李欣瑀 龐宜靜 高 爽

(1.中國(guó)刑事警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110035；2.沈陽(yáng)市公安局和平分局刑事警察大隊(duì)，遼寧 沈陽(yáng)110001；3.鄂爾多斯市公安局刑事警察支隊(duì)，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯017000)

細(xì)胞因子是炎癥和組織創(chuàng)傷修復(fù)中不可缺少的生物活性物質(zhì)，研究表明他們參與損傷修復(fù)和炎癥反應(yīng)的全過(guò)程［1］。通過(guò)觀察不同的細(xì)胞因子在損傷后的出現(xiàn)時(shí)間，可以用于法醫(yī)學(xué)損傷時(shí)間的推斷［2］。

利用小鼠皮膚切創(chuàng)模型，用逆轉(zhuǎn)錄（Re?verse transcription，RT）-PCR 方法檢測(cè)小鼠皮膚損傷后不同時(shí)間損傷周圍組織中MCP-1 和MIP-1α 兩種細(xì)胞因子的基因表達(dá)變化。其中MCP-1 可以由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、B 細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等分泌而成［3］，對(duì)單核細(xì)胞具有趨化活性，能夠激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞［4］。MIP-1α 主要參與巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的募集和活化［5］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察 MCP-1 和 MIP-1α 兩種細(xì)胞因子變化情況與損傷修復(fù)過(guò)程的關(guān)系，以確定其在小鼠皮膚損傷修復(fù)過(guò)程中基因表達(dá)的變化規(guī)律，探索其用于損傷時(shí)間推斷的可能性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)BALB/c 純系雄性小白鼠25 只，重量25～27g，隨機(jī)分成四組，每組5 只，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚損傷的切創(chuàng)模型

在小鼠腹腔注射5μg/g巴比妥進(jìn)行麻醉，剃除小鼠背部毛發(fā)，常規(guī)消毒背部皮膚，用直徑為4.0mm 的圓形無(wú)菌手術(shù)刀在小鼠背部距離脊柱兩側(cè)1.0cm 處左右對(duì)稱地各做一個(gè)不傷及肌肉的圓形皮膚缺損，每一只小鼠做3對(duì)，共計(jì)6處損傷。切創(chuàng)不包扎施藥等處理，放置于無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室內(nèi)單籠飼養(yǎng)，每天給予消毒的食物和水。在損傷形成后的1d、3d、6d、10d和14d時(shí)分別對(duì)損傷拍照，測(cè)量損傷的面積，而后分別用斷頭法處死上述小鼠，用直徑為8.0mm 的圓形取材刀，以損傷面為中心取損傷處的皮膚組織備檢。

1.2.2 總RNA提取

取上述皮膚組織放入1.5mL 試管中，加入1.0mL ISOGEN（Nippon Gene,Japan）組織處理液，用玻璃棒研磨使皮膚組織分散在試劑中成勻漿狀，室溫放置5min。加入0.2mL氯仿，輕微振蕩后于4℃、15000r/min 的轉(zhuǎn)速下離心15min。將上清液移入新試管后加異戊醇500μL，室溫靜置10min。再在4℃、15000r/min 的轉(zhuǎn)速下離心10min，吸去上清后加80%乙醇洗滌一次，室溫干燥5～10min，加入20μL 去離子水溶解RNA 沉淀，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 的濃度和純度后備用。

1.3 免疫組化染色和白細(xì)胞計(jì)數(shù)

將檢材用4%的中性多聚甲醛緩沖液固定12h。流水沖洗石蠟包埋后切割成厚度為4μm的薄片。所用一次抗體為用于單核細(xì)胞染色的大白鼠抗鼠F4/80抗體和抗兔抗體，分別用于染色單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞；二次抗體為生物素標(biāo)記的兔抗大白鼠免疫球蛋白IgG 抗體和生物素標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白IgG 抗體。顯色系統(tǒng)用Catalyzed signal amplification system 和DAB 系統(tǒng)進(jìn)行顯色。染色后在200 倍光鏡下隨機(jī)選取損傷區(qū)域的5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的個(gè)數(shù)，取5 個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)的平均值。

1.4 RT-PCR

取 2.0μg 的上述 RNA 放入 0.2mL 試管中，加入 1.0μL 的 Oligo dT （12～18）（500μg/mL）1.0μL，用超純水將體積調(diào)制12.0μL后，于70℃保存 10min，加入 4.0μL 的 5×緩沖液、2.0μL 0.1mol/L的DTT、1.0μL 10mmol/L的dNTP，42℃反應(yīng)50min 后，于70℃加熱15min 后停止反應(yīng)，即合成cDNA。

以該cDNA 為模板，用PCR 方法擴(kuò)增MCP-1 和MIP-1，β-actin 作為陽(yáng)性對(duì)照同時(shí)擴(kuò)增。反應(yīng)體系為 25μL，內(nèi)含 1.0μL 的模板 cDNA、1.5mol/LMgCl2、 50mol/LKCl、 0.1mol/LdNTP、0.5mol/L 各引物，以及1.0UTaqDNA 多聚酶。引物序列、PCR反應(yīng)條件及產(chǎn)物長(zhǎng)度（見(jiàn)表1）。

