馮磊，楊建敏，楊然，孫麗，董莉麗，張清偉

宮頸癌是全球女性常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率位列女性惡性腫瘤中第二位，主要分為鱗狀細(xì)胞癌和腺癌［1］。近年隨著我國醫(yī)療技術(shù)水平有的提高，早期行手術(shù)或者放療，宮頸癌的治療效果得到明顯改善，但女性宮頸癌發(fā)病病人卻逐漸年輕化，發(fā)病率也呈增高趨勢［2-3］。阻斷腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及血管的生成等在其治療過程中起著重要的作用，當(dāng)前宮頸癌治療所面臨的最大難題是腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在發(fā)揮著重要作用［4］。內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子1（endothelial cell specific molecule-1，ESM-1）是一種新型內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子，具有調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的功能，研究表明其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中轉(zhuǎn)移、浸潤與腫瘤新生血管密切相關(guān)［5-6］。故而，探索ESM-1、VEGF 與宮頸鱗癌發(fā)生EMT 的關(guān)系，為宮頸癌靶向治療提供新的指導(dǎo)與靶點，有助于治療方案的制定和預(yù)后判定。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018 年12 月至2019 年12 月在南陽市中心醫(yī)院接受宮頸癌根治術(shù)的宮頸鱗癌病人180 例作為研究組，年齡（41.3±5.7）歲，范圍為24～63 歲。術(shù)后石蠟組織標(biāo)本，所有宮頸鱗癌病例均經(jīng)過病理科兩名醫(yī)師閱片后共同診斷。根據(jù)宮頸癌FIGO 分期標(biāo)準(zhǔn)進標(biāo)準(zhǔn)分期［7］，其中Ⅰa 期94例，IIa 期86 例；病理組織學(xué)分化：低分化61 例，中分化86 例，高分化33 例；肌層浸潤＜1/2 宮頸83 例，肌層浸潤≥1/2 宮頸97 例；行磁共振成像（MRI）檢查示無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移130例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例。

另外收集同期南陽市中心醫(yī)院源于子宮肌瘤切除術(shù)的正常宮頸組織石蠟組織標(biāo)本60 例作為正常組，臨床資料完整，年齡（42.5±6.1）歲，范圍為21～65 歲。兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究參與者均簽署知情同意書。

研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前均未進行化療、放療或其他輔助治療；（2）切片均HE 染色，經(jīng)至少兩位病理醫(yī)師獨立診斷為子宮頸鱗癌；（3）不伴有其他惡性腫瘤病史；（4）臨床資料完整。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 主要試劑兔抗人E-Cadherin（31955）和Vimentin（5741S）克隆抗體均由美國CST公司提供；兔抗人ESM-1（ATA28878）和VEGF 克隆抗體由武漢益普生物科技有限公司公司提供；兔抗人VEGF（AF0011）克隆抗體由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；SP 免疫組化試劑盒（IH0975R）由上海雅吉生物科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本免疫組化檢測所有宮頸組織經(jīng)甲醛固定后包埋、切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化。石蠟切片厚度為5μm，高溫烘烤脫水，3%過氧化氫處理后磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，高壓法熱修復(fù)，PBS沖洗，山羊血清封閉，加入一抗ESM-1 抗體（1∶100）、VEGF 抗體（1∶100）、E-Cadherin 抗體（1∶100），Vimentin 抗體（1∶200）4 ℃孵育過夜，PBS 洗脫，加入二抗37 ℃孵育，PBS 沖洗，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，透明處理，中性樹膠封片，以PBS代替一抗作為陰性對照，進行鏡檢判定結(jié)果。ESM-1 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色；VEGF 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色；E-Cadherin 則主要表達(dá)于胞膜及胞質(zhì)中，呈棕黃色或棕褐色；Vimentin 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色。

1.3.2 結(jié)果判定［8］每張切片隨機選取3 個有代表性的高倍視野，ESM-1、VEGF、E-Cadherin 評分采用染色強度及陽性細(xì)胞數(shù)百分比綜合評價，Vimentin評分采用染色強度直接評分。染色強度評分：無染色為0分，輕度黃染為1分，中度黃染為2分，重度黃染為3 分。陽性細(xì)胞數(shù)百分比：計數(shù)每個組織的3個10×10 倍視野下腫瘤細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)百分比=（陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞數(shù)/所有腫瘤細(xì)胞數(shù)）×100%；評分：＜10%為0 分，10%～24%為1分，25%～49%為2 分，50%～74%為3 分，75%～100%為4 分。ESM-1 結(jié)果判定：兩者分值的乘積為最終結(jié)果，評分0～3 分為陰性，4～12 分為陽性。VEGF 結(jié)果判定：兩者分值的和為最終結(jié)果，評分0 分為陰性，1～7 分為陽性。E-Cadherin 結(jié)果判定：兩者分值的乘積為最終結(jié)果，評分0～4 分為陰性，6～12 分為陽性。Vimentin 結(jié)果判定：染色強度直接評分為最終結(jié)果，評分0～1 分為陰性，2～3 分為陽性。每張切片的結(jié)果判斷均由兩名高年資病理科醫(yī)生核準(zhǔn)。

