楊海榮，豐樹(shù)菊，杜鵬琳

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宮頸癌的主要致病因素，也是宮頸疾病發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素之一，HPV 與宿主DNA 相結(jié)合對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生惡性增殖，由宮頸炎開(kāi)始，經(jīng)過(guò)不典型增生，發(fā)展成為宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），最終演變?yōu)閷m頸癌［1］。宮頸癌是嚴(yán)重危害婦女健康的第二位惡性腫瘤，病人比例達(dá)到8%［2］，但HPV 感染引起的宮頸上皮癌變的分子機(jī)制尚未明確，近年來(lái)DNA 甲基化的研究備受關(guān)注。CIN 作為宮頸癌前病變的主要疾病狀態(tài)，是一組可進(jìn)展成為宮頸癌的癌前病變統(tǒng)稱，在宮頸包括子宮頸上皮非典型增生至原位癌一系列癌前病變的連續(xù)過(guò)程［3］。為降低宮頸癌的發(fā)生率及死亡率，改善預(yù)后效果，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早治療尤為關(guān)鍵。DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）催化DNA序列中胞嘧啶的5’碳原子發(fā)生甲基化修飾并成為5’-甲基胞嘧啶，從而進(jìn)一步影響DNA 轉(zhuǎn)錄過(guò)程［4］。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞中最豐富的的甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠維持甲基化作用［5］。DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNMT3a）是DNMTs 中的另一重要成員，在新形成甲基化時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。高曉斌等［7］研究表明，DNMT1、DNMT3a 具有協(xié)同作用，均可作為結(jié)直腸癌早期診斷的潛在生物學(xué)指標(biāo)。但目前DNMT1、DNMT3a 并未在宮頸癌診斷中應(yīng)用，且有關(guān)宮頸癌及癌前病變中DNMT1、DNMT3a 表達(dá)的研究較少，本實(shí)驗(yàn)探究了宮頸癌及癌前病變病人血清DNMT1、DNMT3a 表達(dá)情況及與HPV 感染的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017 年9 月至2019 年9 月于焦煤集團(tuán)中央醫(yī)院收治住院的宮頸癌及癌前病變病人128 例作為觀察組，年齡（40.33±7.96）歲，其中宮頸癌58 例為宮頸癌組，宮頸癌前病變70 例為癌前病變組。選取同期入院體檢的正常女性志愿者50 例作為對(duì)照組，年齡（39.89±8.32）歲。將宮頸癌組病人按FIGO 分期：Ⅰ期組24 例，Ⅱ期組21 例，Ⅲ期組13 例。將宮頸癌前病變病人根據(jù)組織病理學(xué)檢測(cè)明確臨床分級(jí)，分為CIN Ⅰ級(jí)組26 例，Ⅱ級(jí)組23 例，Ⅲ級(jí)組21 例。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）宮頸癌病人均經(jīng)宮頸活檢病理或術(shù)后病理檢查確診；（2）CIN 診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，即行陰道鏡下多點(diǎn)活檢且病理學(xué)檢查結(jié)果診斷為CIN；（3）所有受試者年齡均≥20 歲，臨床病理資料完整；（4）所有受試者及近親屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在其他部位原發(fā)性惡性腫瘤，且向?qū)m頸內(nèi)轉(zhuǎn)移者；（2）合并嚴(yán)重糖尿病、高血脂及自身免疫性疾病者；（3）合并嚴(yán)重精神系統(tǒng)疾病者；（4）合并嚴(yán)重心肝腎功能不全者。

1.2 主要試劑與儀器 DNMT1、DNMT3a ELISA 試劑盒（上海一研生物科技有限公司，貨號(hào)EY-elisa4035、EY-elisa4034）、酶標(biāo)儀（Wellscan MK3）、高速冷凍離心機(jī)（日立公司，TG-16WS）。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本的采集與保存所有受試者均于清晨空腹抽取靜脈血5 mL，置于干燥管內(nèi)，37 ℃水浴30 min，以3 000 r/min 離心3 min，分離上層血清，置于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清DNMT1、DNMT3a水平采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法對(duì)血清DNMT1、DNMT3a 水平進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒由上海一研生物科技有限公司提供，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒

