ℃載物臺上，冷凍約5 min。待眼球固定好后，即可載入進(jìn)行切片，切片厚度約6～8μm，視網(wǎng)膜修片至中軸附近出現(xiàn)視乳頭區(qū)，視神經(jīng)修片至中軸處，將制作好的切片放入-80 ℃冰箱備用。

1.2.5 免疫熒光染色 從-80 ℃取出切片，冷卻至室溫；用PBS清洗3次，5 min/次；5%山羊血清封閉60 min，用PBS清洗3次，5 min/次；孵育一抗4 ℃過夜［突觸生長標(biāo)志物檢測采用Anti-GAP43（1∶1000）；觀察視網(wǎng)膜中RGC數(shù)目采用Anti-NeuN（1∶1000）］；次日取出孵育的切片室溫復(fù)溫1 h，PBS清洗3×5 min；加入對應(yīng)種屬二抗（1∶1000）于37 ℃孵育1 h，隨后用PBS清洗3次，每次5 min；DAPI核染并封片（注意避免氣泡產(chǎn)生）于熒光顯微鏡下觀察并攝片。

1.2.3 數(shù)據(jù)與樣本采集 FVEP數(shù)據(jù)采集治療組及溶劑對照組中FVEP建模的各3只個體的1 d及28 d數(shù)據(jù)，28 d檢測數(shù)據(jù)完成后安樂死（過量2%戊巴比妥2 mL腹腔注射，斷頸處死）。剩余大鼠的治療組（=18）和對照組（=18）中按照3、7、28 d這3個時間點(diǎn)分別隨機(jī)挑選出6只大鼠進(jìn)行取材（處死方式同前）。其中3只取眼球和視神經(jīng)進(jìn)行冰凍切片制作和熒光染色，另外3只取視網(wǎng)膜和視神經(jīng)進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。FVEP檢測方法，取材方法及蛋白提取方法參照本實(shí)驗(yàn)室前期研究方法。

1.2.2 藥物劑量與觀察節(jié)點(diǎn) 埃博霉素D于紫杉醇化合物類似，存在藥物劑量依賴效應(yīng)。高濃度的藥物常用于癌癥治療且會過穩(wěn)定微管，反而會抑制軸突功能產(chǎn)生神經(jīng)疼痛；而低劑量的藥物會促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長，對軸突生長錐微管適度穩(wěn)定，并在受損的脊髓軸突中保持微管的穩(wěn)定性和集束性。有研究表明，小鼠以1～3 mg/kg的劑量行每周1次腹腔注射可有效發(fā)揮藥物作用且不產(chǎn)生明顯副作用，依據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中的體表面積估算法，計算大鼠劑量為1次/周腹腔注射0.69～2.1 mg/kg，故本研究中選擇1.0 mg/kg腹腔注射，3 d/次。相關(guān)文獻(xiàn)在運(yùn)用不同藥物探索性治療大鼠TON研究中采用的療效觀測終點(diǎn)不同，如觀察至14 d以及28 d，而在評價埃博霉素D治療外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)現(xiàn)28 d時即有展現(xiàn)出治療效果，因此本研究探索埃博霉素D治療大鼠TON后視神經(jīng)損傷修復(fù)觀察終點(diǎn)為28 d。

本例中，中國法官所說的最后“陳述”是一個具有文化特性的詞，譯員為了消除被告的理解障礙，在口譯時增加了必要的信息：“如果你對判決有任何要求和希望，你可以向法庭提出要求和希望。”在許多情況下，當(dāng)譯員一時難以找到對應(yīng)詞時，可以直接通過解釋來調(diào)解。比如，翻譯一個地名時，譯員可以在保留原來的發(fā)音時，解釋說“這是一個地方的名稱”。這樣的調(diào)解策略有利于保證各方溝通的流暢而不影響庭審的節(jié)奏。

