陳鋰，朱正偉，汪薇，榮茂，江豐，王會霞

（湖北省食品質量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心，湖北武漢 430075）

嗎啉脂肪酸鹽果蠟由嗎啉、脂肪酸和天然動植物蠟（如棕櫚蠟）或天然動植物膠（如紫膠），在一定溫度下反應制成。自12到13世紀起被廣泛使用于水果和蔬菜表面，用于防止水分的揮發(fā)、抑制昆蟲的侵染和抗菌[1,2]，以達到長期存儲和運輸?shù)哪康摹Ｄ壳笆袌錾系乃貏e是柑橘、梨和蘋果會被噴灑上人工生產的嗎啉脂肪酸鹽果蠟，人體誤食后會在體內分解成嗎啉和相應的脂肪酸。有動物機體實驗表明，嗎啉在一定劑量下攝入可以引起動物肝臟、腎臟損傷；由于環(huán)境和食物中亞硝酸鹽的存在，嗎啉還可以在適當?shù)臈l件下發(fā)生亞硝基化反應生成亞硝基嗎啉，亞硝基嗎啉對所有受試動物均有致癌性[3,4]，屬于WHO規(guī)定的2B類致癌物[5]。歐盟在食品添加劑法規(guī)中，早已禁止銷售含有嗎啉的食物；加拿大衛(wèi)生部門建議嗎啉類物質的每日允許攝入量（ADI）不超過0.48 mg/kg bw·d[6]；而在中國嗎啉脂肪酸鹽果蠟被允許按照產品要求適當添加使用，因此檢測水果中嗎啉脂肪酸鹽果蠟具有極其重要的意義。

目前，國家標準GB 1886.227-2016《食品添加劑嗎啉脂肪酸鹽果蠟》只對果蠟的理化指標進行規(guī)定和檢測，對其含量的檢測方法并未給出。文獻中的方法也主要集中于嗎啉的直接提取和檢測[7,8]，檢測方法有液相法、液相色譜串聯(lián)質譜法、氣相色譜法和氣相色譜-質譜法等[9-11]，由于嗎啉分子量較小，在儀器分析中出峰時間較早且峰型較差，在復雜的食品基質中存在很大的干擾問題。同時，由于生產嗎啉脂肪酸鹽果蠟使用的脂肪酸和天然動植物蠟種類繁多，市面上的嗎啉脂肪酸鹽果蠟各不相同，難以對其進行準確的定性和定量，嗎啉脂肪酸鹽果蠟的檢測方法未見報道。

為提高食品樣品中目標化合物檢測結果的準確性并降低基質干擾等問題，樣品的前處理技術十分重要。QuEChERS方法被廣泛的應用于食品前處理步驟中[12]，目前有兩種官方的前處理方法，分別是AOAC（Association of Official Agricultural Chemists）推薦使用的乙酸鹽作為緩沖劑的方法[13]和CEN（European Committee for Standardization）使用的檸檬酸鹽作為緩沖劑的方法[14]，其前處理方法都是使用提取試劑對目標化合物進行提取后分層，有機相通過不同吸附劑進行純化達到去除食物基質中色素、脂肪和蛋白質等干擾物的目的[15,16]。本研究根據(jù)嗎啉脂肪酸鹽果蠟的基本性質，經QuEChERS方法提取、凈化后，通過衍生的方法將水果中的嗎啉脂肪酸鹽果蠟轉換成亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR），使用氣相色譜-串聯(lián)質譜分析樣品，以基質標準曲線定量，建立QuEChERS-GC-MS/MS法檢測水果中嗎啉脂肪酸鹽果蠟的殘留，為實現(xiàn)水果中嗎啉脂肪酸鹽果蠟的監(jiān)測提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ 9000 GC-MS/MS氣相色譜-三重四極桿質譜儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Avanti JXN-30高速離心機，美國貝克曼公司；ME 2002 E型分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；XH-C渦旋混合器，江蘇金怡儀器科技公司；N-EVAP 24氮吹儀，美國Organomation公司。