說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 HPV 感染檢測(cè)采用第二代雜交捕獲法（hybrid capture Ⅱ，HC-Ⅱ）檢測(cè)HPV-DNA，在收集的受試者宮頸分泌物及組織樣本中加入裂解液使DNA雙鏈分解為單鏈，加入RNA 探針與DNA 單鏈結(jié)合為RNA-DNA 雜交體，采用特異性抗體將RNA-DNA雜交體固定于微孔壁上，將該雜交體與有堿性磷酸酶的多個(gè)第二抗體結(jié)合，是信號(hào)放大，最后堿性磷酸酶使酶底物發(fā)光，利用光的強(qiáng)弱對(duì)含量進(jìn)行判斷，從而判斷HPV 感染情況。若可見(jiàn)DNA 負(fù)荷量≥1.0 ng/L［相對(duì)發(fā)光度單位（RLU）/陽(yáng)性定標(biāo)閾值（CO）≥1.0］即為陽(yáng)性，反之為陰性。高危HPV 包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。

1.3.4 病理切片觀察取宮頸癌病人手術(shù)切除癌組織樣本及癌前病變病人活檢組織樣本制成液基細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，進(jìn)行HE 染色。分別觀察宮頸癌及癌前病變病人病理切片形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用±s進(jìn)行描述，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析的方法，多組之間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組與癌前病變組病理切片形態(tài)比較宮頸癌前病變病人組織邊界較清晰，鏡下示腫瘤細(xì)胞密度低，細(xì)胞有輕度異型性。宮頸癌組織細(xì)胞鏡下示細(xì)胞核異型性較明顯，腫瘤細(xì)胞密度高。

2.2 各組血清DNMT1、DNMT3a 表達(dá)水平比較與對(duì)照組相比，宮頸癌前病變組與宮頸癌組病人血清DNMT1、DNMT3a水平均顯著升高（P＜0.05），與宮頸癌前病變組相比，宮頸癌組病人血清DNMT1、DNMT3a水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組受試者血清DNMT1、DNMT3a表達(dá)水平/（μg/L，±s）

表1 各組受試者血清DNMT1、DNMT3a表達(dá)水平/（μg/L，±s）

注：DNMT1 為DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1，DNMT3a 為DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3a。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與宮頸癌前病變組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組宮頸癌前病變組宮頸癌組F值P值例數(shù)50 70 58 DNMT1 13.03±2.65 26.78±5.84①44.72±9.36①②311.95＜0.001 DNMT3a 346.12±67.34 415.03±82.56①607.48±125.19①②113.17＜0.001

2.3 血清DNMT1、DNMT3a 水平與臨床病理的相關(guān)性血清DNMT1、DNMT3a水平與宮頸癌病人FIGO 分期、CIN 分級(jí)、HPV 危險(xiǎn)程度均相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNMT3a）表達(dá)水平與臨床病理相關(guān)性/（μg/L，±s）

表2 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNMT3a）表達(dá)水平與臨床病理相關(guān)性/（μg/L，±s）

項(xiàng)目FIGO分期Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期CIN分級(jí)Ⅰ級(jí)Ⅱ級(jí)Ⅲ級(jí)HPV感染類型高危型普通型例數(shù)24 21 13 26 23 21 75 26 DNMT1 40.60±6.02 45.92±6.33 50.38±5.10 19.47±4.34 27.15±5.11 35.43±6.28 42.16±6.30 25.57±5.24 F值12.06 54.13（12.05）P值＜0.001＜0.001＜0.001 DNMT3a 551.34±81.22 621.54±70.32 688.41±65.79 367.65±71.91 420.97±69.23 467.18±57.38 569.36±103.99 405.24±76.37 F值14.99 12.96（7.38）P值＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 血清DNMT1、DNMT3a 水平對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值以血清DNMT1、DNMT3a 單個(gè)指標(biāo)檢驗(yàn)值及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)概率值為檢驗(yàn)變量繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，血清DNMT1、DNMT3a 診斷宮頸癌的AUC分別為0.918（95%CI：0.866～0.969）、0.875（95%CI：0.815～0.934），截?cái)嘀捣謩e為36.049 μg/L、563.431μg/L，特異性分別為92.9%、94.3%，敏感度分別為82.8%、70.7%；二者聯(lián)合診斷宮頸癌的AUC 為0.960（95%CI：0.919～0.999），特異性為94.3%，敏感度為91.4%。見(jiàn)圖1。

