黃燕瓊，鄧艷，門星怡，陳婉霞，柏建山

（廣州白云機(jī)場(chǎng)海關(guān)國(guó)家水產(chǎn)品檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510470）

對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病（Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease，AHPND）是由一種攜帶著編碼毒力蛋白pVA1質(zhì)粒的特殊副溶血性弧菌引起的對(duì)蝦病害。2009年以來(lái)，急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）先后在中國(guó)、越南、馬來(lái)西亞、泰國(guó)爆發(fā)，2013年蔓延到西半球的墨西哥。該病發(fā)病快、死亡率高、流行面廣，給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成極大的損失。2013年全球養(yǎng)殖對(duì)蝦產(chǎn)量較2012年減少近四分之一，其中泰國(guó)下降約50%，馬來(lái)西亞對(duì)蝦產(chǎn)量從2010年的7.0×104t下降至2011年的4.0×104t，我國(guó)自1.5×106t下降到1.3×106t，下降約17%[1]，且該病在接下來(lái)的時(shí)間仍將嚴(yán)重影響著我國(guó)對(duì)蝦產(chǎn)量，給我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展帶來(lái)威脅。因此，對(duì)AHPND病原的研究引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，仍將是今后的研究焦點(diǎn)和熱點(diǎn)，針對(duì)該病的快速檢測(cè)方法也在不斷的研究和完善中。鑒于該病的危害嚴(yán)重，目前世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）已將其列入水生動(dòng)物疫病法定報(bào)告目錄。

2014年，我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖成功率仍然很低，發(fā)病率超過(guò)60%。為了滿足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的需求，我國(guó)開始大量進(jìn)口對(duì)蝦，從對(duì)蝦出口大國(guó)變?yōu)檫M(jìn)口國(guó)，嚴(yán)重影響了我國(guó)對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展[2]。目前，從廣州口岸進(jìn)境的對(duì)蝦主要是來(lái)自越南、泰國(guó)、馬來(lái)西亞三個(gè)國(guó)家，數(shù)量從2016年的1072.08 t增長(zhǎng)到2018年的1990.83 t，金額從2016年的1404.85萬(wàn)美元增長(zhǎng)到2018年的2596.99萬(wàn)美元。其中越南的對(duì)蝦進(jìn)口量占總進(jìn)口量的70%多，而這幾個(gè)國(guó)家的養(yǎng)殖對(duì)蝦也是急性肝胰腺壞死病爆發(fā)嚴(yán)重的國(guó)家。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)，利用4條特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)區(qū)域，并加入兩條環(huán)引物加速反應(yīng)，利用一種具有鏈置換功能的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒溫條件（60～65 ℃）反應(yīng)40～60 min，即可完成反應(yīng)。LAMP的結(jié)果判斷方法很多，可以選擇熒光法，在反應(yīng)體系中加入熒光染料，用熒光檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)控，不用開蓋，可以防止氣溶膠的污染，適合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)；也可以選擇染色法，擴(kuò)增后在反應(yīng)液中加入熒光染料，混勻后看是否有顏色變化，適合實(shí)地檢測(cè)。本研究對(duì)2017～2018兩年間白云機(jī)場(chǎng)口岸進(jìn)境的453批次對(duì)蝦樣品進(jìn)行AHPND病原的分離和鑒定并進(jìn)行結(jié)果分析，建立快速檢測(cè)AHPND病原的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）方法，并對(duì)其特異性、靈敏性、穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，該病原的分離鑒定結(jié)果分析為進(jìn)口對(duì)蝦的檢測(cè)提供了參考數(shù)據(jù)，快速檢測(cè)方法的建立為各實(shí)驗(yàn)室和基層養(yǎng)殖企業(yè)提供一種更加快速和容易操作的方法選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

白云機(jī)場(chǎng)口岸進(jìn)境的對(duì)蝦樣品分別來(lái)自越南、泰國(guó)、馬來(lái)西亞三個(gè)國(guó)家，本研究在2017～2018年兩年間從這三個(gè)國(guó)家進(jìn)境的對(duì)蝦樣品中共抽取453批次進(jìn)行AHPND病原分離鑒定。每批次重2 kg，采2 g肝胰腺組織。

