硫氧還蛋白還原酶1（TrxR1）屬于吡啶核苷酸二硫化物氧化還原酶家族，作為目前已知的唯一能夠還原硫氧還蛋白（Trx）的酶，TrxR1可以將氧化型的Trx還原成還原型Trx。還原型的Trx能夠還原多種蛋白的二硫鍵，進而調控細胞的多種生物進程，如細胞增殖、分化以及凋亡等等。

桁架平臺提升過程需分段進行，每提升10～15m進行一次檢查，須確保桁架平臺及電動施工升降平臺無異常狀況后方可繼續(xù)提升。

腫瘤細胞的代謝水平遠高于正常細胞，因而在細胞內會產生大量活性氧。因此，腫瘤細胞往往會通過誘導抗氧化酶的表達來維持自身的氧化還原穩(wěn)態(tài)，而TrxR1是其中一種被誘導的抗氧化酶。近年來研究發(fā)現，TrxR1在多種腫瘤組織和細胞中高表達，如乳腺癌、胃癌、肺癌和腸癌等，并通過蛋白激酶B（PKB,又名AKT）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）及信號傳導及轉錄激活蛋白3（Stat3）等信號通路促進腫瘤細胞增殖、抑制凋亡及誘導耐藥，是一個理想的抗腫瘤藥物開發(fā)靶點。目前靶向TrxR1的藥物具有豐富的骨架結構，但尚無進入臨床使用的TrxR1靶向藥物，其中一大制約因素就是缺乏在藥物篩選早期可以快速準確評價藥物特異性的細胞模型。

我們在前期研究中發(fā)現，通過小干擾RNA（siRNA）降低腫瘤細胞中TrxR1的表達水平，可以協同增強TrxR1抑制劑的抗腫瘤及TrxR1酶抑制活性。該協同作用可以有效區(qū)分特異性TrxR1抑制劑和非特異性TrxR1抑制劑，但是短期干擾基因表達存在干擾時間短，影響因素多等缺點，很難用于快速高通量特異性TrxR1抑制劑篩選。而構建具有酶活力的TrxR1過表達細胞可以克服上述短期干擾基因表達的缺點，可能是一種理想的TrxR1藥物篩選的細胞模型。

而基于人類免疫缺陷病毒1（HIV-1）型病毒構建的慢病毒載體可以高效感染處于分裂期和非分裂期的細胞，能夠攜帶大片段基因，且不易誘發(fā)宿主免疫反應，更重要的是能將目的基因高效整合到宿主細胞染色體中，不易引起插入突變，理論上能夠在細胞內永久表達并在子代中穩(wěn)定表達目的基因，而且改造后的慢病毒的假病毒沒有復制能力，具有較好的生物安全性，有廣泛的細胞感染譜，因此是一種理想的基因轉移載體。HEK293細胞是一種細胞轉染常用工具細胞，具有轉染效率高，易于培養(yǎng)等特點。而我們在前期實驗中也發(fā)現HEK293細胞相較于其他腫瘤細胞以及工具細胞TrxR1表達最低，適用于構建TrxR1過表達細胞株。

2.2.2 Western blotting檢測TrxR1的蛋白表達情況 通過Western blot，我們發(fā)現HEK293和HEK293-NC兩株細胞中的TrxR1 蛋白表達量近乎一致，且顯著低于HEK293-TrxR1-OE細胞株的TrxR1蛋白表達量，分別為其0.02和0.05倍（圖2B、C）。

1 材料和方法

1.1 材料

采用經典的分子克隆方法，將基因片段連接到慢病毒載體上，并轉化入大腸桿菌Stbl3，挑選陽性克隆菌落進行初步的雙酶切鑒定之后，進行DNA測序，獲得插入了目的基因的重組慢病毒表達載體：pLVXPuro-TXNRD1載體。序列圖譜如圖1所示。