圖1 血清DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DN MT3a）水平診斷宮頸癌的ROC曲線

2.5 各組HPV 感染情況比較宮頸癌組HPV 陽(yáng)性率最高為100.00%，宮頸癌前病變組HPV 陽(yáng)性率為61.43%，對(duì)照組HPV 陽(yáng)性率為6.00%，三組HPV 感染情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=98.11，P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組HPV感染情況比較

2.6 HPV 感染與未感染病人血清DNMT1、DNMT3a 表達(dá)水平比較 HPV 感染組血清DNMT1、DNMT3a 水平高于HPV 未感染組；HPV 感染組健康女性血清DNMT1、DNMT3a 水平高于HPV 未感染組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4，5。

表4 HPV感染組與未感染組DNMT1、DNMT3a表達(dá)水平比較/（μg/L，±s）

表4 HPV感染組與未感染組DNMT1、DNMT3a表達(dá)水平比較/（μg/L，±s）

注：DNMT1為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1，DNMT3a為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a。

組別HPV感染組HPV未感染組t值P值例數(shù)101 27 DNMT1 37.89±12.67 23.76±7.83 5.51＜0.001 DNMT3a 527.11±119.06 409.18±56.19 4.99＜0.001

表5 HPV感染組與未感染組健康女性血清DNMT1、DNMT3a表達(dá)水平比較/（μg/L，±s）

表5 HPV感染組與未感染組健康女性血清DNMT1、DNMT3a表達(dá)水平比較/（μg/L，±s）

注：DNMT1為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1，DNMT3a為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a。

組別HPV感染組HPV未感染組t值P值例數(shù)3 47 DNMT1 16.84±4.21 9.42±1.87 6.16＜0.001 DNMT3a 364.28±70.22 291.14±52.61 2.30＜0.001

3 討論

宮頸癌是婦科生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是一種在多因素共同作用下發(fā)生的多步驟、漫長(zhǎng)的病變過(guò)程，在全球范圍每年新發(fā)病例50 萬(wàn)以上，隨檢出率及治療手段的不斷進(jìn)步，死亡率有所改善，但仍無(wú)法令人滿意［8］。臨床中發(fā)現(xiàn)宮頸癌的發(fā)展是一個(gè)漸變過(guò)程，病程較長(zhǎng)，CIN 病變是宮頸癌前期病癥，在癌前病變向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，多種基因改變導(dǎo)致的細(xì)胞增殖及分化異常，是細(xì)胞凋亡和增殖間的平衡狀態(tài)被打破，從而導(dǎo)致細(xì)胞非正常生理狀態(tài)增殖，形成宮頸惡性瘤變，給病人的生命健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅［9］。HPV 被認(rèn)為是宮頸癌及癌前病變的重要致病因素，有研究表明，85%～95%的宮頸癌病人癌組織中能夠檢出HPV［10］。HPV 是一種DNA 病毒，其通過(guò)黏膜入侵靶細(xì)胞，將DNA 整合到宿主染色體，破壞宿主細(xì)胞的正常細(xì)胞周期，進(jìn)而形成癌組織［11］。近年來(lái)，大量研究表明，表觀遺傳學(xué)的異常與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，特別是DNA 甲基化在宮頸癌中起重要作用［12］。在DNA 甲基化過(guò)程中，DNMT 的表達(dá)水平與功能的改變是導(dǎo)致異常DNA 甲基化模式的因素之一［13］。目前對(duì)HPV 感染與甲基轉(zhuǎn)移酶是否存在相關(guān)性研究較少，本實(shí)驗(yàn)探討了宮頸癌及癌前病變病人血清DNMT1、DNMT3a表達(dá)水平及與HPV感染的關(guān)系。

