肖鳳琴 劉 暉 楊亦柳 于 倩 李 佳 張紅印 邵 帥 李光哲 嚴(yán)銘銘,2

(1. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2. 吉林省中藥保健食品科技創(chuàng)新中心，吉林 長(zhǎng)春 130117)

酸棗仁為鼠李科植物酸棗干燥成熟的種子，是衛(wèi)生部頒布的第一批藥食同源藥物，富含皂苷、生物堿、黃酮、酚酸、脂肪油以及多糖等多種成分，在改善睡眠、抗焦慮、改善記憶、抗氧化方面具有良好的藥理活性，臨床上常被用于治療失眠等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1-2]。

研究[3-4]表明，酸棗仁中的黃酮類、皂苷類、酚酸類以及脂肪酸類成分具有良好的抗氧化活性。而有關(guān)酸棗仁皮部位、仁部位的抗氧化活性研究尚未見報(bào)道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁具有良好的抗氧化活性，且酸棗仁皮部位治療失眠的作用優(yōu)于仁部位。

研究擬探討生熟酸棗仁的皮、仁、全棗仁對(duì)超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除率及對(duì)鐵離子的還原能力，并對(duì)其成分進(jìn)行分析，旨在為酸棗仁作為天然抗氧化劑開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

紫外—可見分光光度計(jì)：UV-1700型，日本島津公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-6型，金壇市佳美儀器有限公司；

電子天平：AB135-S型，瑞士Mettler Toledo公司；

電子天平：MS303S型，奧豪斯儀器有限公司；

超聲波清洗器：KQ-205B型，昆山市超聲儀器有限公司；

低速臺(tái)式離心機(jī)：DT5-2B型，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；

高效液相色譜儀：Agilent1260型，美國(guó)Agilent Technologies公司；

粉碎機(jī)：MFJ-W300型，北京利仁科技股份有限公司；

多功能酶標(biāo)儀：Infinite M200pro型，瑞士Tecan公司。

1.2 材料與試劑

酸棗仁：河北仁心藥業(yè)有限公司；

DPPH：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

Tris-HCl：分析純，廣州賽國(guó)生物科技有限公司；

鄰苯三酚：分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

鄰二氮菲、K3Fe(CN)6：分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司；

FeCl3：分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；

三氯乙酸：分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；

人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 按2020版《中華人民共和國(guó)藥典》中的炮制方法對(duì)酸棗仁進(jìn)行炒制[5]，制得熟酸棗仁。將生熟酸棗仁進(jìn)行剝離，分別得到相應(yīng)的皮和仁共6種樣品：生、熟酸棗仁(全棗仁)，生、熟酸棗仁(仁)，生、熟酸棗皮(皮)。

1.3.2 體外抗氧化活性研究

(1) 樣品制備：精密稱取生熟酸棗仁的皮部位、仁部位和全棗仁(過四號(hào)篩)各2 g，加入70%乙醇20 mL回流提取2 h，提取液轉(zhuǎn)移至50 mL試管中，濾渣用5 mL體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇洗滌，合并洗液與濾液，離心，取上清液，并用70%乙醇定容至25 mL。

(1)

式中：

C——自由基清除率，%；

A0——空白對(duì)照組吸光度值；

A1——樣品組吸光度值；

A2——樣品對(duì)照組吸光度值。

(3) 羥基自由基(·OH)清除率測(cè)定：參照張思頡等[7]的方法并修改。取鄰二氮菲溶液1 mL于各試管，加入2 mL PBS溶液，1 mL樣品液，混勻后加入1 mL FeSO4溶液，混勻，加入1 mL H2O2溶液，混勻。37 ℃水浴1 h，測(cè)定536 nm處吸光度值A(chǔ)1，用蒸餾水調(diào)0。以1 mL蒸餾水代替樣品液測(cè)得A2；以1 mL蒸餾水代替H2O2溶液測(cè)得A0。按式(2)計(jì)算·OH清除率。

(2)