1.3.3 比較分析比較正常宮頸和宮頸鱗癌組織中ESM-1、VEGF、E-Cadherin和Vimentin的陽性表達(dá)情況。比較其在宮頸鱗癌臨床病理特征的陽性表達(dá)情況，宮頸鱗癌臨床病理特征：根據(jù)宮頸癌FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)進標(biāo)準(zhǔn)分期分為Ⅰa 期和Ⅱa 期；病理組織學(xué)分化程度分為低分化，中分化，高分化；宮頸鱗狀細(xì)胞癌宮頸浸潤深度分為肌層浸潤＜1/2 宮頸，肌層浸潤≥1/2 宮頸；行MRI 檢查示分為有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。并通過Kendall's tau-b 分析ESM-1、VEGF 與EMT相關(guān)蛋白E-Cadherin、Vimentin的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)均用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗分析各組間差異，Kendall's tau-b 分析ESM-1 和VEGF 與EMT 的相關(guān)性，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常宮頸和宮頸鱗癌組織中ESM-1 和VEGF的陽性表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示，ESM-1、VEGF、Vimentin 在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)顯著高于正常宮頸組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；E-Cadherin 在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)顯著低于正常宮頸組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 正常宮頸和宮頸鱗癌組織中ESM-1和VEGF的陽性表達(dá)率/例（%）

2.2 ESM-1 和VEGF 陽性率與宮頸鱗癌臨床病理特征的關(guān)系隨著宮頸鱗狀細(xì)胞癌FIGO 分期越高，ESM-1和Vimentin 陽性表達(dá)率越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=17.24，14.72，P＜0.05），對VEGF 和ECadherin 陽性率的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.05，0.91，P＞0.05）；隨著宮頸鱗狀細(xì)胞癌分化程度越高，E-Cadherin 和Vimentin 陽性表達(dá)率越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=29.45，23.31，P＜0.05），對ESM-1 和VEGF 陽性率的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.26，0.68，P＞0.05）；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人的ESM-1、VEGF 及Vimentin 陽性率高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，E-Cadherin 陽性率低于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.03，11.65，24.38，31.57，P＜0.05）；隨著宮頸鱗狀細(xì)胞癌宮頸浸潤深度的增加，ESM-1 和VEGF 陽性表達(dá)率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.87，12.92，P＜0.05），對E-Cadherin 和Vimentin 陽性率的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.58，1.53，P＞0.05）。見表2。

表2 ESM-1和VEGF陽性率與宮頸鱗癌臨床病理特征的關(guān)系/例（%）

2.3 宮頸組織中ESM-1 和VEGF 表達(dá)與EMT 的關(guān)系宮頸組織中，ESM-1 和VEGF 的表達(dá)與ECadherin 呈負(fù)相關(guān)，Spearman 列聯(lián)系數(shù)為（r=-0.46，-0.306，P＜0.05）；ESM-1和VEGF 的表達(dá)與Vimentin 的表達(dá)呈正相關(guān)，Spearman 列聯(lián)系數(shù)為（r=0.43，-0.36，P＜0.05）。結(jié)果提示，宮頸癌組織中異常高表達(dá)的ESM-1 和VEGF 可能參與了宮頸鱗癌的EMT過程。見表3。

表3 宮頸組織中ESM-1和VEGF與E-Cadherin、Vimentin表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

子宮頸癌作為女性生殖系統(tǒng)第一大常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅病人的健康，其中子宮頸鱗癌占90%以上［9］。其發(fā)病機制目前尚不清楚，研究顯示其主要因素包括［10］：（1）長期細(xì)菌或者人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirs，HR-HPV）和皰疹病毒感染；（2）早婚、早育、多次妊娠等；（3）性行為過多過早；（4）宮頸長期慢性炎癥、持續(xù)的宮頸糜爛等；（5）長期口服避孕藥等。其中，HR-HPV 的慢性、持續(xù)性的感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的重要誘因。隨著醫(yī)學(xué)進步，通過HPV 疫苗的接種及HPV 的篩查，宮頸癌的發(fā)病率盡管有所下降，但仍有大量女性因患宮頸癌而死亡［11］。人正常宮頸感染HR-HPV 后，宮頸上皮組織中的β-連環(huán)素表達(dá)降低，上皮細(xì)胞標(biāo)記相關(guān)蛋白E-Cadherin 的表達(dá)下降，而間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白Vimentina 表達(dá)升高，細(xì)胞呈紡錘形發(fā)生EMT［12］，細(xì)胞侵襲、遷移能力增強。而侵襲、轉(zhuǎn)移是宮頸癌導(dǎo)致病人死亡的主要原因。

