王在凡，王蕊，李海濤

調(diào)查顯示，鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）患病率居耳鼻喉頭頸部惡性腫瘤第1 位，具有易浸潤(rùn)性、高轉(zhuǎn)移性、易復(fù)發(fā)等多種特點(diǎn)［1-2］，但目前臨床尚未完全明確NPC 的病因及發(fā)生機(jī)制。相關(guān)研究指出，Trop2 在人體正常細(xì)胞中呈相對(duì)低表達(dá)狀態(tài)，但在結(jié)腸癌、肺鱗癌等多種腫瘤組織中呈異常高表達(dá)［3］。USP22 作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志家族中重要成員，具有去泛素化作用，可利用底物靶分子的去泛素化修飾作用，達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞多種基因轉(zhuǎn)錄的目的［4］。目前臨床實(shí)踐已發(fā)現(xiàn)USP22、Trop2 在肺癌、腸癌、胃癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)［5］。但二者在NPC 中相關(guān)研究鮮有報(bào)道。鑒于此，本研究以USP22、Trop2 蛋白表達(dá)為觀察指標(biāo)，旨在探討其與NPC 病人臨床病理特征的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響。具體分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料從2014 年1 月至2016 年6 月于安陽(yáng)市眼科醫(yī)院就診的鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）病人中選取符合后述入排標(biāo)準(zhǔn)的病人92 例及對(duì)應(yīng)的組織標(biāo)本作為觀察組，其中男70 例，女22 例，年齡（50.95±5.21）歲，范圍為40～68 歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）（22.84±2.03）kg/m2，范圍為18.5～27.6 kg/m2；其中76 例鱗狀細(xì)胞癌，1 例黏液表皮樣癌，7例淋巴上皮瘤樣癌，4例腺癌，2例柱狀細(xì)胞癌，2 例腺樣囊性癌；另選取同期通過(guò)病理檢驗(yàn)排除鼻咽癌而被確診為慢性鼻咽炎病人及其組織標(biāo)本95例作為對(duì)照組，其中男72 例，女23 例，年齡（51.27±4.98）歲，范圍為41～69 歲；BMI（23.15±2.14）kg/m2，范圍為18.3～27.8 kg/m2。兩組基本資料（年齡、性別、BMI）均衡可比（t=0.43，P=0.668；χ2=0.00，P=0.962；t=1.02，P=0.311）。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）觀察組均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：參照《2016 英國(guó)國(guó)家多學(xué)科指南：鼻咽癌》［6］中NPC 診斷標(biāo)準(zhǔn)，TNM 分期為Ⅰ～Ⅳ期；均經(jīng)鼻咽活檢病理檢查、顱神經(jīng)檢查、全細(xì)胞計(jì)數(shù)等證實(shí)為NPC；Karnofsky（KPS）評(píng)分≥70 分；術(shù)前無(wú)放化療；（2）對(duì)照組均伴有鼻咽干燥不適、黏稠樣分泌物不易咳出等臨床表現(xiàn)，同時(shí)經(jīng)纖維鼻咽鏡、血常規(guī)等檢查確診；（3）兩組臨床資料完整，且病人及近親屬知情并簽署承諾書(shū)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）肝腎等重要臟器器質(zhì)性病變者；（2）入院前接受放療、化療或其他抗腫瘤治療者；（3）凝血機(jī)制紊亂或活動(dòng)性內(nèi)出血者；（4）合并其他部位惡性腫瘤者；（5）繼發(fā)性或原發(fā)性認(rèn)知功能障礙或精神行為異常者。

1.3 方法

1.3.1 試劑兔抗人USP22 多克隆抗體、兔抗人Trop2 多克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司、即用型快捷免疫組化MaxVision 試劑盒、DAB 顯色試劑盒、抗原修復(fù)液等試劑購(gòu)自深圳欣海凌生物科技有限公司。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色收集觀察組的NPC 組織及對(duì)照組的鼻咽黏膜組織，用4%的中性甲醛溶液固定，石蠟包埋。應(yīng)用免疫組織化學(xué)MaxVision法進(jìn)行染色，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。具體步驟：常規(guī)石蠟切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，枸