式中：

C——羥基自由基(·OH)清除率，%；

A0——空白對(duì)照組吸光度值；

A1——樣品組吸光度值；

A2——樣品對(duì)照組吸光度值。

(4) DPPH自由基清除率測(cè)定：參照張雪嬌等[8]的方法并修改。于96孔板中加入樣品溶液100 μL，再加入DPPH溶液100 μL，渦旋混勻。暗室反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm處吸光度值A(chǔ)1；以100 μL甲醇代替DPPH溶液作為樣品對(duì)照組，測(cè)定吸光度值A(chǔ)2。按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(5) ABTS自由基清除率測(cè)定：參照張雪嬌等[8]的方法并修改，取0.4 mL ABTS工作液，用pH為7.4的PBS溶液稀釋，常溫下734 nm處吸光值為(0.7±0.2)。將0.2 mL ABTS工作液與10 μL不同濃度樣品混合，常溫避光反應(yīng)6 min，測(cè)定734 nm處吸光度，平行3次。按式(3) 測(cè)定ABTS自由基清除率。

(3)

式中：

C——ABTS自由基清除率，%；

A1——樣品+ABTS溶液吸光度值；

A0——PBS溶液+ABTS溶液的吸光度。

(6) FRAP還原能力測(cè)定：取樣品液2.5 mL，分別加入PBS溶液2.5 mL，1% K3Fe(CN)6溶液2.5 mL，混勻，50 ℃水浴20 min，取出后迅速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加蒸餾水2.5 mL，0.1% FeCl3溶液0.5 mL，搖勻，靜止10 min，測(cè)定700 nm處吸光度值A(chǔ)1，以2.5 mL蒸餾水代替樣品溶液作為樣品對(duì)照組，測(cè)得A2，以蒸餾水作空白調(diào)0，按式(4)計(jì)算還原能力大小[9]。

C=A1-A2，

(4)

式中：

C——還原能力；

A1——樣品組吸光度值；

A0——樣品對(duì)照組吸光度。

1.3.3 不同組織部位成分差異性分析

(1) 總黃酮含量測(cè)定：取生熟酸棗仁的全棗仁、皮和仁粉末(過四號(hào)篩)各2 g，參照2020版《中國(guó)藥典》中大豆黃卷總黃酮含量測(cè)定方法，以蘆丁為對(duì)照品，以相應(yīng)試劑為空白。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中總黃酮含量。

(2) 總皂苷含量測(cè)定：取生熟酸棗仁的全棗仁、皮和仁粉末(過四號(hào)篩)各2 g，參照2020版《中國(guó)藥典》中人參莖葉總皂苷含量測(cè)定方法，以人參皂苷Re為對(duì)照品，以相應(yīng)試劑為空白。根據(jù)人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中總皂苷含量。

(3) 總多糖含量測(cè)定：取生熟酸棗仁的全棗仁、皮和仁粉末(過四號(hào)篩)各2 g，參照2020版《中國(guó)藥典》中玉竹總多糖含量測(cè)定方法，以無水葡萄糖為對(duì)照品，以相應(yīng)試劑為空白。根據(jù)無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中總多糖含量。

(4) 總酚酸含量測(cè)定：取生熟酸棗仁的全棗仁、皮和仁粉末(過四號(hào)篩)各2 g，參照2020版《中國(guó)藥典》中大血藤總酚酸含量測(cè)定方法，以沒食子酸為對(duì)照品，以相應(yīng)試劑為空白。根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中總酚酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性

2.1.1 超氧陰離子清除率 超氧陰離子可誘導(dǎo)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA的氧化損傷，在活性氧的形成中起重要作用，因此可通過測(cè)定抗氧化劑的超氧陰離子清除率來評(píng)價(jià)其抗氧化能力[10]。由圖1可知，生熟酸棗仁不同組織部位均對(duì)超氧陰離子具有一定的清除作用，其中生酸棗仁(全棗仁)的清除能力最強(qiáng)；熟酸棗仁(皮)和(仁)的清除能力強(qiáng)于生酸棗仁(皮)和(仁)部位，表明炮制后提高了酸棗仁(皮)和(仁)對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用。