水果購于超市和農貿市場；乙腈、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醚、二氯甲烷，均為色譜純，德國默克公司；弗羅里硅土填料（Florisil）40～60 μm、十八烷基鍵合硅膠填料（C18）40～60 μm、N-丙基乙二胺（N-propylethylenediamine，PSA）40～60 μm、石墨化炭黑吸附劑（GCB）40～60 μm，北京迪馬科技有限公司；嗎啉、N-亞硝基嗎啉（NMOR），Toronto Research Chemicals；鹽酸、亞硝酸鈉、無水硫酸鎂（MgSO4），國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備溶液（10 μg/mL）：分別準確稱取1.0 mg（精確至0.0001 mg）嗎啉和亞硝基嗎啉標準品，用色譜純乙腈溶解并定容至100 mL，避光-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品前處理

分別取全果、果皮和果肉，切碎放入攪碎機中制備成勻漿，準確移取10.0 g至50 mL離心管中，加入1%酸化（甲酸）乙腈10 mL，1 g氯化鈉，1顆陶瓷均質子，劇烈渦旋1 min，以4000 r/min離心3 min；取上清液7 mL，加入PSA 300 mg、GCB 300 mg，渦旋1 min；取上清液5 mL，加入2.5 mL 200 g/L HCl和2.5 mL 300 g/L NaNO240 ℃超聲10 min，冰浴3 h，期間每30 min渦旋一次，每次1 min，衍生完成后加入1 g NaCl，以4000 r/min離心3 min，取上清液2.5 mL至試管中，40 ℃水浴中氮吹至近干，加入1 mL乙腈定容，過0.22 μm有機相濾膜，氣相色譜-三重四極桿質譜測定分析。

1.4 基質標準曲線的制備

分別稱取不含目標物的空白水果樣品10.0 g，按1.3節(jié)方法進行預處理。用基質提取液稀釋標準溶液，以峰面積（Y）為縱坐標對各被測組分的質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標作圖，繪制基質標準曲線。

1.5 儀器條件

色譜條件：色譜柱：HP-FFAP毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持1 min；以15 ℃/min升溫至120 ℃保持1 min；以30 ℃/min升溫至240 ℃保持5 min，總時長16 min；進樣口溫度280 ℃，流速1.3 mL/min；進樣量1.0 μL；進樣方式：不分流進樣。

質譜條件：EI源；電離能量70 eV，離子源溫度280 ℃，傳輸線溫度280 ℃，溶劑延遲3.5 min，多反應監(jiān)測模式，其具體參數(shù)見表1，色譜圖見圖1。

表1 亞硝基嗎啉的質譜分析參數(shù)Table 1 The mass spectrometry conditions of N-nitrosomorpholine

1.6 數(shù)據(jù)處理

相關質譜數(shù)據(jù)由儀器中的Xcalibur分析軟件收集，Quan Browser定量軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)匯總后，經Office軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與討論

2.1 提取試劑的選擇

乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、1%甲酸-乙腈、乙醚是QuEChERS方法中常見的萃取溶劑[17]，提取試劑的選擇可以有效的降低基質效應，減少共萃取物，提高后續(xù)凈化和衍生步驟的效果。前期實驗表明，水果中水分含量較大，加入無水硫酸鎂會迅速結塊并放熱降低目標化合物的提取率，因此實驗中不加入無水硫酸鎂，使用陶瓷均質子達到分散基質的效果。本實驗以陽性柑橘為研究對象，通過衍生后亞硝基嗎啉峰面積比較六種常用有機試劑（見圖2）對嗎啉脂肪酸鹽果蠟的提取效果。

結果表明，乙酸乙酯的提取效果最差，二氯甲烷的提取效果最好，但是會引入更多的雜質對目標化合物進行干擾，由于二氯甲烷不溶解于水，在第二步衍生過程中亞硝基化反應在兩相中進行，導致衍生化效果不穩(wěn)定，實驗準確度偏差大于20%，不符合GB 27404-2008實驗室質量控制規(guī)范要求。1%甲酸-乙腈混溶于水提取效果較好，目標化合物在酸性條件下衍生穩(wěn)定，因此選用1%酸化乙腈作為提取試劑。

