謝延平，李艷寶

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為多種因素引起的機(jī)體自身免疫反應(yīng)而導(dǎo)致的一種自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為滑膜炎、關(guān)節(jié)腔積液、血管翳形成、炎細(xì)胞浸潤、骨和軟骨組織破壞等。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，免疫反應(yīng)在其發(fā)病中發(fā)揮重要作用，Toll樣受體（TLRs）可識別內(nèi)外源性炎性反應(yīng)分子信號刺激，并將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致核因子-κB（NF-κB）等活化，介導(dǎo)多種炎性細(xì)胞遞質(zhì)釋放，從而引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生［1-2］，因此抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎TLRs/NFκB信號通路可抑制其關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用。槲皮素具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、清除氧自由基、抗氧化、抗凋亡等作用［3］，可通過抑制TLRs/NF-κB 信號在多種炎癥反應(yīng)性疾病中發(fā)揮作用［4］。本研究自2020 年1—7 月建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型，觀察槲皮素對其關(guān)節(jié)軟骨組織中TLR4/NF-κB 信號通路的影響，探討槲皮素對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：無特定病原體（specific pathogen free，SPF）、6～8 周齡、雌雄各半、體質(zhì)量22～26 g、C57BL/6（H-2b）小鼠50 只，實(shí)驗(yàn)小鼠購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠許可證號：SCVK（冀）2014-0015。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會審批，受到動(dòng)物倫理協(xié)會監(jiān)督。主要試劑：槲皮素（純度＞98%）（程度普菲德生物技術(shù)有限公司，批號JOT-10049），牛Ⅱ型膠原（批號5032）、完全弗氏佐劑（批號F5949）、不完全弗氏佐劑（批號F5597）、兔抗鼠Toll樣受體4（TLR4）多克隆抗體、兔抗鼠腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）多克隆抗體、兔抗鼠髓樣分化因子88（MYD88）多克隆抗體、兔抗鼠NF-κB p65 多克隆抗體（美國Sigma 公司），熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒、（美國Ebioscience公司）等。

1.2 建立動(dòng)物模型將牛Ⅱ型膠原溶解于0.01 mmol/L 冰醋酸中，制成4 g/L 牛Ⅱ型膠原溶液；將配置的牛Ⅱ型膠原溶液和等體積的完全弗氏佐劑混合，使用勻漿器在冰浴中充分乳化，制成牛Ⅱ型膠原乳劑用于造模；將配置的牛Ⅱ型膠原溶液和等體積的不完全弗氏佐劑混合，在冰浴中充分乳化，用于激發(fā)。將50 只C57BL/6 小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組（C 組）10 只和模型組40 只。模型組小鼠建立關(guān)節(jié)炎模型小鼠：第1天，在每只小鼠尾根部多點(diǎn)皮下注射牛Ⅱ型膠原/完全弗氏佐劑混合乳劑150μL，其中含牛Ⅱ型膠原0.3 mg；第10 天，每只小鼠尾根部多點(diǎn)注射牛Ⅱ型膠原/不完全弗氏佐劑混合乳劑50μL，其中含牛Ⅱ型膠原0.1 mg，建立膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型。對照組小鼠尾根部注射等量生理鹽水。

1.3 分組及處理建模后14 d，對模型組小鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評分，其中關(guān)節(jié)炎評分≤4 分者5 只，予以剔除，關(guān)節(jié)炎評分＞4 分者35 只，從中采用隨機(jī)數(shù)字表法取30 只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為模型組（M 組）、槲皮素組（Q 組）和甲氨蝶呤組（MTX 組），每組10 只小鼠。將200 mg 槲皮素溶解到5% CMC-Na 溶液40 mL 中制成混懸液，Q 組小鼠給予槲皮素［5］50 mg/kg腹腔注射，每3天1次，共3周；經(jīng)3 mg濃度50 g/L 甲氨蝶呤溶解到30 mL 生理鹽水中制成濃度為0.1 g/L溶液，MTX 組小鼠給予甲氨蝶呤0.5 mg/kg 腹腔注射，每3 天1 次，共3 周。C 組和M 組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 視覺模擬評分法進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評分治療結(jié)束后進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)［6］：關(guān)節(jié)無紅腫為0 分，趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫為1 分，趾關(guān)節(jié)和足趾出現(xiàn)腫脹為2 分，踝關(guān)節(jié)以下出現(xiàn)腫脹為3 分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)出現(xiàn)腫脹為4分。