1.1.2 試劑 二甲基亞砜（DMSO）、甘氨酸、過硫酸銨（APS）、丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉（SDS）、N，N，N，N'-四甲基乙二胺（TEMED）、Tris、NADPH、胰島素、乙二胺四乙酸（EDTA）、大鼠肝臟硫氧還蛋白還原酶和重組人硫氧還蛋白（Sigma-Aldrich）。Cell Counting Kit-8（CCK-8）細胞增殖檢測試劑盒（Dojindo）。兔單克隆抗人TrxR1抗體（Abcam）。Trizol、DMEM培養(yǎng)基、PBS、0.25%胰酶-EDTA消化液、青霉素-鏈霉素雙抗、胎牛血清（FBS）、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記兔抗鼠IgG、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG、蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物和BCA 蛋白測定試劑盒、蛋白分子量marker試劑（Thermo Fisher Scientific），蛋白上樣緩沖液和RIPA裂解緩沖液（碧云天）。PVDF膜（Millpore）。RNA反轉錄試劑盒、TB-green定量PCR試劑盒（Takara），細胞培養(yǎng)板（Corning）。

1.2.5 重組細胞株細胞內TrxR1酶活力測定 蛋白質過表達不一定引起酶活力上升，為了驗證我們構建的HEK293-TrxR1-OE細胞株TrxR1是否有活力，分別將HEK293、HEK293-NC 以及HEK293-TrxR1-OE 細胞25萬/孔鋪于六孔板，37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。將細胞消化收集、裂解、提取蛋白，BCA定量。將提取的蛋白采用終點胰島素法來測定細胞內TrxR1酶活力。20 μg蛋白和50 μL含有0.3 mol/L胰島素，660 μmol/L NADPH，3 mol/L EDTA以及1.3 μmol/L重組人Trx蛋白的pH為7.6的100 mol/L Tris緩沖液在37 ℃孵育1 h。加入200 μL pH為8.0的含有1 mol/L DTNB的6 mol/L鹽酸胍溶液終止孵育。使用BioTek Cytation5酶標儀檢測，設置為化學顯色模式，設置波長為412 nm。相同條件下，使用梯度稀釋的大鼠肝臟TrxR1蛋白（218.57 U/mg，Sigma）繪制標準曲線，計算各細胞中TrxR1的酶活力。

1.2 方法

以故宮的五彩蝴蝶瓶為例，除去其排版上的失誤，譯文并沒有傳達出文物解說詞的文化內涵，而是大篇幅描述了五彩蝴蝶紋瓶的外觀等自然屬性。中國古代瓷器裝飾題材極為豐富，大多“圖必有意，意必吉祥?！薄暗迸c“耋”諧音，“耋”意為七八十歲的年紀，泛指老年，以“百蝶”寓長壽之意。而對相同題材的蝴蝶瓶描述，大都會博物館則用精煉的一句話描述了其文化含義，象征意義：The Chinese term for butterfly (hudie) is also a rebus for the accumulation of blessings.(Vase with Butterflies)

1.2.2 細胞轉染及細胞系篩選 將空載慢病毒pLVXPuro和重組慢病毒pLVX-Puro-TXNRD1病毒液冰浴融解，與完全培養(yǎng)基1∶1混合，加入終濃度為3 μg/mL的聚凝胺（Polybrene），輕柔混勻，覆蓋HEK293細胞，放置于37 ℃、5%CO環(huán)境中培養(yǎng)過夜。次日，移除含病毒的培養(yǎng)基，加入新鮮的培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO環(huán)境中培養(yǎng)，并使用含嘌呤霉素（Puro）以及10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基進行篩選純化，將用pLVXPuro-TXNRD1 病毒液轉染后的實驗組細胞命名為HEK293-TrxR1-OE，pLVX-Puro病毒液轉染后的對照組細胞命名為HEK293-NC。

選取原發(fā)性高血壓患者100例,時間為2016年2月-2017年1月,根據其治療方案的差異分組,50例為一組。

1.2.1 目的基因片段的制備與慢病毒載體構建 利用PCR技術擴增基因（基因名：，mRNA序列號：NM_182729.3）片段，然后將PCR產物進行DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收。取目的基因的凝膠回收產物與慢病毒載體pLVX-Puro用限制性內切酶XhoI/EcoRI進行雙酶切，并將酶切產物回收，分別進行連接反應，得到基因的重組慢病毒連接產物。用感受態(tài)細胞對連接產物進行轉化，將轉化液涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜；次日，從各平板上挑取單菌落，進行質粒DNA的提取與雙酶切凝膠電泳鑒定。挑選陽性克隆菌落對應的菌液培養(yǎng)過夜，將質粒抽提后進行DNA測序鑒定（由通用生物（安徽）股份有限公司通過Sanger 雙脫氧測序法完成）。獲得pLVX-Puro-TXNRD1重組慢病毒。