2.2 凈化填料的優(yōu)化

由于果汁基質含有較高的維生素、色素和糖分對后續(xù)衍生有較大的影響[18]，為保證提取效率的同時排除基質干擾，本實驗以陽性柑橘為研究對象，通過衍生后亞硝基嗎啉峰面積進行比較，對凈化填料和用量進行選擇并優(yōu)化。實驗比較了單因素條件下PSA、C18、Florisil、GCB不同使用量對目標化合物提取的影響（圖3）。結果表明，PSA和GCB可以有效的去除柑橘中不同雜質對嗎啉脂肪酸鹽的影響，目標化合物峰面積隨著用量的增加而提高，在300 mg時凈化效果最優(yōu)，繼續(xù)增加凈化填料用量會吸附目標化合物并對提取產生影響；C18在50 mg時效果最優(yōu)，隨著用量的增加峰面積逐漸降低；Florsil對目標化合物影響較大不適于嗎啉脂肪酸鹽果蠟的凈化。由于柑橘中色素較多，單獨使用PSA雖然凈化效果較好，但是凈化液依然帶有顏色，而使用GCB凈化后為無色溶液。為進一步篩選凈化填料，將最優(yōu)條件下的PSA、GCB和C18分別進行混合同單獨使用PSA凈化效果進行比較（如圖3，mixed-mode）。結果表明，PSA和GCB混合使用的效果最優(yōu)（MS-A），色素的存在對后續(xù)衍生存在一定的干擾，C18的加入對目標化合物有一定的影響。因此，選用300 mg PSA和300 mg GCB作為凈化劑填料。

2.3 衍生效果的優(yōu)化

嗎啉脂肪酸鹽果蠟是由嗎啉、脂肪酸和天然動植物蠟（如棕櫚蠟）或天然動植物膠（如紫膠），在一定溫度下反應制成的食品添加劑。由于嗎啉含有仲胺基團，仲胺在酸性條件下可以和亞硝酸鈉、亞硝酸鹽水溶液或氮氧化物（如N2O3、N2O4、N2OX）發(fā)生亞硝基化反應生成N-亞硝胺（NAms）[19-21]。因此，根據(jù)嗎啉這個特點，實驗發(fā)現(xiàn)即使在常溫條件下，不論嗎啉脂肪酸鹽果蠟取代基團是什么，嗎啉脂肪酸鹽果蠟都可以發(fā)生亞硝基化反應生成亞硝基嗎啉，反應如圖4所示。本實驗分別討論了鹽酸和亞硝酸鈉濃度、反應溫度和時間對衍生效果的影響，使用陽性鮮榨桔汁為樣本，通過峰面積進行比較。由圖5鹽酸和亞硝酸鈉濃度從0 g/L到800 g/L的正交試驗可知，鹽酸在200 g/L濃度下和亞硝酸鈉300 g/L進行混合衍生效果最優(yōu)，隨著濃度的增加衍生效果逐漸降低，通過測量衍生pH發(fā)現(xiàn)，酸性條件下有利于亞硝基化反應，最優(yōu)pH約為3.3左右，當亞硝酸鈉過量時，衍生環(huán)境變成強堿性，對反應成抑制效果。

食品基質中的亞硝基化反應速率會受到許多因素的干擾，如維生素C對反應有抑制作用，會延長反應時間[18]。為減少食品基質對衍生化反應的影響，本實驗探究了不同反應時間和溫度下的反應效率。如圖6所示，隨著時間的延長峰面積逐漸提高，溫度越高亞硝基化反應的速率越慢。當實驗樣本置于冰箱冷凍層溫度設置為-25 ℃時，提取溶劑乙腈會從水相中分離出來從而降低反應速率。因此，最佳的反應溫度為0 ℃反應時間為3 h。

2.4 檢出限、定量限和基質效應的考察

由于嗎啉脂肪酸鹽果蠟種類各不相同，但衍生主要發(fā)生在其母體嗎啉環(huán)上，都是將嗎啉轉變成亞硝基嗎啉，所以使用嗎啉標準儲備液制備1、10、50、100、200、400、800 μg/L 7個不同水平的標準溶液。加入10 mL 1%酸化乙腈，2.5 mL 300 g/L HCl和2.5 mL 200 g/L NaNO240 ℃超聲10 min，冰浴衍生3 h，期間每30 min渦旋一次，每次1 min，衍生完成后加入1 g NaCl，以4000 r/min離心3 min，取上清液2.5 mL至試管中，40 ℃水浴中氮吹至近干，加入1 mL乙腈定容，過0.22 μm有機相濾膜。