櫞酸鹽修復(fù)液高壓修復(fù)3 min，免疫組化筆在檢測(cè)組織外圍（約1～2 mm）處劃圈，3%過(guò)氧化氫孵育20 min，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，加入適量正常羊血清（10%），室溫條件下封閉15 min，棄血清，滴加兔抗人Trop2 多克隆抗體（1∶500 稀釋）或兔抗人USP22 多克隆抗體（1∶200 稀釋）一抗，4 ℃下孵育1 h，PBS 洗滌3 次后加入二抗，室溫孵育15 min。PBS 洗滌3 次，DAB 顯色、蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。同時(shí)以自身對(duì)照作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.3 免疫組化結(jié)果判定［7］由2 位病理科醫(yī)師雙盲條件下使用高倍顯微鏡觀察切片，結(jié)果不一致時(shí)協(xié)商統(tǒng)一判定結(jié)果。USP22蛋白著色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，Trop2 蛋白著色主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，根據(jù)染色陽(yáng)性細(xì)胞所占同類細(xì)胞總數(shù)百分比分為四級(jí)：0 分為＜1%，1 分為1%～10%；2 分為11%～50%；3 分為＞50%。染色強(qiáng)度根據(jù)腫瘤細(xì)胞著色深淺計(jì)分：0 分為無(wú)著色；1 分為黃色為弱陽(yáng)性；2 分為淺棕色為中等陽(yáng)性；3 分為棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性。根據(jù)切片中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例、細(xì)胞著色強(qiáng)度評(píng)分的乘積進(jìn)行判定：0 分為陰性，1～2 分為弱陽(yáng)性，3～4 分為陽(yáng)性，＞4 分為強(qiáng)陽(yáng)性，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理時(shí)將分級(jí)≥1 分歸為陽(yáng)性。

1.4 觀察指標(biāo) （1）對(duì)比兩組USP22、Trop2 蛋白表達(dá)水平。（2）采用受試者工作特征曲線（ROC）分析USP22、Trop2 診斷價(jià)值。（3）對(duì)比不同臨床病理特征病人USP22、Trop2 表達(dá)陽(yáng)性率。（4）采用Pearson 線性相關(guān)性分析USP22、Trop2蛋白陽(yáng)性率NPC臨床病理特征關(guān)聯(lián)性。（5）對(duì)比不同USP22、Trop2蛋白表達(dá)水平病人3 年生存率。（6）采用Kaplan-Meier（KM）曲線分析生存價(jià)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。此外，采用Logistic回歸進(jìn)行影響因素分析。采用Pearson 進(jìn)行線性相關(guān)性分析。采用ROC 曲線評(píng)估診斷價(jià)值。采用KM 曲線進(jìn)行生存曲線分析，采用Log-Rank 檢驗(yàn)比較兩組生存率。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組USP22、Trop2 蛋白表達(dá)水平觀察組USP22、Trop2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組USP22、Trop2蛋白表達(dá)水平比較/例（%）

2.2 USP22、Trop2 診斷價(jià)值 USP22、Trop2 聯(lián)合診斷的準(zhǔn)確性、敏感性均高于二者單一診斷；兩者聯(lián)合診斷特異性與單一診斷無(wú)明顯差別，見(jiàn)表2。

表2 USP22、Trop2蛋白對(duì)NPC診斷價(jià)值/%

2.3 不同臨床病理特征病人USP22、Trop2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率不同病理分型、年齡、性別病人USP22、Trop2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NPC 病人組織標(biāo)本中USP22、Trop2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.4 USP22、Trop2蛋白表達(dá)的影響因素分析（多因素綜合分析） 建立非條件logistic 回歸模型，以本研究資料為樣本，再分別以USP22、Trop2 蛋白表達(dá)情況為應(yīng)變量，賦值1=陽(yáng)性表達(dá)，0=陰性表達(dá)。以上述單因素分析（表3）中P＜0.10 的指標(biāo)/因素為自變量。各變量賦值見(jiàn)表4。回歸過(guò)程采用逐步后退法，以進(jìn)行自變量的選擇和剔除，設(shè)定α剔除=0.10，α入選=0.05?；貧w結(jié)果顯示：TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等3 個(gè)因素均為USP22、Trop2 蛋白表達(dá)的影響因素或關(guān)聯(lián)因素（P＜0.05）。

表3 不同臨床病理特征病人USP22、Trop2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較/例（%）

表4 Logistic回歸結(jié)果

2.5 USP22、Trop2 蛋白水平與NPC 臨床病理特征關(guān)聯(lián)性 Pearson 線性相關(guān)性分析，USP22、Trop2 蛋白水平與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與分化程度呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 USP22、Trop2蛋白水平與NPC臨床病理特征關(guān)聯(lián)性

2.6 不同USP22、Trop2 蛋白表達(dá)水平病人3 年生存率 USP22、Trop2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)病人3 年總生存率、無(wú)進(jìn)展生存率低于陰性表達(dá)病人，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表6。

表6 不同USP22、Trop2蛋白表達(dá)水平病人3年生存比較/例（%）

2.7 生存分析隨訪3 年，以ROC 曲線最佳截?cái)嘀捣譃榈臀＝M、高危組，KM 曲線分析顯示USP22 蛋白、Trop2 蛋白高危組、低危組生存曲線有較明顯的差別。經(jīng)Logrank 檢驗(yàn)，兩組生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ21=8.95，P1=0.003；χ22=20.57，P2＜0.001）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，由于NPC 發(fā)病部位多位于鼻咽部較深位置，確診時(shí)已有60%～70%病人出現(xiàn)局部進(jìn)展［8］，嚴(yán)重降低NPC 病人生存率?，F(xiàn)階段臨床尚未完全明確NPC 致病及其進(jìn)展的分子機(jī)制，臨床實(shí)踐表明，NPC 分子致病機(jī)制多認(rèn)為與主要原癌基因、抑癌基因的異常表達(dá)與改變及Akt 信號(hào)通路、絲裂原蛋白激酶通路、Wnt 信號(hào)通路的改變等有關(guān)［9］。因此，深入研究NPC 分子機(jī)制，對(duì)提高NPC 病人生存率具有積極作用。