1.2.3 RT-qPCR 收集適量重組HEK293細胞，加入適量裂解液（Trizol）裂解后，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清液；再加入異丙醇，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取RNA沉淀。以75%乙醇清洗2次，檢測RNA濃度。RT-qPCR實驗采用Takara試劑，反轉錄的條件按照試劑說明書操作，首先根據樣品濃度取RNA 1 μg，42 ℃置于PCR 儀上2 min，去除全基因組DNA干擾。然后進行反轉錄，將10 μL的步驟1的反應液和試劑盒內的試劑混合后37 ℃置于PCR儀上15 min，隨后于85 ℃保持5 s終止反應，最后將反轉錄產物于-20 ℃保存?zhèn)溆?。通過TB Green 試劑盒采用2法進行RT-qPCR 檢測TrxR1 在HEK293、HEK293-NC、HEK293-TrxR1-OE細胞株中的表達量。內參基因為GAPDH。引物序列如下：TrxR1-F：AGCTCAGTCCACCAATAGTGA，TrxR1-R：GGTATTTTTCCAGTCTTTTCAT；GAPDH-F：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，GAPDH-R：AGGG GCCATCCACAGTCTTC。

李彬[65]針對地方國有糧食企業(yè)，指出內部控制的主要內容。在公司層面，要設計合理的內部控制組織架構，建立健全決策機制；在業(yè)務層面，需要在收入支出、糧食采購儲備、資產管理、合同管理、倉儲管理和安全生產方面建立健全內部控制。宋芳[66]提出完善內部控制除了要關注管理機構、內部機構，還需要建立有效的激勵機制，注重企業(yè)文化、提高企業(yè)內部會計控制管理。劉玉靜[67]提出強化國有糧食企業(yè)內部控制需要單位負責人率先垂范，加強對內部人員的監(jiān)督和內部審計，建立有效的會計系統，強化外部監(jiān)督。

1.2.4 Western blot檢測重組細胞株TrxR1蛋白的表達細胞消化計數，接種小皿中，培養(yǎng)24 h后觀察細胞貼壁狀態(tài)及融合度，待細胞長滿后蛋白提取。收集細胞，離心，棄上清，加裂解液適量，冰上裂解，裂解完全后12 000 r/min離心10 min。BCA定量。使用4%～20%的梯度SDS-PAGE電泳分離30 μg總蛋白，將蛋白300 mA恒流轉移至PVDF 膜，5%（）BSA（溶解于含有0.1%Tween-20的TBS溶液中，TBST）室溫封閉2 h，去離子水清洗膜后加入抗人TrxR1抗體后4 ℃孵育過夜。次日，將膜清洗3遍，5 min/次，分別加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG和兔抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，將膜再次清洗3 遍，5 min/次，使用顯影液孵育，在Chemical Doc Touch凝膠成像系統中成像拍照。使用ImageJ軟件對照片灰度值進行定量。

新的改革，往往缺乏實際操作和有效的執(zhí)行能力。從實際操作層面來看，政府會計制度已經公布，未來事業(yè)單位會計將更加復雜。會計的兩套報告，一套滿足財務管理需求，另一套則滿足事業(yè)單位的管理需求。在常規(guī)會計制度的框架內，財務人員的專業(yè)判斷力不斷提高。

1.2.6 重組細胞株細胞內TrxR1酶活力的成像分析 通過特異性TrxR1酶活力熒光探針TRFS-green分別檢測HEK293，HEK293-NC和HEK293-TrxR1-OE活細胞中的TrxR1酶活力。分別將HEK293、HEK293-NC以及HEK293-TrxR1-OE細胞25萬/孔鋪于六孔板中，37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h加入10 μmol/L TRFS-green探針，培養(yǎng)4 h。使用EVOS FL熒光顯微鏡拍照，通過平行試驗使用Novocyte流式細胞儀定量熒光強度。

