周 安 江煜靈

(1.東莞市公安局厚街分局，廣東 東莞523960；2.東莞市公安局，廣東 東莞 523000）

近年來，隨著DNA 提取技術(shù)的不斷進步，骨骼DNA 檢驗方法也得到迅速的發(fā)展，檢驗效率以及檢出成功率不斷提高。對于高度腐敗尸體、白骨化尸體能夠成功檢出骨骼STR分型是尋找尸源的可靠手段之一，但是一些陳舊白骨化的骨骼類案件中，由于骨骼經(jīng)過風吹雨打、長期暴曬或者濕潤等惡劣環(huán)境，污染極其嚴重，DNA 高度降解，增加了種屬鑒定和DNA 檢驗的難度，成為法醫(yī)物證檢驗鑒定領(lǐng)域中的一大難題。本文通過對1例白骨化無名尸體中骨骼的成功檢驗，探討了脫鈣結(jié)合磁珠法提取陳舊骨骼DNA的檢驗方法。

1 材料與方法

1.1 檢材來源

2019年3月某日，報警人報警稱，其在廣東省東莞市某鎮(zhèn)路邊發(fā)現(xiàn)一個白色化肥編織袋，袋內(nèi)裝有一副殘缺的疑似人體的骸骨，后于2019年3月某日送檢2根疑似人體股骨和2020 年4 月某日送檢2 根疑似人體肱骨，要求做DNA檢驗。

1.2 檢材的預(yù)處理

仔細觀察送檢的股骨和肱骨，發(fā)現(xiàn)均已白骨化，沒有軟組織附著，外表有少量污垢。遂取股骨和肱骨各2 根，股骨編為A、B 號，肱骨編為C、D 號。使用手術(shù)刀片刮清洗骨骼表面污物和骨腔表面層，放置在84 消毒液浸泡10min 后，純水多次沖洗干凈，切取寬約6mm骨密質(zhì)薄片2片，薄片放置于無水乙醇浸泡10min，將骨薄片剪成塊狀，濾紙擦干晾干備用。

1.3 DNA提取

采用螯合劑0.5mol/L EDTA（PH=8.0）溶液浸泡骨塊4h脫鈣，取各骨塊分別置于Freez?erMill 冷凍研磨儀，在液氮低溫環(huán)境下研磨至粉末狀，每份3g 骨粉放入10mL 的離心管內(nèi)，按骨骼專用磁珠法DNA 提取試劑盒（長春博坤公司）添加對應(yīng)比例的蛋白酶K 和骨粉孵育液?；靹蚝笾糜?6℃水浴恒溫12h，骨粉期間搖勻，補加一次蛋白酶K 225μL，繼續(xù)56℃水浴恒溫12h。離心取上清溶液，加入吸附液和超順磁性磁珠，充分搖勻后，吸取底部沉淀磁珠到提取試劑條，使用FL 案件專用型DNA 提取試劑盒（長春博坤公司，Kingfisher提取儀專用）提取骨粉模板DNA，洗脫體積30μL并收集。

1.4 PCR擴增及電泳

使用Verifiler Plus 復(fù)合擴增試劑盒（ABI公司，美國）進行擴增，反應(yīng)體系10μL，其中 DNA 模板溶液 2μL，PCR 反應(yīng)混合液 8μL（含有 Master mix additive 的 Master Mix 2μL，Primer Mix 1μL，純水5μL），擴增在ABI Veriti 96 well thermal cycler 上進行，擴增產(chǎn)物經(jīng)ABI-3500XL 遺傳分析儀電泳后，使用Gen?eMarker V1.90軟件進行分型。