大鼠TON后視網(wǎng)膜RGC在溶劑對照組中呈現(xiàn)逐漸丟失的現(xiàn)象（圖2B），其3～7 d期內(nèi)丟失增速不明顯，28 d時丟失率可達(dá)61.16%（圖2A）。RGC計數(shù)以右眼假手術(shù)組進(jìn)行統(tǒng)計矯正對照，統(tǒng)計左眼損傷后相較于右眼不損傷時的RGC丟失率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3 d 治療組與溶劑對照組RGC 丟失率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（=0.032），7 d治療組與溶劑對照組RGC丟失率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（=0.054），28 d治療組與溶劑對照組RGC丟失率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（=0.042）。

2 結(jié)果

2.1 埃博霉素D 治療大鼠TON 的FVEP 檢測

對側(cè)眼（假手術(shù)眼）存在典型的FVEP閃光電信號，可見埃博霉素D未有對假手術(shù)眼造成不良影響（圖1C）；對于N2波延遲相對變化值來說，1 d和28 d時治療組與溶劑組均未檢測出明顯的差異（圖1A、B）；對于損傷眼相對于對側(cè)眼的P2-N2波振幅的相對縮減值來說，治療組出現(xiàn)縮減值降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均＞0.05，表1）；觀察FVEP閃光電信號波形，溶劑組中手術(shù)眼波形較為平直，而埃博霉素D治療組中手術(shù)眼波形起伏。

大鼠TON用埃博霉素D治療后視網(wǎng)膜中pTau-396的變化情形與總Tau的變化情況很類似，3 d時pTau-396/404 跟隨著總Tau 變化而增多（圖3B，C）。pTau-404具有自己的變化特性，在假手術(shù)眼當(dāng)中，攝入埃博霉素3 d后可抑制pTau-404位點(diǎn)的磷酸化（圖3C，F(xiàn)）。當(dāng)損傷之后，除28 d其他時間點(diǎn)的pTau-404磷酸水平或與Tau變化比值都是增加的（圖3F）。另外，埃博霉素D對視網(wǎng)膜發(fā)揮作用是在TON的早期3 d時，7～28 d時我們沒有觀察到其與溶劑對照組在總Tau或磷酸化pTau-396/404含量變化上存在明顯差異，僅在個別pTau-396/404與Tau變化比值中存在差異。

2.2 埃博霉素D治療大鼠TON后視網(wǎng)膜RGC存活情況

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，采用Excel 2010軟件進(jìn)行制圖。計量數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果均符合正態(tài)分布，滿足方差齊性，。治療組與對照組的FVEP檢測數(shù)據(jù)以及Western blot條帶灰度數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)。＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 埃博霉素D治療大鼠TON后視網(wǎng)膜Tau及其pTau-396/404的變化

大鼠TON用埃博霉素D治療后，3 d時假手術(shù)視網(wǎng)膜Tau蛋白明顯增多（=0.005，圖3A）。用埃博霉素治療損傷眼后，其視網(wǎng)膜Tau蛋白在3 d時間點(diǎn)上同樣大量增多（＜0.001），而在其他時間點(diǎn)上與溶劑對照組未有明顯差異（圖3A）。

1.1.2 主要試劑及儀器 主要試劑：20%和30%蔗糖溶液，PBST溶液，BSA封閉液。免疫熒光一抗：兔多克隆抗體Anti-GAP43 (Abcam)，兔單克隆抗體Anti-NeuN(Abcam)。免疫熒光二抗：綠色熒光Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG(H+L)(life technologies)，紅色熒光Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG(H+L) (life technologies)。WB一抗：Anti-Tau（phospho S396）Abcam，Anti-Tau（phospho S404）Abcam；Anti-Tau（Tau-5）Abcam；GAPDH Proteintech 10494-1-AP。WB 二抗：Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）Antibody KPL（214-1516）；Goat Anti-Mouse IgG（H+L）Antibody KPL（214-1806）。蛋白提取試劑盒：MinuteTM Total Protein Extraction Kit for Animal Cultured Cells and Tissues Catalog。蛋白酶抑制劑Cocktail（不含EDTA，100 DMSO 儲液，bimake），磷酸酶抑制劑Cocktail（100 bimake）。其他：EpiZyme科技PAGE凝膠快速制備試劑盒（10%），義齒基托樹脂，鹽酸奧布卡因，青霉素G 鉀，Epothilone D（MCE-HY-15278，10 mmol×1 mL in DMSO）。主要儀器設(shè)備：瑞沃德腦定位儀，瑞沃德手持鉆孔器，眼科羅蘭電生理測試儀器，Thermo冰凍切片機(jī)，熒光顯微鏡。