1.2.7 重組細胞株的功能檢測 為了研究HEK293-TrxR1-OE細胞是否適用于靶向TrxR1抗腫瘤藥物的篩選，按照上述TrxR1酶活檢測方法，檢測TrxR1特異性抑制劑auranofin對HEK293，HEK293-NC和HEK293-TrxR1-OE細胞中TrxR1酶活力的抑制活性。細胞過夜培養(yǎng)后，加入含有auranofin的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。對照孔為與auranofin等體積的DMSO。數據按照對照孔數值歸一化處理。

進一步采用CCK8 實驗分別檢測auranofin 對HEK293，HEK293-NC和HEK293-TrxR1-OE細胞的增殖抑制作用。96孔細胞培養(yǎng)板中每孔接種2000個細胞，培養(yǎng)12 h。實驗組加入指定濃度的auranofin。對照組給予相同體積的DMSO?？瞻捉M為不含細胞的細胞培養(yǎng)基。藥物刺激24 h后，每孔加入10 μL CCK8試劑，37 ℃孵育2 h。使用酶標儀于450 nm測量吸光值用以計算細胞增殖力：細胞增殖抑制率=（-）/（-）×100%。

1.3 統計學處理

統計學分析采用SPSS 18.0 軟件，數據皆采用均數±標準差表示，采用單因素方差分析法進行多組間比較。＜0.05為差異有統計學意義，實驗獨立重復3次。

2 結果

2.1 載體構建的鑒定

1.1.1 儀器 CO培養(yǎng)箱和酶標儀（Thermo Fisher），熒光倒置顯微鏡（Olympus），小型垂直電泳儀和多功能凝膠成像系統（Bio-Rad），Novocyte流式細胞儀（安捷倫）。

2.2 HEK293-TrxR1-OE穩(wěn)轉細胞株系的鑒定

在相同濃度的TRFS-green探針作用相同時間后，HEK293-TrxR1-OE 細胞中的綠色熒光顯著強于HEK293 和HEK293-NC 細胞（熒光強度HEK293：19 800.33±777.70 AU；HEK293-NC：20 089.00±694.20 AU；HEK293-TrXR1-OE：43307.33±810.6AU，＜0.005，圖3）。

因此，本研究運用慢病毒載體構建穩(wěn)定過表達含硒蛋白TrxR1的HEK293細胞株，系首次在體外成功構建無需添加硒元素培養(yǎng)的硒蛋白過表達細胞株，為含硒蛋白生物學功能的研究提供了借鑒。并且通過RT-qPCR、Western blot、胰島素終點法以及TRFS-green探針成像證實過表達的內源性TrxR1具有酶活力，而該細胞模型進一步驗證了我們的前期研究發(fā)現，利用該細胞模型以及對照HEK293 細胞將可快速準確篩選特異性TrxR1靶向藥物，為TrxR1 靶向藥物研究提供有效的篩選模型。

2.2.3 HEK293-TrxR1-OE細胞株細胞內TrxR1酶活力測定 通過胰島素終點法，我們對HEK293、HEK293-NC以及HEK293-TrxR1-OE細胞中的TrxR1酶活力進行了測定（表1）。HEK293 和HEK293-NC 細胞中TrxR1的酶活分別為0.25±0.04和0.32±0.04 U/mg，而HEK293-TrxR1-OE細胞中TrxR1的酶活力則為1.14±0.17 U/mg，遠高于HEK293和HEK293-NC細胞。

2.2.1 RT-qPCR檢測TrxR1的mRNA表達情況 提取細胞株中的總RNA 進行RT-qPCR 分析，我們發(fā)現HEK293-TrxR1-OE細胞株中TrxR1的mRNA表達量顯著高于HEK293和HEK293-NC兩株細胞，分別約為HEK293 和HEK293-NC 細胞的2.32 和3.36 倍（＜0.005，圖2A）。