1.1.2 主要儀器和試劑

3K15冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sima公司；C1000梯度PCR儀、電泳儀，美國(guó)Bio-rad公司；ABI QuantStudio7Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司；Multiskan GO全波長(zhǎng)讀數(shù)儀，美國(guó)Thermo公司。

引物由北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司合成；甜菜堿（Betaine）和MgSO4，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Bst DNA polymerase large fragment、10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、SYBR Green I熒光染料，購(gòu)自New England Biolabs公司；DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、18-T載體克隆試劑盒、DH5α菌株、質(zhì)粒提取試劑盒、Taq酶、Mg2+、dNTPs和PCR10×Buffer反應(yīng)液，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 AHPND病原分離鑒定和感染分析

1.2.1 AHPND病原富集增菌培養(yǎng)

肝胰腺組織勻漿后按照核酸抽提試劑盒的操作要求提取基因組DNA，后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。剩下的組織勻漿液按1:10的比例放入3% APW（氯化鈉堿性蛋白胨水）培養(yǎng)基中，30 ℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，離心棄上清，再進(jìn)行核酸抽提和PCR擴(kuò)增。

1.2.2 AHPND病原特定基因的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增使用OIE《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)第2.2.1章》中推薦的引物AP3，檢測(cè)AHPND致病相關(guān)的基因pVA1。引物序列為：AP3-F：5’-ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3’ ；AR3-R：5’-GTGGTAATAGATTGTACAGAA-3’[3]。反應(yīng)體系（25 μL）為：2.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+free），0.7 μL 50 mmol/L MgCl2，0.4 μL 10 mmol/L dNTP Mix，0.5 μL 10 μmol/L AP3上游引物，0.5 μL 10 μmol/L AP3下游引物，1.25 U Taq酶，DNA模板2 μL，DEPC水補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、53 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min；4 ℃保溫。取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳20 min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照記錄結(jié)果。AHPND致病相關(guān)的基因pVA1的目的片段為333 bp，在333 bp處有明顯條帶的判定為AHPND病原可疑。

1.2.3 AHPND病原菌株分離

將可疑的肝胰腺組織培養(yǎng)液用無(wú)菌接種環(huán)蘸取后于TCBS（硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖）瓊脂平板上劃線分離，劃5～10個(gè)平板，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～18 h。挑取符合典型副溶血弧菌的可疑菌落，分別接種到5 mL 3% APW培養(yǎng)基的試管中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～18 h，后用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌液基因組DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增（反應(yīng)體系和條件如1.2.2）。

1.2.4 AHPND病原菌株鑒定

擴(kuò)增產(chǎn)物為可疑AHPND陽(yáng)性的則進(jìn)行生化鑒定（按照GB 4789.7-2013進(jìn)行），確定是否符合副溶血性弧菌生化反應(yīng)結(jié)果。同時(shí)將菌液PCR產(chǎn)物送測(cè)序，經(jīng)BLAST比對(duì)后，確定該分離的菌株是否為攜帶致病基因pVA1的特殊副溶血性弧菌。

1.2.5 AHPND病原分離鑒定結(jié)果分析

對(duì)453批次的進(jìn)境對(duì)蝦感染AHPND病原的分離鑒定結(jié)果進(jìn)行分析，確定越南、泰國(guó)、馬來(lái)西亞三個(gè)國(guó)家進(jìn)境對(duì)蝦感染AHPND病原的陽(yáng)性檢出率情況。

1.3 AHPND-LAMP引物的設(shè)計(jì)合成，構(gòu)建反應(yīng)體系和優(yōu)化反應(yīng)條件

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以急性肝胰腺壞死病病原質(zhì)粒pVA1的AP2基因作為靶基因，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer 4.0設(shè)計(jì)包括環(huán)引物在內(nèi)的6條LAMP引物，利用BLAST工具對(duì)引物序列進(jìn)行特異性比對(duì)，并利用DNAMAN和Oligo 7.0軟件對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配等情況進(jìn)行分析。引物由北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司合成，利用BLAST工具對(duì)引物序列進(jìn)行特異性比對(duì)，使用陽(yáng)性樣品，分別對(duì)引物進(jìn)行篩選，選取表現(xiàn)最好的引物。引物序列見表1。