網(wǎng)絡(luò)信息時代，數(shù)據(jù)安全問題日益凸顯。在社會的各領(lǐng)域當(dāng)中，如政府機(jī)關(guān)的財政信息、軍隊(duì)系統(tǒng)的情報信息和內(nèi)部核心技術(shù)、銀行系統(tǒng)中的儲蓄卡和信用卡網(wǎng)絡(luò)信息、發(fā)展迅速的電子商務(wù)等，每天都有用戶不斷產(chǎn)生和交互大量的數(shù)據(jù)信息。數(shù)據(jù)作為信息系統(tǒng)的核心，數(shù)據(jù)安全是信息安全的核心內(nèi)容。在信息系統(tǒng)中對數(shù)據(jù)進(jìn)行有效保護(hù)，是對數(shù)據(jù)資源完整性、機(jī)密性、可用性的保護(hù)[1]。

2.4 埃博霉素D治療大鼠TON后視神經(jīng)Tau及其pTau-396/404的變化

大鼠TON用埃博霉素D治療后，3d時假手術(shù)眼視神經(jīng)可見增多的Tau蛋白（=0.018，圖4A）。用埃博霉素D治療損傷眼后，其視神經(jīng)Tau蛋白在3 d時間點(diǎn)上與溶劑對照組沒有明顯差異，而在7 d時間點(diǎn)上明顯低于溶劑對照組（=0.002，圖4A）。在大部分情況下，受損視神經(jīng)中pTau-396/404含量在治療組與溶劑對照組間的變化不明顯（治療組pTau-396位點(diǎn)在3d時出現(xiàn)降低，圖4B），僅相對總Tau的變化比率上產(chǎn)生波動或小幅度增多（圖4E、F）。

未來支撐油價走高有4個主要因素：一是歐佩克和俄羅斯聯(lián)合減產(chǎn)仍將繼續(xù)，守衛(wèi)油價復(fù)蘇窗口；二是全球原油庫存回歸5年平均值，助力原油市場重回常態(tài)；三是全球上游投資連續(xù)3年下降導(dǎo)致新增產(chǎn)量受限，與新一輪減產(chǎn)形成協(xié)同效應(yīng)；四是美國致密油產(chǎn)量遞減率增高與成本上升，致使引領(lǐng)非歐佩克國家產(chǎn)量增長能力受限。未來要關(guān)注影響國際油價走勢的3個不確定性因素：一是關(guān)注美伊關(guān)系惡化的可能性；二是關(guān)注委內(nèi)瑞拉經(jīng)濟(jì)持續(xù)惡化導(dǎo)致產(chǎn)量大減；三是關(guān)注美國調(diào)整貨幣政策造成油價階段性回調(diào)的可能性。

2.5 埃博霉素D促進(jìn)TON后大鼠視神經(jīng)中GAP43的持續(xù)表達(dá)