表1 各基因的引物序列及PCR反應(yīng)條件

1.5 PCR產(chǎn)物測(cè)量及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

擴(kuò)增產(chǎn)物 10μL 與 6×緩沖液 2μL 混合后，用2%瓊脂糖凝膠在150V 恒電壓下電泳30min，溴化乙錠（EthidiumBromide,EB）染色30min 后在紫外線照射下直接將電泳圖像輸入計(jì)算機(jī)，用Imaging 圖像分析軟件測(cè)量每一個(gè)產(chǎn)物電泳譜帶的灰度，并與同時(shí)擴(kuò)增的β-actin 的電泳譜帶亮度相比較，與β-actin 數(shù)值相除后，間接求得每一個(gè)PCR 產(chǎn)物中DNA 片段含量，計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 傷口的收縮、變化和恢復(fù)

在損傷后第1d，傷口的面積縮小到原損傷的（87.6±6.7）%，顯微鏡下可見(jiàn)大量嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；第3d 時(shí)面積縮小到原來(lái)的（68.9±6.5）%，鏡下出現(xiàn)大量的單核細(xì)胞。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色觀察可以發(fā)現(xiàn)，從傷后3d 開(kāi)始，損傷區(qū)域內(nèi)，特別是損傷邊緣處的纖維結(jié)締組織和肉芽組織增生，新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)，新生的血管雛形開(kāi)始形成，損傷區(qū)域邊緣的皮膚上皮細(xì)胞向損傷區(qū)域內(nèi)延展；切創(chuàng)形成后6d，損傷區(qū)域內(nèi)的肉芽組織和纖維結(jié)締組織明顯增生，損傷區(qū)域表面被上皮細(xì)胞覆蓋。傷后第6d 損傷面積已縮小至原來(lái)的50%；第12d時(shí)已完全恢復(fù)。

2.2 損傷后白細(xì)胞的變化

損傷后24h 可見(jiàn)嗜中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)，單核細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)；第3d 嗜中性粒細(xì)胞減少，單核細(xì)胞數(shù)量達(dá)高峰；第6d 嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)正常，單核細(xì)胞明顯減少，成纖維細(xì)胞以及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯增加。

2.3 細(xì)胞因子的基因表達(dá)

小鼠皮膚切創(chuàng)形成后，第1d 即可檢出各被檢因子，第3d MCP-1和MIP-1α的表達(dá)達(dá)高峰（451.6±98.79，449.2±42.32），第6dMCP-1和MIP-1α的表達(dá)略有下降。各被檢細(xì)胞炎性因子基因表達(dá)水平與損傷時(shí)間呈非直線性相關(guān)。兩種被檢因子在損傷后第3d，其mRNA 的表達(dá)水平均明顯高于其他幾天，不同階段呈現(xiàn)明顯的差異（見(jiàn)表2）。

表2 皮膚損傷后各被檢基因在不同時(shí)間的基因表達(dá)水平

3 討論

生物體損傷后，機(jī)體會(huì)對(duì)損傷處的異物和壞死組織細(xì)胞進(jìn)行清理，并誘導(dǎo)細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)分泌各種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及其他相關(guān)細(xì)胞的增生和分裂，修復(fù)缺損的組織［6］。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠損傷皮膚周圍的局部組織會(huì)出現(xiàn)紅腫腫脹滲出的情況，損傷后6～8h內(nèi)，損傷部位即有中性粒細(xì)胞聚積，12h 左右損傷區(qū)域內(nèi)的炎癥細(xì)胞以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，48h 后損傷組織內(nèi)的中性粒細(xì)胞減少，72h 后單核細(xì)胞逐漸增加，同時(shí)可見(jiàn)嗜中性粒細(xì)胞壞死崩解。同時(shí)，研究結(jié)果證明，MCP-1 在傷后24h 內(nèi)就有明顯表達(dá)，傷后72h 表達(dá)達(dá)到高峰，說(shuō)明在皮膚損傷的第1d，MCP-1 就參與了損傷區(qū)域的炎癥反應(yīng)，同時(shí)已經(jīng)啟動(dòng)了組織修復(fù)的程序。在皮膚損傷第3d，中性粒細(xì)胞減少，單核細(xì)胞增加，此時(shí)正是單核細(xì)胞浸潤(rùn)的高峰期，說(shuō)明MCP-1 參與了嗜中性粒細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)單核細(xì)胞浸潤(rùn)的過(guò)程。MIP-1α是屬于趨化因子家族的細(xì)胞因子，它主要參與巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的募集和活化。MIP-1α在傷后第1d 出現(xiàn)，第3d 達(dá)高峰，3d 后含量逐漸減少，它的基因表達(dá)過(guò)程與中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量的增減情況相符，說(shuō)明了MIP-1α在損傷后的短時(shí)間內(nèi)便參與到修復(fù)過(guò)程中。由此可見(jiàn)，損傷修復(fù)過(guò)程是一個(gè)在機(jī)制控制下的協(xié)同作用過(guò)程，是由多種生物因子共同參與下完成的［7］。從本研究的結(jié)果可以看出，創(chuàng)傷后組織中MCP-1 和MIP-1α 的基因表達(dá)具有一定的規(guī)律性，可以作為推測(cè)損傷時(shí)間的參考指標(biāo)。