周仕群，黎海翔，陳岳堯

（海南醫(yī)學(xué)院附屬儋州市人民醫(yī)院1.腎內(nèi)科，2.中醫(yī)科，海南儋州 571799）

尿毒癥是慢性腎衰竭的終末期，主要特點(diǎn)是代謝性酸中毒及水電解質(zhì)紊亂等，同時(shí)出現(xiàn)鈣缺乏、磷過(guò)多等鈣磷代謝紊亂的癥狀[1]。目前臨床多采用腹膜透析法替代腎臟排泄治療終末期腎病。但研究證實(shí)，長(zhǎng)期腹膜透析會(huì)引發(fā)鈣磷代謝紊亂，患者發(fā)生骨質(zhì)疏松、骨骼畸形的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，對(duì)機(jī)體造成二次傷害，因此探尋有效方法防治尿毒癥腹膜透析鈣磷代謝紊亂具有重要意義[2]。特立帕肽是人甲狀旁腺激素類(lèi)似物，能促進(jìn)骨折愈合，對(duì)骨質(zhì)疏松有一定治療作用。既往研究顯示，特立帕肽能夠改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨代謝異常[3]。既往研究顯示，抑制Wnt/β-catenin 通路活化能夠減輕蛋白尿，延緩腎臟病進(jìn)展，對(duì)尿毒癥大鼠足細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[4]。李明翰等[5]研究顯示，特立帕肽能夠抑制Wnt/β-catenin 通路活化，促進(jìn)去勢(shì)小鼠骨吸收。

目前有關(guān)特立帕肽對(duì)尿毒癥腹膜透析患者鈣磷代謝紊亂的影響少見(jiàn)報(bào)道，因此本研究基于Wnt/β-catenin 通路，探究特立帕肽對(duì)尿毒癥腹膜透析大鼠鈣磷代謝紊亂的影響，以期為臨床有效防治尿毒癥腹膜透析患者骨質(zhì)疏松提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50 只SPF 級(jí)SD 雄性大鼠（6 周齡），體重190～220 g，平均（205±15）g，購(gòu)自北京北生研生物制品有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0012，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2021-0265。

1.2 主要試劑與儀器

特立帕肽（國(guó)藥準(zhǔn)字S20170004，上海聯(lián)合賽爾生物工程有限公司），血肌酐、血尿素氮、血鈣、血磷、甲狀旁腺激素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（武漢恒意賽生物科技有限公司）， 蘇木精- 伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），兔抗鼠Wnt、β-catenin 及β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（上海酶研生物科技有限公司）。

Optima?XPN 超速離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特生物科技有限公司），TENLIN-A 型組織勻漿機(jī)（江蘇天祥儀器有限公司）。

1.3 尿毒癥腹膜透析大鼠模型的復(fù)制及分組

采用腎臟切除法復(fù)制尿毒癥大鼠模型。50 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后行左腎2/3 切除手術(shù)。以10%水合氯醛麻醉大鼠，背部左側(cè)腎臟處備皮、消毒，切口露出左腎。剝離左腎周?chē)窘M織，用帶針絲線結(jié)扎腎臟上端1/3 并切除、止血，同樣方法切除腎臟下端1/3，無(wú)出血后縫合肌層和皮膚，期間用青霉素消毒。1 周后行右腎全切手術(shù)，同切除2/3 左腎方法暴露右腎，直接結(jié)扎腎蒂處，右腎全切，無(wú)出血后縫合肌層和皮膚，期間用青霉素消毒。取尾靜脈血測(cè)肌酐值≥2 倍的正常血肌酐時(shí)為尿毒癥模型復(fù)制成功[6]。

尿毒癥模型復(fù)制過(guò)程中死亡2只大鼠，剩余48只大鼠成功復(fù)制尿毒癥模型。隨機(jī)取12 只尿毒癥大鼠為尿毒癥組，剩余36 只大鼠隨機(jī)分為尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組、尿毒癥腹膜透析組、特立帕肽組，每組12 只。其中，尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組只進(jìn)行開(kāi)腹后縫合操作并腹腔插腹膜透析管；尿毒癥腹膜透析組、特立帕肽組后腹腔插腹膜透析管，1.5%百特腹膜透析液2 mL 灌注，1 次/d，復(fù)制尿毒癥腹膜透析大鼠模型，以肝素沖洗腹膜透析管通暢為尿毒癥腹膜透析大鼠模型復(fù)制成功。

1.4 給藥方式

特立帕肽組大鼠成功復(fù)制尿毒癥腹膜透析模型后，腹腔注射特立帕肽30 μg/（kg·d）[7]，1 次/d，連續(xù)6 周；尿毒癥組、尿毒癥組腹膜透析組、尿毒癥組腹膜透析假手術(shù)組同時(shí)間腹腔注射等量生理鹽水。