圖1 生熟酸棗仁不同組織部位的超氧陰離子自由基清除率Figure 1 Determination results of superoxide anion clearance in different tissue parts of raw and ripe ziziphi spinosae semen

2.1.2 羥基自由基清除率 羥基自由基能殺死紅細(xì)胞，降解DNA、細(xì)胞膜和多糖化合物，是毒性最大的氧自由基[11]。由圖2可知，生熟酸棗仁不同部位對(duì)羥自由基的清除率不同,其中，仁部位對(duì)羥基自由基的清除率最弱，皮的最高，其次為全棗仁，且熟制的各樣品的清除率高于生品。

圖2 生熟酸棗仁不同組織部位的羥基自由基清除率Figure 2 Determination results of hydroxyl radical scavenging rate in different tissue parts of raw and ripe ziziphi spinosae semen

2.1.3 DPPH自由基清除率 由圖3可知，生熟酸棗仁各組織部位對(duì)DPPH自由基均具有一定的清除能力，其中皮的清除力高于相應(yīng)的全棗仁與仁。

圖3 生熟酸棗仁不同組織部位的DPPH自由基清除率Figure 3 Determination results of DPPH radical scavenging rate in different tissue parts of raw and ripe ziziphi spinosae semen

2.1.4 ABTS自由基清除率 由圖4可知，酸棗仁各樣品對(duì)ABTS自由基均具有較好的清除力；其中酸棗仁(皮)對(duì)ABTS自由基的清除作用高于全棗仁與仁，且熟酸棗仁的清除率整體高于生酸棗仁。

圖4 生熟酸棗仁不同組織部位的ABTS自由基清除率Figure 4 Determination results of ABTS radical scavenging rate in different tissue parts of raw and ripe ziziphi spinosae semen

2.1.5 FRAP還原能力 還原能力可以用來評(píng)價(jià)試驗(yàn)樣品的抗氧化能力，吸光度值越大，抗氧化劑的抗氧化能力越強(qiáng)[12]。由圖5可知，各樣品均具有一定的還原能力，其中酸棗仁(皮)的還原能力高于全棗仁與仁，生熟酸棗仁(仁)的還原能力較對(duì)應(yīng)的全棗仁與皮稍弱。

圖5 生熟酸棗仁不同組織部位的FRAP還原能力Figure 5 Determination results of FRAP reduction ability in different tissue parts of raw and ripe ziziphi spinosae semen

綜上，酸棗仁各部位對(duì)超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基及ABTS自由基的清除能力大小均為皮>全棗仁>仁；且酸棗仁(皮)的還原能力強(qiáng)于對(duì)應(yīng)的全棗仁與仁。因此，酸棗仁各部位的抗氧化能力強(qiáng)弱為皮>全棗仁>仁，酸棗仁炮制前后的抗氧化活性并無明顯區(qū)別。

2.2 酸棗仁不同組織部位的成分含量

由表1可知，生酸棗仁(皮)中總黃酮含量最高，各樣品仁中總黃酮含量整體低于全棗仁與皮；各樣品皮中總皂苷、總酚酸含量高于全棗仁與仁；各樣品中總多糖含量相近，全棗仁與皮中的多糖含量高于仁；酸棗仁炮制前后各樣品中總皂苷、總黃酮、總酚酸以及總多糖含量未發(fā)生明顯變化。

表1 生熟酸棗仁不同組織部位的成分含量Table 1 Determination results of chemical components in different tissue parts ofraw and ripe ziziphi spinosae semen mg/g

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，酸棗仁不同組織部位均具有良好的抗氧化活性，其中酸棗仁(皮)的抗氧化活性強(qiáng)于全棗仁與仁的，且酸棗仁(皮)中總黃酮、總皂苷、總酚酸含量均高于酸棗和仁，可初步推測(cè)酸棗仁(皮)中起抗氧化活性作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為黃酮、皂苷和酚酸類成分；此外，酸棗仁炮制前后抗氧化活性無明顯差別。后續(xù)可采用不同研究方法對(duì)酸棗仁各組織部位進(jìn)行體內(nèi)抗氧化活性研究。