表1 LAMP引物序列Table 1 Sequence of primers for the LAMP

1.3.2 AHPND病原檢測(cè)靶標(biāo)基因pVA1的AP2質(zhì)粒構(gòu)建

用LAMP引物的外引物F3、B3對(duì)AHPND病原基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Takara公司的Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒，按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行DNA片段的回收，使用Takara公司的pMDTM 18-T Vector Cloning Kit試劑盒，按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建，使用Takara公司的Plasmid Purification Kit Ver.4.0試劑盒，按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行質(zhì)粒的提取。用Multiskan GO全波長(zhǎng)讀數(shù)儀檢測(cè)質(zhì)粒DNA的濃度，將質(zhì)粒置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 AHPND-LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化

本研究采用優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系及條件，25 μL反應(yīng)體系含有：8 mmol/L dNTP mix、10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、100 mmol/L MgSO4水溶液、5 mol/L甜菜堿、F3 0.2 μmol/L、B3 0.2 μmol/L、FIP 1.6 μmol/L、

BIP 1.6 μmol/L、LF 0.8 μmol/L、LB 0.8 μmol/L、DNA

聚合酶8 U、10×SYBR Green I 0.5 μL，待檢樣品2 μL，用超純水補(bǔ)齊至25 μL，最后在體系表面加密封油防止污染。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和15次陰性對(duì)照平行，在熒光檢測(cè)系統(tǒng)中，63 ℃反應(yīng)45～60 min。如果用染色法則將反應(yīng)液置于金屬浴或水浴鍋中63 ℃反應(yīng)30～45 min，再把1 μL 1000×SYBR Green I顯色液小心滴在反應(yīng)管蓋中間，然后顛倒混勻反應(yīng)管，觀察反應(yīng)液顏色，若呈現(xiàn)黃綠色則為陽(yáng)性，呈現(xiàn)橙色則為陰性。

1.3.4 靈敏性分析

將陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別以1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、100 ag/μL八個(gè)梯度濃度作為模板和陰性對(duì)照（滅菌超純水），用優(yōu)化的熒光法、染色法進(jìn)行檢測(cè)，以確定AHPND-LAMP反應(yīng)體系的靈敏性。同時(shí)使用相同稀釋度的模板進(jìn)行普通PCR反應(yīng)，對(duì)比兩種方法的檢測(cè)靈敏性。

1.3.5 特異性分析

用建立的AHPND-LAMP的反應(yīng)體系和條件對(duì)含傳染性皮下和造血器官壞死病毒（IHHNV）、對(duì)蝦白斑綜合癥病（WSSV）、斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒（MBV）、蝦細(xì)菌性肝胰腺壞死?。∟HPB）、對(duì)蝦桿狀病毒（BP）、對(duì)蝦黃頭病毒（YHV）、對(duì)蝦桃拉病毒（TSV）和副溶血弧菌DNA（不含pVA1基因）及AHPND病原的陽(yáng)性模板進(jìn)行擴(kuò)增和結(jié)果判定。IHHNV、WSSV、MBV、YHV、副溶血弧菌均由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存，NHPB、BP、TSV由廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司贈(zèng)予。

1.3.6 穩(wěn)定性分析

以濃度為100 pg/μL和1 pg/μL的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板DNA，各自設(shè)置15次平行，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（滅菌超純水），用優(yōu)化的AHPND-LAMP反應(yīng)體系和條件進(jìn)行熒光法檢測(cè)，計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV），以確定AHPND-LAMP方法的穩(wěn)定性。

1.3.7 AHPND-LAMP方法與普通PCR方法的比對(duì)

用AHPND-LAMP熒光法對(duì)37批次進(jìn)境對(duì)蝦樣品（越南21批次、泰國(guó)9批次、馬來(lái)西亞7批次）進(jìn)行AHPND病原的檢測(cè)，并與普通PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 AHPND病原分離鑒定和結(jié)果分析