1.5 方法

1.5.1 標(biāo)本采集給藥結(jié)束后，10%水合氯醛麻醉大鼠，取尾靜脈血，3 000 r/min 離心10 min，取血清置入-20℃冰箱冷凍保存。取血結(jié)束后將大鼠斷頸處死，取大鼠剩余腎臟分為兩部分，一部分固定于4%多聚甲醛溶液，乙醇脫水、透明、石蠟包埋過(guò)夜，制備4 μm 厚組織切片用于病理檢查；另一部分保存于液氮中用于Western blotting 檢測(cè)。

1.5.2 ELISA 測(cè)定腎功能和鈣磷代謝指標(biāo)取各組大鼠血清，按照腎功能指標(biāo)（血肌酐、血尿素氮）、鈣磷代謝指標(biāo)（血鈣、血磷）ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各指標(biāo)水平[8]。

1.5.3 HE 染色觀察腎組織病理學(xué)變化取各組大鼠腎組織切片，乙醇脫蠟至水，二甲苯透明，按照HE 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖片，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件觀察肺組織病理學(xué)變化[9]。

1.5.4 Western blotting測(cè)定腎組織Wnt/β-catenin通路蛋白的表達(dá)取各組大鼠腎組織并制備勻漿，裂解，孵育20 min，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液，測(cè)定蛋白總量并取20 μg 與等量上樣緩沖液混勻，沸水浴變性，電泳、轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 清洗，加入Wnt、β-catenin及內(nèi)參β-actin 作為一抗（1∶500），4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌，加入山羊抗兔二抗（1∶1 000），37℃、1.5 h，顯影、定影，以蛋白條帶灰度值計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量[10]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血肌酐及尿素氮水平比較

尿毒癥組、尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組、尿毒癥腹膜透析組、特立帕肽組大鼠血肌酐、血尿素氮水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.935 和73.147，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與尿毒癥組、尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組比較，尿毒癥腹膜透析組、特立帕肽組大鼠腹膜透析血肌酐、血尿素氮水平升高（P＜0.05）；且特立帕肽組大鼠血肌酐、血尿素氮水平低于尿毒癥腹膜透析組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血肌酐、血尿素氮水平比較（n=12，μmol/L，x±s）

2.2 各組大鼠血鈣、血磷水平比較

尿毒癥組、尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組、尿毒癥腹膜透析組、特立帕肽組大鼠血鈣、血磷水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.597和50.278，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與尿毒癥組、尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組比較，尿毒癥腹膜透析組、特立帕肽組大鼠血鈣水平降低（P＜0.05），血磷水平升高（P＜0.05）；且特立帕肽組大鼠血鈣水平高于尿毒癥腹膜透析組（P＜0.05），血磷水平低于尿毒癥腹膜透析組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血鈣、血磷水平比較（n=12，mmol/L，±s）

表2 各組大鼠血鈣、血磷水平比較（n=12，mmol/L，±s）

注：①與尿毒癥組、尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與尿毒癥腹膜透析組比較，P ＜0.05。

血磷0.95±0.15 1.45±0.22 2.16±0.33①1.79±0.27①②50.278 0.000組別尿毒癥組尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組尿毒癥腹膜透析組特立帕肽組F值P值血鈣2.57±0.39 2.13±0.32 1.37±0.21①1.82±0.28①②32.597 0.00

2.3 各組大鼠腎組織病理學(xué)變化

尿毒癥組、尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組大鼠可見(jiàn)腎小管結(jié)構(gòu)完整且正常；尿毒癥腹膜透析組大鼠腎小管毛細(xì)血管衰減嚴(yán)重，腎小管結(jié)構(gòu)及形狀發(fā)生明顯改變；與尿毒癥腹膜透析組比較，特立帕肽組大鼠上述病理變化有所改善。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)變化 （HE染色×200）

2.4 各組大鼠腎組織Wnt/β-catenin 通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

尿毒癥組、尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組、尿毒癥腹膜透析組、特立帕肽組大鼠腎組織Wnt、βcatenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=115.316 和135.045，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與尿毒癥組、尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組比較，尿毒癥腹膜透析組、特立帕肽組大鼠腎組織Wnt、β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；且特立帕肽組大鼠腎組織Wnt、βcatenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于尿毒癥腹膜透析組（P＜0.05）。見(jiàn)表3和圖2。

表3 各組大鼠腎組織Wnt/β-catenin通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=12，±s）

表3 各組大鼠腎組織Wnt/β-catenin通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=12，±s）

注：①與尿毒癥組、尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與尿毒癥腹膜透析組比較，P ＜0.05。