1.5 采集標(biāo)本關(guān)節(jié)炎評分結(jié)束后麻醉處死小鼠，從雙側(cè)踝關(guān)節(jié)以上1 cm 處截?cái)?，取雙側(cè)踝關(guān)節(jié)，一側(cè)踝關(guān)節(jié)用于蘇木精-伊紅（HE）染色，另一側(cè)踝關(guān)節(jié)用于蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）和熒光定量PCR檢測。

1.6 HE 染色將小鼠踝關(guān)節(jié)用多聚甲醛固定，經(jīng)EDTA 脫鈣、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋等制備踝關(guān)節(jié)石蠟標(biāo)本，將石蠟標(biāo)本切除厚5μm 切片，經(jīng)常規(guī)HE 染色，顯微鏡下觀察踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)變化情況。并對踝關(guān)節(jié)HE 染色圖片進(jìn)行關(guān)節(jié)病理評分（由2 名高級別病理學(xué)專家進(jìn)行評分）：從滑膜炎、血管翳、骨破壞三個(gè)方面進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)：滑膜炎：根據(jù)幻魔細(xì)胞層數(shù)分為0～5 分：＜3 層滑膜細(xì)胞為0 分，3～5 層滑膜細(xì)胞為1 分，6～10 層滑膜細(xì)胞為2分，10～20層滑膜細(xì)胞為3分，20～30層滑膜細(xì)胞為4 分，30 層以上滑膜細(xì)胞為5 分；血管翳：根據(jù)血管翳多少分為0～5 分，0 分為無血管翳生成，5 分為有大量增殖的血管翳形成；骨破壞：無骨侵蝕為0分，小面積骨侵蝕為1 分，清楚的軟骨侵蝕為2 分，骨侵蝕波及軟骨下骨為3 分，大面積軟骨和骨侵蝕為4分，明顯軟骨和骨骨量丟失為5分。

1.7 Western blotting 測定軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κBp65 蛋白水平取出小鼠踝關(guān)節(jié)軟骨，用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞提取關(guān)節(jié)軟骨總蛋白，BCA 法測定關(guān)節(jié)軟骨組織蛋白濃度，經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，用脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗：兔抗鼠TLR4 多克隆抗體、兔抗鼠TRAF6 多克隆抗體、兔抗鼠MYD88 多克隆抗體、兔抗鼠NF-κBp65 多克隆抗體過夜孵育，一抗稀釋比例1∶300，以β-actin 為內(nèi)參照，加入二抗孵育1 h，二抗稀釋比例1∶5 000，化學(xué)發(fā)光劑顯影，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κBp65 蛋白水平以各蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

1.8 熒光定量RT-PCR 測定軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κBp65 mRNA 水平取踝關(guān)節(jié)軟骨組織，采用Trizol 提取踝關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量RTPCR 測定軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NFκBp65 mRNA 水平，反應(yīng)條件：95 ℃5 min，94 ℃10 s、56 ℃30 s、72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κBp65 mRNA 水平。以GAPDH 為內(nèi)參。各引物序列見表1。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量和足掌腫脹厚度比較與C組比較，M組、Q組和MTX組小鼠體質(zhì)量均有不同程度減輕，M 組小鼠體質(zhì)量與C 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他各組小鼠之間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與C 組比較，M 組足掌腫脹厚度升高（P＜0.05）；與M 組比較，Q 組和MTX 組足掌腫脹厚度降低（P＜0.05）；Q 組足掌腫脹厚度稍高于MTX組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠體質(zhì)量和足掌腫脹厚度比較/±s

表2 各組小鼠體質(zhì)量和足掌腫脹厚度比較/±s

注：①與C組比較，P＜0.05，②與M組比較，P＜0.05。

組別C組M組Q組MTX組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10體質(zhì)量/g 23.54±3.61 18.43±3.25①21.54±3.18①②22.02±3.21①②4.18 0.012足掌腫脹厚度/mm 2.16±0.53 4.85±0.64①3.12±0.63①②2.87±0.57①②36.91 0.000