USP22 是細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的樞紐分子，可通過(guò)去除泛素連接蛋白底物上的泛素，控制泛素化過(guò)程，降解細(xì)胞內(nèi)多種蛋白，調(diào)節(jié)抗原呈遞、腫瘤形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等一系列細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)［10］。莫文法等［11］采用免疫組化法檢測(cè)60例NPC組織、20例鼻咽黏膜慢性炎組織發(fā)現(xiàn)，USP22 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在NPC 病人中呈高表達(dá)狀態(tài)，支持本研究觀點(diǎn)。充分表明USP22 蛋白在NPC 腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮致癌因子作用，USP22 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高可激活c-Myc 轉(zhuǎn)錄，下調(diào)AKT/GSK-3/Cyclin 通路中的p-AKT、p-GSK-3β、cy-clinD1 表達(dá)，影響細(xì)胞增殖周期，同時(shí)通過(guò)去泛素化端粒重復(fù)序列連接因子1（TRF1），一定程度可干擾TRF1穩(wěn)定性，參與端粒維持，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、侵襲［12］，另外通過(guò)刺激局部黏著斑酶信號(hào)通路、去泛素化上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子通路，能加快上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，導(dǎo)致惡性腫瘤侵襲、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。此外，經(jīng)logistic 回歸及Pearson 線性相關(guān)性分析可知，USP22 蛋白水平與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度存在有密切關(guān)聯(lián)，與羅錚錚［13］研究一致，說(shuō)明USP22 具有促進(jìn)NPC 細(xì)胞增殖、提高局部浸潤(rùn)擴(kuò)散能力的作用，有望成為評(píng)估NPC惡性程度、浸潤(rùn)侵襲的重要指標(biāo)。

最后，對(duì)比不同USP22 蛋白表達(dá)水平病人3 年生存率可知，USP22 蛋白陽(yáng)性表達(dá)病人3 年總生存率、無(wú)進(jìn)展生存率明顯低于陰性表達(dá)病人，進(jìn)一步證實(shí)USP22 蛋白有望成為預(yù)測(cè)NPC 預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物及生物治療靶點(diǎn)。

Trop2 可通過(guò)激活MAPK/ERK 激酶通路，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移、分化及凋亡，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［14-15］。本研究對(duì)比兩組Trop2蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，NPC 組織標(biāo)本中Trop2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于慢性鼻咽炎組織標(biāo)本，與李贊華［16］觀點(diǎn)相似，說(shuō)明Trop2 蛋白具有致癌功能。袁廣全［17］研究也證實(shí)，Trop2 能激活ERK/MAPK 信號(hào)通路，提高細(xì)胞周期蛋白D1、cyclinE的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，同時(shí)隨NPC 發(fā)生發(fā)展，Trop2 蛋白表達(dá)增強(qiáng)，可降低細(xì)胞黏附能力，引發(fā)細(xì)胞連接紊亂，導(dǎo)致癌細(xì)胞從原發(fā)灶脫落，從而促進(jìn)細(xì)胞致癌性轉(zhuǎn)化，加快腫瘤血管形成，增強(qiáng)鼻咽癌侵襲、轉(zhuǎn)移行為，抑制NPC 細(xì)胞凋亡。另外，本研究應(yīng)用ROC 曲線對(duì)Trop2 蛋白診斷NPC 價(jià)值進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Trop2 蛋白診斷NPC準(zhǔn)確性（75.40%）＞USP22 蛋白（73.80%），但二者診斷敏感性均＜67.00%，故建議臨床加強(qiáng)Trop2、USP22蛋白表達(dá)水平聯(lián)合檢測(cè)，以便及早檢出NPC 高危人群，抑制病情進(jìn)展。此外，分析Trop2 蛋白表達(dá)與NPC臨床病理特征關(guān)系得出，Trop2蛋白表達(dá)水平在TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NPC 組織中呈異常高表達(dá)狀況，與陳順金等［18］研究相符，提示Trop2 蛋白可能與NPC 病人預(yù)后存在密切聯(lián)系。進(jìn)一步經(jīng)Log-Rank 檢驗(yàn)得知，Trop2 蛋白陽(yáng)性高表達(dá)水平會(huì)增加NPC 病人死亡風(fēng)險(xiǎn)，充分說(shuō)明Trop2 蛋白可作為預(yù)測(cè)NPC 病人預(yù)后的潛在有效指標(biāo)。

綜上可知，Trop2、USP22 蛋白表達(dá)水平在NPC病人中呈異常高表達(dá)狀態(tài)，與TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)聯(lián)性，加強(qiáng)Trop2、USP22 蛋白表達(dá)水平聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)早期識(shí)別NPC、評(píng)估預(yù)后具有重要指導(dǎo)意義。