2 實驗結(jié)果

股骨所得STR 分型結(jié)果（見圖1、圖2），肱骨所得STR 分型結(jié)果（見圖3、圖4），均能成功檢測有效分型。

圖1 白骨化股骨A檢出的STR分型圖譜

圖2 白骨化股骨B檢出的STR分型圖譜

圖3 白骨化肱骨C檢出的STR分型圖譜

圖4 白骨化肱骨D檢出的STR分型圖譜

由上述圖譜可見，所送檢材骨骼獲得的STR 電泳圖譜清晰，24 個基因座（圖為女性，缺少Yindel）均能顯示出峰，各基因座等位基因的峰高和分布均衡性較好，符合GA/T 1163—2014 的標準要求，但由于檢材降解因素，大片段基因座的峰值較低。

3 討論

3.1 檢材選取

本案送檢的骨骼已經(jīng)成白骨化，時間經(jīng)歷較久，但整副骨骼較為完整，沒有遭受嚴重破壞。選取股骨和肱骨進行DNA 檢驗，因為這兩個部位骨骼DNA 含量相對較多，DNA檢出率較高［1］。

3.2 污染控制

本案骨骼在白色化肥編織袋里發(fā)現(xiàn)，初步判斷是人為放置骨骼入編織袋內(nèi)，骨骼表面相對干凈，但無法排除是否有外源性DNA附著在內(nèi)，同時白骨化骨骼為疑難檢材，DNA 含量較低，因此檢驗過程的污染控制十分重要，需做好以下幾點：首先，需做好檢驗鑒定人員的保護以及檢驗工具的清潔與消毒，保證檢材在檢驗過程中不受污染；其次，在骨骼檢驗前，必須對其進行充分的去污處理，排除外源性DNA 的污染干擾；再次，由于該案無比對樣品，同一骨塊檢材要分開檢驗，至少要獨立檢驗二次，若是男性個體，至少應(yīng)做常STR 和Y-STR 多態(tài)性檢驗，若是女性個體應(yīng)做常STR 和mtDNA（條件允許下）多態(tài)性檢驗，確保能夠發(fā)現(xiàn)污染，及時排除干擾峰，從而提高結(jié)果的準確性和可溯源。

3.3 檢驗方法

在骨骼處理過程中應(yīng)注意以下幾點：（1）脫鈣環(huán)節(jié)，人體骨組織的細胞間質(zhì)主要由膠原質(zhì)和羥基磷灰石構(gòu)成，加入EDTA 使羥基磷灰石的鈣離子斷裂，有利于骨骼結(jié)構(gòu)疏松，易于裂解。由于預(yù)處理刮除骨骼表層組織，采用先脫鈣后研磨的思路，本案脫鈣時間嘗試在較短的時間中完成，避免了骨骼長時間脫鈣后DNA 含量嚴重損失的問題［2］，保留脫鈣液待復(fù)檢核對，骨骼的分型圖譜結(jié)果顯示均獲得較完整的STR 分型。（2）研磨環(huán)節(jié)，本案的骨骼使用液氮低溫研磨機進行研磨處理，使檢材一直處于低溫保護中，保證研磨過程中檢材DNA 不會發(fā)生降解或變性，同時樣品一直處于在液氮研磨槽中，避免在外界交叉污染的風險［3］。（3）磁珠轉(zhuǎn)移，在磁珠與骨粉裂解溶液下，吸取磁珠轉(zhuǎn)移到試劑條［4］進行DNA 提取，磁珠能充分吸附骨粉的DNA，有效提高DNA 的產(chǎn)量，達到檢驗高成功率。磁珠轉(zhuǎn)移法可以避免DNA 的污染和損失，該法操作相比其他提取方法［5-6］簡單方便，不易污染。

綜上所述，本文采用骨骼專用磁珠法DNA 提取試劑盒法結(jié)合Verifiler Plus 復(fù)合擴增試劑盒檢驗骨骼DNA，收集磁珠后一步轉(zhuǎn)移即可，檢驗時間得到縮短，效率得到進一步提高，具有操作簡單便利，試劑經(jīng)濟安全，DNA 產(chǎn)量高，能夠快速獲得完整的DNA 分型等特點，能滿足實際常規(guī)檢驗的要求，此方法適合于基層法醫(yī)對陳舊骨骼的DNA 進行檢驗。