2.2 各組小鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學(xué)變化比較各組小鼠關(guān)節(jié)HE 染色顯示：C 組小鼠關(guān)節(jié)正常，無骨和軟骨破壞，無漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，滑膜組織排列規(guī)則；M組小鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞排列紊亂、層數(shù)增多，滑膜組織增生，呈柵欄樣或乳頭樣突起，滑膜組織中有新生血管和血管翳形成，見大量炎細(xì)胞浸潤，骨和軟骨組織破壞；Q 組和MTX 組小鼠關(guān)節(jié)滑膜增生不明顯，炎細(xì)胞浸潤及骨和軟骨組織破壞較輕。

與M 組比較，Q 組和MTX 組病理評分（骨破壞評分、血管翳評分、滑膜炎評分及總分）明顯降低（P＜0.05）；Q 組病理評分（骨破壞評分、血管翳評分、滑膜炎評分及總分）稍高于MTX 組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組小鼠關(guān)節(jié)組織病理評分比較/（分，±s）

表3 各組小鼠關(guān)節(jié)組織病理評分比較/（分，±s）

注：①與M組比較，P＜0.05。

組別C組M組Q組MTX組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10骨破壞評分0.00±0.00 2.45±0.61 1.24±0.53①0.95±0.56①19.65 0.000血管翳評分0.00±0.00 2.67±0.54 1.16±0.48①0.84±0.51①36.64 0.000滑膜炎評分0.00±0.00 2.43±0.49 1.37±0.52①1.06±0.47①21.17 0.000總分0.00±0.00 7.55±1.21 3.77±1.12①2.85±1.17①45.54 0.000

2.3 各組小鼠關(guān)節(jié)炎評分比較 C 組小鼠雙側(cè)后足關(guān)節(jié)正常，無腫脹；M組小鼠雙側(cè)后足關(guān)節(jié)顏色變紅、腫脹明顯；Q 組和MTX 組小鼠雙側(cè)后足關(guān)節(jié)腫脹明顯減輕。關(guān)節(jié)炎評分Q 組（1.57±0.82）分和MTX 組（1.23±0.85）分與M 組（5.61±1.06）分比較，明顯降低（P＜0.05）；Q 組關(guān)節(jié)炎評分稍高于MTX 組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 各組小鼠軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κBp65 蛋白水平比較與C 組比較，M組軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κBp65 蛋白水平升高（P＜0.05）；與M 組比較，Q 組和MTX 組軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κBp65 蛋白水平降低（P＜0.05）；Q 組和MTX 組軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κBp65 蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1，表4。

表4 各組小鼠軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κB p65蛋白水平比較/±s

表4 各組小鼠軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κB p65蛋白水平比較/±s

注：TLR4 為兔抗鼠Toll 樣受體4，TRAF6 為兔抗鼠腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6，MYD88為兔抗鼠髓樣分化因子88，NF-κB p65為核因子-κB p65。①與C組比較，P＜0.05。②與M組比較，P＜0.05。

組別C組M組Q組MTX組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 TLR4 0.23±0.07 0.74±0.10①0.39±0.08①②0.36±0.07①②72.57 0.000 TRAF6 0.26±0.08 0.87±0.12①0.45±0.11①②0.40±0.09①②67.29 0.000 MYD88 0.15±0.06 0.81±0.13①0.46±0.09①②0.37±0.07①②89.98 0.000 NF-κB p65 0.13±0.04 0.72±0.11①0.35±0.08①②0.37±0.09①②84.39 0.000

圖1 蛋白質(zhì)印跡法測定各組軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κBp65蛋白水平

2.5 各組軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NFκBp65 mRNA 水平比較與C 組比較，M 組軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κBp655 mRNA 水平升高（P＜0.05）；與M組比較，Q組和MTX組軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κBp655 mRNA 水平降低（P＜0.05）；Q 組和MTX 組軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κBp655 mRNA 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κB p655mRNA水平比較/±s

表5 各組軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κB p655mRNA水平比較/±s

注：TLR4 為兔抗鼠Toll 樣受體4，TRAF6 為兔抗鼠腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6，MYD88為兔抗鼠髓樣分化因子88，NF-κB p65為核因子-κB p65。①與C組比較，P＜0.05。②與M組比較，P＜0.05。