分離的菌株符合副溶血性弧菌生化反應(yīng)結(jié)果，同時(shí)菌液PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的AHPND參考序列（BAVF00000000.1）[4]的同源性達(dá)到98%～99%，則確定該分離的菌株為攜帶致病基因pVA1的特殊副溶血性弧菌[4-6]。

由于廣州白云機(jī)場(chǎng)口岸進(jìn)境的對(duì)蝦是食用養(yǎng)殖鮮活對(duì)蝦，進(jìn)境時(shí)外觀上觀察都是健康的。采用無(wú)菌接種環(huán)蘸取肝胰腺組織劃線接種到培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后很難分離出形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌群。本研究采用兩種病原的分離方法，一種是直接用對(duì)蝦的肝胰腺組織抽提基因組DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分離病原；另一種是采用OIE《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)第2.2.1章》中的要求，把肝胰腺組織富集培養(yǎng)后抽提基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增再分離病原。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：取對(duì)蝦的肝胰腺組織不富集培養(yǎng)直接進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢出核酸陽(yáng)性13批次，感染率僅2.87%，且無(wú)法分離出陽(yáng)性菌株；取肝胰腺組織經(jīng)過(guò)富集增菌培養(yǎng)后，檢出核酸陽(yáng)性73批次，感染率則高達(dá)16.11%。自越南、泰國(guó)、馬來(lái)西亞進(jìn)境的453批次對(duì)蝦樣品中，越南的對(duì)蝦樣品陽(yáng)性感染率最高，達(dá)到21.79%，分離出11株陽(yáng)性菌株，分離成功率為15.07%。泰國(guó)進(jìn)境對(duì)蝦感染率只有0.05%，未分離出陽(yáng)性菌株。而馬來(lái)西亞的進(jìn)境對(duì)蝦未檢出AHPND病原（見表2）。

表2 2017～2018年進(jìn)境對(duì)蝦AHPND分離鑒定情況Table 2 Identification results of imported shrimp in 2017~2018

由此可見，針對(duì)病原含量不高的亞臨床感染樣品或環(huán)境樣品，富集增菌培養(yǎng)后再進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室來(lái)講，是非常必要的，可以防止大量的漏檢情況出現(xiàn)。采肝胰腺→富集增菌培養(yǎng)→PCR初篩→分離菌株→菌株鑒定，是比較好的AHPND病原分離方法[7-11]。

2.2 AHPND-LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

觀察AHPND-LAMP反應(yīng)結(jié)果，熒光法最佳的反應(yīng)條件是63 ℃ 30 s；63 ℃ 15 s，63 ℃ 45 s，60個(gè)循環(huán)，最佳的反應(yīng)時(shí)間是60 min 30 s（見圖1）；而染色法最佳的反應(yīng)時(shí)間是45 min。

2.3 AHPND-LAMP靈敏性檢測(cè)

將陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋后進(jìn)行LAMP檢測(cè)，當(dāng)模板濃度為1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μL時(shí)有明顯的擴(kuò)增曲線和顏色變化，可見質(zhì)粒的檢測(cè)限為1 fg/μL（圖2a，b）。采用普通PCR方法對(duì)同樣濃度的質(zhì)粒模板進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)模板濃度為1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL時(shí)有目標(biāo)條帶，可見其檢測(cè)限為100 fg/μL（見圖3）。綜合上述檢測(cè)方法的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本文建立的AHPND-LAMP檢測(cè)方法具有很高的靈敏度，且LAMP方法的靈敏度比PCR方法高出兩個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.4 AHPND-LAMP特異性檢測(cè)

使用優(yōu)化后的AHPND-LAMP反應(yīng)方法，對(duì)10種蝦類疫病進(jìn)行檢測(cè)，熒光法只有AHPND出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，其他疫病沒有擴(kuò)增曲線；染色法只有AHPND出現(xiàn)黃綠色，其他疫病都是橙色。說(shuō)明設(shè)計(jì)的AHPND-LAMP反應(yīng)引物特異性良好（見圖4）。