近期的腫瘤研究表明，EMT 與腫瘤原位浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)，在多種上皮性惡性腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤進展過程的研究均發(fā)現(xiàn)EMT 現(xiàn)象，其促進腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等，且病人預(yù)后較差［13-14］。據(jù)此，學(xué)者提出以針對EMT 來減少腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)進行治療［15-16］。EMT 是上皮細(xì)胞在某些因素的作用下，細(xì)胞的極性及細(xì)胞間黏附能力減弱、骨架重組，轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞，其遷移和運動能力增加。其主要特征包括：上皮性細(xì)胞標(biāo)記分子E-Cadherin、α-連環(huán)素、β-連環(huán)素及緊密連接蛋白等表達(dá)下降，間質(zhì)性細(xì)胞標(biāo)記分子Vimentin、N-鈣黏蛋白及α-平滑肌肌動蛋白等表達(dá)升高；細(xì)胞間的相互作用丟失；細(xì)胞角蛋白細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變骨架轉(zhuǎn)化為Vimentin，演變?yōu)榧忓N形纖維細(xì)胞形態(tài)，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得間質(zhì)細(xì)胞的表型。E-Cadherin 是構(gòu)成上皮細(xì)胞間黏附的重要成分，Vimentin 是一種中間絲蛋白，主要表達(dá)于間葉組織細(xì)胞中，異常表達(dá)會使細(xì)胞骨架蛋白構(gòu)成改變［17-18］。提示，宮頸鱗癌組織中EMT 的發(fā)生是通過抑制E-Cadherin，β-連環(huán)素的表達(dá)以及促進Vinnetin 的表達(dá)實現(xiàn)的，及E-Cadherin的降低及Vimentin 表達(dá)的升高成為EMT 程序啟動的主要分子標(biāo)識［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗癌上皮黏附蛋白標(biāo)志物E-Cadherin 表達(dá)下降，間質(zhì)標(biāo)志物分子Vimentin 表達(dá)上調(diào)，提示發(fā)生EMT，與既往研究結(jié)果一致［20］。

又有研究表明，在腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤過程與腫瘤新生血管密切相關(guān)［21］。多項研究顯示VEGF 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及血管的生成等過程中有著極其重要的作用［22］。VEGF 廣泛存在于動物和人體的各種組織中，是血管衍生生長因子家族的成員，也是目前發(fā)現(xiàn)的調(diào)控血管生成特異性最高、作用最強的因子［23］。在局部組織缺血、創(chuàng)傷修復(fù)及炎癥反應(yīng)等病理狀況刺激下可通過旁分泌和自分泌的方式在各種惡性腫瘤細(xì)胞中釋放，可增加細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣聚集，改變血管內(nèi)皮基因的表達(dá)方式，刺激內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，促進毛細(xì)血管通透性增加和新血管生成，還可調(diào)節(jié)淋巴微管的生成，促進腫瘤淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移［24］。ESM-1是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子，具有調(diào)節(jié)VEGF 的功能，能促進血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，改善腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境［25］。故而，ESM-1、VEGF 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及浸潤的研究成為熱點。本實驗結(jié)果顯示，ESM-1 和VEGF 參與宮頸鱗癌的EMT，阻斷二者的表達(dá)可能為宮頸鱗癌靶向治療提供新的指導(dǎo)與靶點。

宮頸癌病人臨床Ⅰa～Ⅱa 期的病人手術(shù)為首選治療方案，而Ⅱb 期及以上病人的治療的標(biāo)準(zhǔn)方案是放療聯(lián)合含鉑藥物的化療。通過檢測宮頸鱗癌病人臨床Ⅰa～Ⅱa 期的病人宮頸組織中ESM-1 和VEGF 的表達(dá)情況及其與EMT 相關(guān)蛋白E-Cadherin和Vimentin 的關(guān)系，表明ESM-1 和VEGF 促進宮頸鱗癌病人EMT 的發(fā)生，并與E-Cadherin 呈負(fù)相關(guān)，與Vimentin 的表達(dá)呈正相關(guān)。然而ESM-1 和VEGF能否成為腫瘤靶向治療的靶點還仍受爭議。因地區(qū)、經(jīng)濟及衛(wèi)生等方面的差異，宮頸癌的發(fā)病率及死亡率不盡相同，相關(guān)蛋白表達(dá)率也有差異，而早期篩查及預(yù)防的不同，宮頸癌的分子標(biāo)志物較難得到同意的標(biāo)準(zhǔn)。因而，確定宮頸癌的分子生物學(xué)特征，研究與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機制，有助于宮頸癌治療方案的制定、療效的預(yù)測和預(yù)后判定，并為宮頸癌的治療提供新的治療靶點。