用特異抗體標(biāo)記GAP43檢測應(yīng)用埃博霉素D治療大鼠TON時的視神經(jīng)再生情況，結(jié)果表明：在夾持后3 d時治療組和溶劑對照組中的夾持眼視神經(jīng)均出現(xiàn)大量GAP43的表達(dá)（圖5），其中GAP43聚集在夾持部位并順著軸突的延伸向腦部延伸；隨著繼發(fā)損傷的持續(xù)，夾持后7 d時在治療組中雖然GAP43在損傷軸突中的蔓延表達(dá)情勢減弱但依然可以在夾持部位觀察到GAP43的聚集表達(dá)，而溶劑對照組的GAP43表達(dá)則在整個軸突中均難以檢出；在夾持后28d時治療組依然可以在夾持部位觀察到GAP43的聚集表達(dá)，少量GAP43信號出現(xiàn)在夾持部位的腦部遠(yuǎn)端處，而此時的溶劑對照組則難以檢出GAP43。

3 討論

本研究應(yīng)用埃博霉素D治療大鼠TON，分析治療組相對溶劑對照組在FVEP、視網(wǎng)膜RGC數(shù)目、Tau蛋白與其磷酸化位點(diǎn)pTau-396/404、視神經(jīng)GAP43表達(dá)水平等指標(biāo)上的差異變化，探討治療手段的有效性。研究表明，治療組相對溶劑對照組對TON后視網(wǎng)膜RGC保留數(shù)目上作用明顯，可顯著抑制受損眼視網(wǎng)膜RGC的丟失。TON后受損眼會受到多種不同的分子信號和細(xì)胞因子的作用，激活以神經(jīng)炎癥、興奮性毒性和凋亡為主的級聯(lián)反應(yīng)，繼而發(fā)生RGC的二次退行。在大小鼠TON模型中，視網(wǎng)膜RGC通常會在初次損傷后的3～7 d內(nèi)持續(xù)丟失。在本研究中，溶劑對照組夾持眼初次損傷后3～7 d內(nèi)視網(wǎng)膜RGC的丟失率均達(dá)到平均30%，而此時的埃博霉素D治療組則明顯降低了RGC丟失率，降幅分別為63%和56%；而到28 d時，對照組RGC丟失率漸行增加至平均61%，而治療組在RGC丟失率減低幅度上縮小至37%。通過對降幅的分析發(fā)現(xiàn)，埃博霉素D對RGC的存活效用隨著時間的推移而減弱。雖然埃博霉素D對受損視網(wǎng)膜中RGC有作用，可提高存活率，但是存留的RGC在生理功能(視覺信號傳遞)FVEP的N2波延遲和P2-N2波振幅差指標(biāo)上并未能展現(xiàn)出與溶劑對照組有顯著的改善。上述現(xiàn)象產(chǎn)生原因可能是：（1）FVEP各項(xiàng)指標(biāo)受外部影響因素較多，較少的動物實(shí)驗(yàn)個體難以在統(tǒng)計學(xué)上獲得顯著的組間差異性；（2）動物不同個體對TON損傷和藥物的作用的響應(yīng)均一性較差，難以在FVEP中檢出統(tǒng)計學(xué)差異；（3）RGC的存活與視覺信號通路改善之間的關(guān)系較為復(fù)雜，視神經(jīng)損傷后視力恢復(fù)需要多個條件，首先是避免損傷后的RGCs的死亡；其次是誘導(dǎo)視神經(jīng)的修復(fù)和再生，視神經(jīng)在體內(nèi)保持長距離投射并使其延伸至視神經(jīng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正確腦區(qū)；最后，新生的軸突同靶區(qū)域需要產(chǎn)生突觸且重新建立正確的連接，以便將視覺信號傳輸?shù)酱竽X，最終恢復(fù)視覺生理功能。因此，存活的RGC短期內(nèi)并不一定在視覺功能改善上能有所反映。