組別C組M組Q組MTX組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 TLR4 1.00±0.07 1.96±0.14①1.45±0.12①②1.39±0.08①②137.22 0.000 TRAF6 1.00±0.08 2.31±0.15①1.62±0.14①②1.55±0.12①②183.45 0.000 MYD88 1.00±0.06 2.14±0.13①1.53±0.14①②1.47±0.15①②139.83 0.000 NF-κB p65 1.00±0.09 2.42±0.17①1.76±0.15①②1.63±0.16①②159.32 0.000

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)TLRs 信號通路在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中具有重要作用［7］，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎TLR4/NF-κB信號通路激活，參與關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)過程［8］。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型為常用的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，本文通過建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠足掌腫脹明顯，關(guān)節(jié)炎評分和關(guān)節(jié)病理評分升高，TLR4、TRAF6、MYD88、NF-κBp65 蛋白和mRNA 水平升高。TLRs在免疫系統(tǒng)中可識別外源性病原相關(guān)分子以及內(nèi)源性分子導(dǎo)致的炎癥分宜、組織損傷，并將病原相關(guān)分子的刺激信號通過跨膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，活化NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子，產(chǎn)生復(fù)雜的級聯(lián)信號反應(yīng)；NFκB 的活化可介導(dǎo)白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子ɑ 等炎性介質(zhì)的表達(dá)，引起炎癥介質(zhì)的合成及釋放，炎癥介質(zhì)進(jìn)一步活化淋巴細(xì)胞，趨化激活中性粒細(xì)胞，啟動(dòng)免疫反應(yīng)；MYD88為TLR4反向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為TLR4 信號通路中的關(guān)鍵分子，可傳遞正向信息；TLR4 通過MYD88 激活各種炎性因子［9］。TRAF6 可與MYD88 結(jié)合，產(chǎn)生一連串級聯(lián)反應(yīng)，并通過激活I(lǐng)-κB 激酶復(fù)合體在應(yīng)激、炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［10］。NF-κB 為炎癥反應(yīng)的核心調(diào)控因子，由2類亞基形成的二聚體，常見的形式為p65/p50或p65/p65；正常情況下，正反饋和負(fù)反饋精細(xì)調(diào)節(jié)NF-κB 的活化，使其活化處于適當(dāng)水平；未活化的NF-κB分布在細(xì)胞質(zhì)中，可被趨化因子、生長因子及炎癥因子等激活，激活的NF-κB 通過信號通路導(dǎo)致異質(zhì)性蛋白I-κB 磷酸化，并進(jìn)一步降解，時(shí)I-κB 和NF-κB解離，NF-κB移位到細(xì)胞核內(nèi)，與DNA相應(yīng)靶基因位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)前炎癥介質(zhì)及炎癥相關(guān)酶類的轉(zhuǎn)錄程序，引起大量炎癥細(xì)胞浸潤到炎癥部位，加重炎癥反應(yīng)的發(fā)生［11-12］。因此本研究結(jié)果表明膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與TLR4/NF-κB 信號通路關(guān)系密切，TLR4/NF-κB信號通路激活在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

槲皮素在植物的花、葉和果實(shí)中廣泛存在，為飲食中主要的生物類黃酮類化合物，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用［13-14］。對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎等具有良好的緩解作用［15-17］。槲皮素可通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路發(fā)揮生物學(xué)活性［18］，如槲皮素通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路緩解脂多糖誘導(dǎo)的腎損傷［19］；通過TLR4/NF-κB 信號通路緩解重癥急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷［20］。介于TLR4/NF-κB信號通路在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，槲皮素可通過TLR4/NF-κB 信號通路發(fā)揮生物學(xué)作用，因此推測槲皮素可能通過TLR4/NF-κB信號通路抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)，本文對其研究，發(fā)現(xiàn)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠給予槲皮素處理可降低足掌腫脹厚度，降低病理評分和關(guān)節(jié)炎評分，降低軟骨組織中TLR4、TRAF6、MYD88、NFκBp65蛋白和mRNA 水平。因此本研究結(jié)果表明槲皮素可能通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥反應(yīng)，從而對其發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，槲皮素可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的保護(hù)作用。