DNMT1 是最早發(fā)現(xiàn)的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，定位于19p13.3-p13.2，其cDNA 全長(zhǎng)5 434 bp，由1 495 個(gè)氨基酸組成［14］。DNMT1 是作用于半甲基化DNA 的維持甲基化轉(zhuǎn)移酶，其對(duì)新合成的DNA 單鏈進(jìn)行甲基化修飾，并將甲基化陰性傳遞給子代細(xì)胞［15］。DNMT1 的主要功能是保證新合成的DNA 具有高度保真性，并且維持甲基化轉(zhuǎn)移酶的功能，DNA 甲基化通過(guò)DNMT 催化作用，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶核苷酸的嘧啶環(huán)第5 位碳原子甲基化，形成CpG 島，正常細(xì)胞DNMT1 過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致CpG 島超甲基化，從而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化［16］。有研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，DNMT1 高表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控CDC25B 來(lái)發(fā)揮致癌作用［17］。DNMT3a 是一種催化DNA 甲基化的關(guān)鍵酶，通過(guò)調(diào)控多種基因表達(dá)參與了腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程，其在原始胚胎形成中具有重要作用，主要功能是催化DNA 甲基化的新生位點(diǎn)［18］。有研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3a在胃癌、外陰鱗狀細(xì)胞癌及胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)［19］。在卵巢癌中，下調(diào)DNMT3a 增強(qiáng)了miR-182 表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，miR-101 通過(guò)靶向調(diào)控DNMT3a，抑制人卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲［20］。羅舒等［21］研究結(jié)果顯示，DNMT1在宮頸癌組織中高表達(dá)，且對(duì)不良預(yù)后有重要預(yù)測(cè)作用。Sun等［22］研究中發(fā)現(xiàn)，miR-182可通過(guò)抑制DNMT3a的表達(dá)誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。雖已有研究表明DNMT1、DNMT3a 與宮頸癌及其預(yù)后有密切聯(lián)系，但二者與宮頸癌及癌前病變病人HPV 感染的相關(guān)性研究較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，宮頸癌及癌前病變組病人血清DNMT1、DNMT3a 表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，宮頸癌病人血清DNMT1、DNMT3a 表達(dá)水平顯著高于癌前病變組，提示血清DNMT1、DNMT3a 參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，宮頸癌的的發(fā)生與抑癌基因異常的甲基化狀態(tài)有關(guān)。血清DNMT1、DNMT3a 表達(dá)水平與宮頸癌病人FIGO 分級(jí)、癌前病變病人CIN 分期、HPV 感染危險(xiǎn)程度相關(guān)，提示高表達(dá)的DNMT1、DNMT3a 介導(dǎo)的DNA 甲基化過(guò)程能夠抑制促凋亡分子的表達(dá)，與宮頸癌及癌前病變的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，高危HPV與DNA整合后使DNA 發(fā)生更復(fù)雜的基因表達(dá)異常，通過(guò)基因表達(dá)的改變來(lái)影響細(xì)胞的生物學(xué)特征。此外，本研究中血清DNMT1、DNMT3a 對(duì)宮頸癌均有一定的診斷價(jià)值，特異性分別為92.9%、94.3%，敏感度分別為82.8%、70.7%，且二者聯(lián)合后診斷敏感度為91.4%，有明顯提升。HPV 感染情況結(jié)果顯示，宮頸癌病人HPV 陽(yáng)性率為100.00%，宮頸癌前病變組HPV 陽(yáng)性率為61.43%，對(duì)照組HPV 陽(yáng)性率為6.00%，三組HPV 感染情況比較結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示HPV 感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。不同HPV 感染情況病人血清DNMT1、DNMT3a 表達(dá)水平比較顯示，HPV 感染組病人及健康女性血清DNMT1、DNMT3a 水平顯著高于未感染組，提示DNMT1、DNMT3a 與HPV 感染密切相關(guān)，HPV 感染與DNA 異常甲基化存在聯(lián)系，HPV 病毒有可能通過(guò)與DNMT 結(jié)合，促使DNMT 與DNA 和腺苷氨酸結(jié)合，進(jìn)而使某些抑癌基因表達(dá)沉默，導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。有研究報(bào)道，大多數(shù)HPV 感染可通過(guò)自身免疫清除，僅少數(shù)病人感染持續(xù)，并最終發(fā)展為宮頸癌前病變甚至宮頸癌。

綜上所述，宮頸癌及癌前病變病人血清中DNMT1、DNMT3a 表達(dá)水平顯著升高，CIN 病人HPV 感染率顯著低于宮頸癌病人，HPV 感染病人血清中DNMT1、DNMT3a 呈高表達(dá)，血清DNMT1、DNMT3a水平與宮頸癌、CIN 病人的嚴(yán)重程度、HPV 感染類型有關(guān)，宮頸癌及CIN 病人HPV 感染與甲基轉(zhuǎn)移酶催化的甲基化反應(yīng)有關(guān)。