2.2.4 重組細胞株的增殖毒性能力檢測和細胞內TrxR1酶活測定 TrxR1 酶活力的抑制效率結果顯示auranofin 對于過表達具有酶活力TrxR1 的HEK293-TrxR1-OE 細胞中的TrxR1 酶活力的抑制效率（IC：5.14±0.33 μmol/L）相較于HEK293 以及HEK293-NC細胞顯著下降（IC分別為1.21±0.07 μmol/L 和1.20±0.05 μmol/L，圖4A）。上述3株細胞的增殖抑制結果顯示auranofin對HEK293-TrxR1-OE細胞的增殖抑制作用（IC：2.78±0.35 μmol/L）相較于HEK293以及HEK293-NC 細胞顯著下降（IC分別為0.30±0.05 μmol/L 和0.25±0.03 μmol/L，圖4B）。

結合當前已有研究成果和筆者實地調查，三峽庫區(qū)農業(yè)面源污染主要來源自農業(yè)生產和農村生活，主要包括農田種植、畜牧養(yǎng)殖和居民點生活污染，具體有化肥、農藥等農用化學品的使用，農田地表徑流，農作物秸稈和旱坡地水土流失，畜禽養(yǎng)殖廢物、農村生活污水以及農村生活垃圾等固體廢物污染，具體發(fā)生過程如圖1所示。

3 討論

本研究通過經典方法構建TrxR1蛋白過表達的慢病毒載體，選取HEK293作為轉染對象，并通過篩選出的最佳的嘌呤霉素濃度對轉染細胞進行篩選，最后獲得穩(wěn)定過表達TrxR1的細胞株。通過RT-qPCR實驗，我們發(fā)現HEK293-TrxR1-OE細胞中TrxR1的mRNA表達水平相較于正常HEK293以及對照HEK293-NC細胞可以分別上升2.32和3.36倍。不僅如此，我們通過Western blot實驗發(fā)現該細胞中TrxR1的蛋白表達水平相較于正常HEK293以及對照HEK293-NC細胞也顯著上升，證明通過所構建的TrxR1過表達慢病毒載體可以在HEK293細胞中顯著增加TrxR1的mRNA和蛋白表達。而通過胰島素終點法去檢測內源性TrxR1酶活力，我們發(fā)現證明該細胞中的TrxR1酶活力也同樣顯著上升，分別達到了正常HEK293和對照HEK293-NC細胞的4.56 倍和3.56 倍。不僅如此，我們利用TRFSgreen探針成像，也發(fā)現HEK293-TrxR1-OE細胞內的平均熒光強度顯著提高，分別達到了正常HEK293和對照HEK293-NC細胞的2.19倍和2.15倍。TRFS-green探針是第一代TrxR1特異性小分子熒光探針，該探針的作用原理是會經由TrxR1剪切其分子結構中的二硫鍵而暴露所含熒光基團萘二甲酰亞胺發(fā)出綠色熒光，并且該探針對細胞內主要含硫醇物質GSH和蛋白質的半胱氨酸殘基以及內源性還原劑維生素C和NADPH無反應，因而可以特異性檢測細胞內TrxR1的酶活力，而TRFS-green探針成像的結果也進一步說明HEK293-TrxR1-OE 細胞中的TrxR1 具有較高的酶活力。因此，利用慢病毒載體構建的HEK293-TrxR1-OE細胞可以穩(wěn)定過表達具有酶活力的TrxR1，相較于國外之前類似的報道，需要在培養(yǎng)基中加入硒鹽才可以刺激細胞產生具有酶活力的TrxR1，簡化了細胞的培養(yǎng)條件，更利于后續(xù)實驗的穩(wěn)定開展。

此款洗衣機創(chuàng)新研發(fā)帶有水質檢測的智能投放系統，內置多種智能傳感器，可自動感知水質硬度、衣物重量、臟污程度，針對不同面料，自動添加并控制洗衣液、柔順劑的投放量，提供新的洗護體驗。