在最優(yōu)氣相色譜串聯(lián)質譜條件下，通過質量濃度為橫坐標和目標化合物的峰面積為縱坐標制作標準曲線，得到相應的回歸方程及其相關系數(shù)。對市售水果樣品同水平加標，通過1.3前處理后經氣相色譜串聯(lián)質譜檢測，外標法定量繪制基質標準曲線。基質效應ME（Matrix effect）以基質匹配標準曲線與純空白溶劑標曲斜率之比來確定；最低檢出限（limit of detection，LOD）由3倍信噪比得出（S/N=3）；最低定量限（limit of quantification，LOQ）由10倍信噪比得出（S/N=10）。

分別比較了柑橘、梨和蘋果三種水果全果、果皮和果肉的基質效應，由表2可知，基質效應結果范圍在-28.9到-80.6之間，所有結果均超過基質效應可接受的標準（±20%），基質效應明顯，水果果肉比果皮表現(xiàn)出了更強的基質效應，因此在實際檢測中為保證結果準確，采用基質匹配標準曲線對化合物進行定量分析。衍生后的亞硝基嗎啉在1～800 μg/L范圍內呈良好的線性關系，其線性相關系數(shù)（R2）均大于0.99，亞硝基嗎啉檢出限在0.14～1.09 μg/kg之間，定量限在0.47～3.63 μg/kg之間，該方法可以滿足復雜基質中痕量物質的檢測。

表2 亞硝基嗎啉的線性方程、基質效應、檢出限和定量限Table 2 Analytical performance of the proposed method for NMOR

2.5 回收率和日內精密度實驗結果

空白水果樣品中準確加入嗎啉標準溶液，使添加量分別為4、8、40 μg/kg，按最優(yōu)條件進行測定，方法的準確度用回收率表示，每個添加水平重復測定6次。方法的日內精密度用6次平行測定的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）表示。由表3可知，衍生后的亞硝基嗎啉在不同水果中的加標回收率范圍為73.6%～118.5%，RSD為3.6%～15.2%（n=6）。

表3 嗎啉的添加回收率和RSDTable 3 Average recoveries (n=6) and relative standard deviations (RSD) at three spiking levels

2.6 實際樣品分析

采用優(yōu)化建立的GC-MS/MS分析方法應用于果皮、果肉和整個水果的分析，選擇表面光滑、光亮的水果樣品作為實際監(jiān)測樣品。衍生化后蘋果和梨果肉中NMOR含量較低或未檢出，嗎啉脂肪酸鹽果蠟主要覆蓋在水果表面。全柑橘、柑橘皮、柑橘肉、全蘋果、蘋果皮、全梨和梨皮的NMOR水平分別為95～712、20～366、10～90、98～263、18～132、110～291、20～143μg/kg。柑橘、梨和蘋果中嗎啉脂肪酸鹽果蠟的檢出率分別為78.5%、42.8%、35.7%。這些結果表明，水果中存在嗎啉脂肪酸鹽果蠟的殘留污染，其中柑橘類風險最高。實際樣本結果表明，本方法靈敏度高，方法簡單，在實際樣本中有較高的檢出率，適用于日常水果中嗎啉脂肪酸鹽果蠟的檢測和分析。

3 結論

由于生產加工工藝的不同，市面上的嗎啉脂肪酸鹽果蠟存在多種不同的形式，在檢驗過程中難以對其進行定性和定量。目前水果表面的檢測方法主要是對嗎啉的檢測，具有一定的局限性，無法準確的代表嗎啉脂肪酸鹽果蠟。本實驗根據(jù)嗎啉脂肪酸鹽果蠟的性質，通過亞硝基化反應將嗎啉脂肪酸鹽果蠟轉變成穩(wěn)定的亞硝基嗎啉進行監(jiān)測，使用改進QuEChERS作為前處理方法，對提取試劑、凈化劑種類和用量進行選擇和優(yōu)化，建立了QuEChERS-GC-MS/MS法測定水果中嗎啉脂肪酸鹽果蠟的檢測方法。采用1%甲酸-乙腈為提取溶劑，QuEChERS凈化處理，5.5 mol/L鹽酸和4.3 mol/L亞硝酸鈉進行衍生，實現(xiàn)了嗎啉脂肪酸鹽果蠟的定性和定量方法，檢出限為0.14～1.09 μg/kg，定量限為0.47～3.63 μg/kg，該方法成功的應用于實際水果的檢測，并提供了一種方法簡單、靈敏度高、分離效果好的食品基質中嗎啉脂肪酸鹽果蠟殘留檢測方法，在理論和實際上都具有重要的意義。