β-catenin蛋白0.96±0.15 0.60±0.09 0.31±0.05①0.28±0.05①②135.045 0.000組別尿毒癥組尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組尿毒癥腹膜透析組特立帕肽組F 值P 值Wnt蛋白2.63±0.41 2.70±0.43 1.15±0.18①0.81±0.13①②115.316 0.000

圖2 各組大鼠腎組織Wnt/β-catenin通路蛋白的表達(dá)

3 討論

尿毒癥是各種慢性腎衰竭終末期階段，慢性腎衰竭患者腎功能發(fā)生不可逆性衰退，使代謝及毒性物質(zhì)無(wú)法及時(shí)排出體外，在血液中積累造成全身中毒癥狀，導(dǎo)致尿毒癥的發(fā)生。尿毒癥臨床癥狀主要表現(xiàn)為鈣磷代謝紊亂、代謝性酸中毒和水鈉潴留等[11]。目前腹膜透析是緩解尿毒癥的主要方式，但患者需堅(jiān)持透析不能中斷。有研究表明，長(zhǎng)期腹膜透析可引發(fā)鈣磷代謝紊亂，患者易發(fā)生骨質(zhì)疏松，給患者生活質(zhì)量帶來(lái)嚴(yán)重影響[12]。既往研究顯示，特立帕肽能夠促進(jìn)骨質(zhì)疏松性脊柱骨折愈合，改善患者生存質(zhì)量[13]。

肌酐是人體肌肉代謝產(chǎn)物，其濃度升高多反映腎臟受損，能較準(zhǔn)確地反映腎實(shí)質(zhì)受損情況；尿素氮是一種含氮化合物，血肌酐和血尿素氮由腎小球過(guò)濾排出體外，兩者均是檢測(cè)腎功能的常用指標(biāo)[14]。本研究結(jié)果顯示，與尿毒癥組、尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組比較，尿毒癥腹膜透析組大鼠血肌酐、血尿素氮水平升高；當(dāng)以特立帕肽藥物干預(yù)后，大鼠血肌酐、血尿素氮水平均一定程度降低，說(shuō)明特立帕肽可能改善尿毒癥腹膜透析大鼠腎功能。鈣、磷是人體必需元素，鈣含量降低時(shí)患者易發(fā)生骨質(zhì)疏松，磷含量升高時(shí)會(huì)導(dǎo)致身體鈣流失，嚴(yán)重情況下引起機(jī)體中毒[15]。本研究結(jié)果顯示，與尿毒癥組、尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組比較，尿毒癥腹膜透析組大鼠血鈣水平降低，血磷水平升高；當(dāng)以特立帕肽藥物干預(yù)后，大鼠血鈣水平一定程度升高，血磷水平一定程度降低，說(shuō)明特立帕肽可能改善尿毒癥腹膜透析大鼠鈣磷代謝紊亂。

Wnt/β-catenin 通路存在于各種組織中，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、癌變等病理生理過(guò)程。當(dāng)機(jī)體受到刺激后，Wnt 蛋白與膜受體卷曲蛋白家族受體結(jié)合，激活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)一系列蛋白，使通路中關(guān)鍵蛋白β-catenin 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量累積并轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，調(diào)控組蛋白伸展、甲基化等，進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖及分化等[16-18]。姚瑤等[4]等研究表明，抑制Wnt/β-catenin 通路活化對(duì)膿毒癥具有一定治療作用。另有研究顯示，抑制Wnt/βcatenin 通路活化對(duì)慢性腎衰竭大鼠腎功能有保護(hù)作用[19]。本研究結(jié)果顯示，與尿毒癥組、尿毒癥腹膜透析假手術(shù)組比較，尿毒癥腹膜透析組大鼠腎組織Wnt、β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，當(dāng)以特立帕肽干預(yù)后，大鼠腎組織Wnt、β-catenin 蛋白相對(duì)表達(dá)量均一定程度降低，說(shuō)明特立帕肽可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 通路活化，改善尿毒癥腹膜透析大鼠腎功能，進(jìn)而改善大鼠鈣磷代謝紊亂。

綜上所述，特立帕肽可改善尿毒癥腹膜透析大鼠腎功能，提高血清鈣、磷水平，進(jìn)而改善尿毒癥腹膜透析大鼠鈣磷代謝紊亂，其作用可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin 通路活化來(lái)實(shí)現(xiàn)的，可為臨床有效防治尿毒癥腹膜透析患者骨質(zhì)疏松提供一定理論依據(jù)。然而本研究并未能明確特立帕肽對(duì)Wnt/β-catenin 通路的具體調(diào)控作用，后期將進(jìn)行深入研究。