從分子層面在視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中分析與埃博霉素D潛在作用相關(guān)的微管穩(wěn)定蛋白Tau的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)埃博霉素D的攝入會顯著增加正常大鼠視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中的總Tau水平，且增加的總Tau并未有發(fā)現(xiàn)磷酸化過度增加的情況，這與慢性神經(jīng)退行性疾病或Tau病模型中運(yùn)用埃博霉素D抑制過量Tau累積和磷酸化的情況有所不同。研究指出埃博霉素D與紫杉醇穩(wěn)定微管的作用機(jī)制類似，他們與微管的內(nèi)部位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，而Tau可以結(jié)合在微管的內(nèi)部與外部。Tau與埃博霉素D在微管的內(nèi)部結(jié)合位點(diǎn)上產(chǎn)生重疊，可產(chǎn)生競爭結(jié)合作用。另一些研究發(fā)現(xiàn)，Tau的外部結(jié)合位點(diǎn)可與埃博霉素類似化合物穩(wěn)定的微管產(chǎn)生協(xié)同作用，Tau可以呈一種低聚物環(huán)的形式綁定包圍在被穩(wěn)定的微管外部。因此在正常神經(jīng)元中，外源增加的微管穩(wěn)定小分子化合物可在與Tau發(fā)生競爭性結(jié)合微管的同時，使得Tau單體在未引發(fā)多聚化和過度磷酸化的前提下以低聚物形式附著于穩(wěn)定的微管外圍，從而導(dǎo)致神經(jīng)元總Tau水平在一定程度上的增加。

TON損傷3 d時，視網(wǎng)膜中溶劑組中Tau蛋白的含量急劇降低，暗示軸突的損傷破壞了RGC的代謝模式，損傷RGC無法正常合成Tau，而此時的Tau并未發(fā)生廣泛地磷酸化，說明胞體中的部分Tau單體可能發(fā)生了泛素化降解或受損RGC已經(jīng)進(jìn)入了凋亡狀態(tài)；在藥物干預(yù)下，視網(wǎng)膜Tau蛋白的水平恢復(fù)至同期假手術(shù)眼水平，其機(jī)制可能是藥物分子增加了微管的穩(wěn)定性，恢復(fù)了部分代謝合成功能，抑制了RGC對損傷的應(yīng)激響應(yīng)和繼發(fā)凋亡，這與本研究中用藥后RGC存活率增加是一致的。在TON后3D軸突中，溶劑組與治療組Tau蛋白的變化水平不明顯，說明埃博霉素D的保護(hù)作用在早期主要針對的是RGC胞體，增加了胞體中Tau蛋白的水平。隨著損傷時間推移至7 d，溶劑對照受損軸突中開始出現(xiàn)Tau累積，其原因可能是崩解的軸突中Tau清除機(jī)制障礙導(dǎo)致多聚化Tau的累積和神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成，而給藥組此時間點(diǎn)卻顯著抑制了軸突中Tau的累積。

目前已有多個針對TON后RGC凋亡現(xiàn)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性藥物/細(xì)胞治療的研究，并展現(xiàn)出了一定的RGC凋亡抑制效果和其他治療效果。且有研究表明，埃博霉素D對中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞凋亡存在抑制作用，可促進(jìn)軸突再生。正常狀態(tài)下的視神經(jīng)軸突中幾乎不表達(dá)GAP43。當(dāng)視神經(jīng)夾持損傷后，夾持部位會自發(fā)誘發(fā)GAP43的表達(dá)，但是這種表達(dá)局限于夾持部位。隨著損傷時間的延續(xù)，GAP43的表達(dá)減弱，且難以穿透夾持部位形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)。本研究中運(yùn)用埃博霉素D治療大鼠TON，發(fā)現(xiàn)在28 d時間點(diǎn)依然可以在夾持部位觀察到GAP43的表達(dá)，且部分再生的視神經(jīng)可穿透夾持部位的神經(jīng)纖維纏結(jié)，表明存在部分神經(jīng)再生。然而值得注意的是，埃博霉素D促再生的程度有限，GAP43并未有廣泛的深入至受損軸突遠(yuǎn)端處，這也可能是FVEP檢測不到顯著改善的原因之一。