2.5 AHPND-LAMP穩(wěn)定性檢測(cè)

用100 pg/μL和1 pg/μL的質(zhì)粒模板進(jìn)行15次重復(fù)試驗(yàn)，驗(yàn)證AHPND-LAMP熒光反應(yīng)方法的穩(wěn)定性。如圖5所示，模板濃度為100 pg/μL和1 pg/μL的15次平行試驗(yàn)中，均產(chǎn)生“S”型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增；同一個(gè)模板濃度出峰時(shí)間相差不大，Ct值的變異系數(shù)小于3%（見表3）。由此可見，本文建立的AHPND-LAMP方法具有良好的穩(wěn)定性。

表3 LAMP法檢測(cè)AHPND病原的穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 3 Assessment of stability for the AHPND-LAMP assay

2.6 LAMP方法與普通PCR方法的比對(duì)

對(duì)進(jìn)境的對(duì)蝦肝胰腺組織樣品富集培養(yǎng)后進(jìn)行AHPND-LAMP熒光法檢測(cè)，并與普通PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比對(duì)。共37個(gè)實(shí)際樣本，其中LAMP檢測(cè)有13個(gè)AHPND病原陽(yáng)性樣本，陽(yáng)性率為35.13%，陽(yáng)性檢出率高于普通PCR檢測(cè)結(jié)果（見表4）。說(shuō)明本研究建立的LAMP方法對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)的適用性良好。

表4 實(shí)際樣品中LAMP和PCR方法檢測(cè)AHPND病原的結(jié)果Table 4 Detection results of samples by LAMP method and PCR method

3 結(jié)論

3.1 目前，關(guān)于對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病（Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease，AHPND）的研究更多的是聚焦在病原的確定、致病機(jī)理分析和檢測(cè)方法的建立方面，針對(duì)不同樣品的病原分離鑒定的研究較少涉及。在病原的分離鑒定上，都是直接采用無(wú)菌接種環(huán)蘸取肝胰腺組織劃線接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行菌株分離，這種分離方法適用于病原含量高的樣品，不適用于病原含量不高的亞臨床感染樣品或環(huán)境樣品。本研究在分離AHPND的病原時(shí)發(fā)現(xiàn)針對(duì)病原含量不高的亞臨床感染樣品或環(huán)境樣品，富集增菌培養(yǎng)后再進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室來(lái)講，是非常必要的，不僅可以防止大量的漏檢情況出現(xiàn)，而且可以提高病原的檢出率。采樣→富集增菌培養(yǎng)→PCR初篩→分離菌株→菌株鑒定，是比較好的病原分離方法。但是在病原菌株分離過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行肝胰腺組織富集增菌培養(yǎng)的時(shí)候，AHPND的病原菌株在大量增殖的同時(shí)，存在于肝胰腺中的普通副溶血性弧菌也在大量的增殖，而且普通副溶血性弧菌常常會(huì)形成優(yōu)勢(shì)菌群，壓制AHPND的病原菌株生長(zhǎng)，劃板挑菌時(shí)，常常挑到的是普通副溶血性弧菌，這給AHPND病原菌株的準(zhǔn)確分離帶來(lái)很大的干擾。使用OIE《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)第2.2.1章》的富集增菌方法來(lái)分離AHPND的病原菌株，對(duì)于樣品量多的檢測(cè)，仍不是一個(gè)十分高效的方法。所以如何優(yōu)化AHPND病原菌株的分離鑒定方法，仍是檢測(cè)上需要進(jìn)一步研究解決的問題。

3.2 本研究建立的AHPND病原LAMP檢測(cè)方法，其特異性好，僅AHPND病原具有明顯的擴(kuò)增曲線和顏色變化，沒有交叉反應(yīng)，靈敏度可達(dá)到1 fg/μL，比普通PCR方法高100倍。對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，陽(yáng)性檢出率高于PCR檢測(cè)結(jié)果。傳統(tǒng)的PCR方法至少需要2～3 h，而LAMP方法可在60 min 30 s內(nèi)完成反應(yīng)。本檢測(cè)方法非常適用于基層實(shí)驗(yàn)室，為AHPND病原的快速鑒定、流行病學(xué)調(diào)查和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控等提供了更好的方法選擇。