HEK293-TrxR1-OE細胞的構建也擴展了在體外進一步研究類似TrxR1的含硒蛋白功能的的可能性。比如彭波等人通過構建過表達含硒蛋白SelK的腫瘤細胞株，發(fā)現SelK能促進胞漿中游離鈣離子濃度的升高，進而引起腫瘤細胞發(fā)生凋亡，同時降低細胞與基質之間的黏附力和細胞的遷移能力，初步闡明SelK的生物學功能，也為腫瘤的治療提供了新的潛在靶點。以及劉侃等人通過構建攜帶SEPP1 基因的重組慢病毒載體，并使用其感染ccRCC 細胞株，進一步研究SEPP1 基因的過表達在腎癌細胞增殖中發(fā)揮的作用，發(fā)現SEPP1過表達細胞增殖能力明顯降低、克隆形成能力明顯降低，SEPP1過表達引起腎癌細胞G2/M期阻滯，探討了SEPP1與腫瘤發(fā)生、增殖的關系，為研究SEPP1 與腫瘤轉移和預后的關系奠定了基礎。以上研究也證明雖然含硒蛋白的翻譯機制仍待探索，但是越來越多類似HEK293-TrxR1-OE細胞的構建將為研究含硒蛋白的代謝，合成以及生物學功能提供物質基礎。

而基于前期研究結果，降低腫瘤細胞內TrxR1表達量與特異性TrxR1抑制劑活性存在協同作用，為了初步研究HEK293-TrxR1-OE細胞是否適用于靶向TrxR1抗腫瘤藥物的篩選，我們進一步通過TrxR1特異性抑制劑auranofin 在正常HEK293、對照細胞HEK293-NC以及HEK293-TrxR1-OE細胞中對TrxR1酶活力的抑制效率以及抗增殖作用進行了分析，發(fā)現auranofin對HEK293-TrxR1-OE細胞中TrxR1酶活力的抑制效率以及抗增殖作用相較于HEK293 以及HEK293-NC細胞均顯著下降，說明auranofin通過抑制TrxR1活性抑制細胞的增殖，而過表達具有酶活力的TrxR1會導致TrxR1抑制劑對其抑制效率下降，因此利用TrxR1過表達及其對照細胞作為細胞模型，可以通過TrxR1酶活及細胞增殖檢測快速準確確定靶向TrxR1藥物的特異性，這將大大縮短靶向TrxR1藥物的早期篩選流程。而聯合TrxR1基因敲除細胞等細胞模型也將進一步提升藥物篩選的準確性。比如羅昕等通過CRISPR-Cas9技術構建SF3B1突變等位基因敲除的Mel202 SF3B1 mut-KO 單克隆細胞株用于攜帶SF3B1 突變的葡萄膜黑色素瘤的藥物篩選，經過對Targetmol公司的已知活性化合物庫（L1000）和上市藥物庫（L4000）約5000個化合物進行篩選后，發(fā)現13個化合物對SF3B1突變的Mel202細胞具有良好的選擇性抑制活性，而后期研究進一步發(fā)現這13個化合物中的tetrandrine和lapatinib是良好的靶向SF3B1突變的先導化合物。而Huang等曾報道利用p53-EGFP報告基因系統，在DLD1直腸癌細胞中篩選恢復p53通路的小分子化療藥物。Wang等構建穩(wěn)定表達PGL3-luc的直腸癌SW480細胞，用于恢復p53轉錄活性化合物的篩選。胡琳珊等選擇人直腸癌細胞HCT116和骨肉瘤細胞U2-OS，構建HCT16-p53BS-Luc/Renilla和U2-OS-p53BS-mCherry兩種細胞模型，同時證明了已知的p53靶向小分子CDDP，Dox和Nutlin-3在這兩種模型中均可激活p53信號通路。以上研究證明構建基因編輯細胞株作為藥物篩選模型可以快速準確獲得先導化合物，縮短新藥研發(fā)的周期。

綜上所述，本研究通過慢病毒載體成功建立TrxR1 穩(wěn)定過表達HEK293細胞，而該細胞穩(wěn)定過表達的TrxR1蛋白同樣具有高酶活力，可作為細胞模型快速準確篩選特異性TrxR1 靶向藥物和基因功能，推進TrxR1靶向藥物的研發(fā)，用于篩選各種靶向TrxR1的藥物，為相關藥物的研發(fā)提供參考。