徐婧，劉喜明，馬文欣，付守強，楊九天，朱曉云

1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029； 2.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)是機體發(fā)生多種代謝異常的全身性疾病，已發(fā)展為當今世界危害健康的主要因素之一。據(jù)統(tǒng)計，全球MS患者已超過10億[1]，在中國城市人口中MS的患病率可達到36.4%[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，MS發(fā)病受飲食結(jié)構(gòu)、生活方式等影響，發(fā)病機制復雜多樣，與胰島素抵抗、肝臟脂肪變性等有關(guān)。西藥作用大多局限于對單一代謝損傷的治療，而MS疾病本身屬于系統(tǒng)性失調(diào)，中醫(yī)藥的整體治療作用存在獨特優(yōu)勢[3]。中醫(yī)學認為，MS病位在脾，過食肥甘厚膩或久坐少動損傷脾氣，脾主運化水谷精微，脾虛不運則痰濕內(nèi)生，進而出現(xiàn)熱、濁、瘀等病理因素，導致機體代謝失衡，臨床治療應以健脾祛濕為主，兼顧祛痰除濕，以恢復中焦運化之職。

“白術(shù)-茯苓”藥對是健脾祛濕的常用組合，出現(xiàn)在四君子湯、參苓白術(shù)散、苓桂術(shù)甘湯等經(jīng)典方劑中。研究表明，含有藥對“白術(shù)-茯苓”的方劑在MS的臨床治療中效果顯著[4-5]。在中醫(yī)藥治療MS的處方挖掘研究中，由關(guān)聯(lián)規(guī)則的組方規(guī)律分析得出白術(shù)、茯苓均是處方中的高頻藥物，白術(shù)、茯苓配伍可作為治療MS的核心藥對[6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，白術(shù)、茯苓通過增加骨骼肌葡萄糖攝取、抑制脂肪細胞分化、減輕肝臟脂質(zhì)沉積等多種機制改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)糖脂代謝，對MS的治療具有重要意義[7-12]。然而，關(guān)于白術(shù)、茯苓配伍的整體性治療作用少見報道，本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法探討“白術(shù)-茯苓”治療MS 的分子機制。

1 資料與方法

1.1 “白術(shù)-茯苓”活性成分的篩選在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)[13]分別輸入中藥名稱“白術(shù)”“茯苓”查找其化學成分，并獲得相應的Molecule ID(Mol ID)，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug likeness，DL)≥0.18的標準進行初步篩選，獲得白術(shù)、茯苓的有效活性成分。通過查閱文獻，進一步補充白術(shù)、茯苓的有效活性成分。

1.2 活性成分相關(guān)作用靶點的預測PharmMapper數(shù)據(jù)庫(version 2017，http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper)是一個在線網(wǎng)絡服務器，通過反向藥效團將查詢化合物與內(nèi)部藥效團模型數(shù)據(jù)庫進行匹配來識別潛在的藥物靶標[14-16]。在TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索并下載活性成分的分子結(jié)構(gòu) mol2類型文件，導入PharmMapper數(shù)據(jù)庫平臺，設定為僅針對人類的蛋白質(zhì)靶點“Human Protein Targets Only”，預測“白術(shù)-茯苓”活性成分的作用靶點。根據(jù)標準化擬合得分(normalized fit score)排序，選擇得分≥0.9的靶點，去重后獲得最終的作用靶點。使用Universal Protein(Uniprot)數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org)對靶點名稱進行標準化。

1.3 MS相關(guān)靶點的篩選在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https：//www.genecards.org)[17]、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https：//www.disgenet.org)[18]和治療靶標數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd)[19]中輸入“metabolic syndrome”檢索MS相關(guān)疾病靶點，并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點名稱進行標準化。

1.4 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡的構(gòu)建取“白術(shù)-茯苓”活性成分的作用靶點與MS靶點的交集，獲得“白術(shù)-茯苓”治療MS的潛在靶點，利用R軟件生成韋恩圖對結(jié)果進行展示。利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物—活性成分—潛在作用靶點”網(wǎng)絡，并進行可視化，用不同顏色和形狀標記各部分內(nèi)容及其相互關(guān)系。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(protein-protein interaction，PPI)的構(gòu)建和核心靶點的篩選在String平臺(Version 11.0，https：//string-db.org)[20]選擇“Multiple proteins”，輸入潛在治療靶點，設置物種為“Homo sapiens”，設定中等置信度為0.40，得到靶點蛋白之間相互作用關(guān)系。保存String平臺生成的TSV文件，導入Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，并使用CytoHubba 插件進一步篩選核心靶點。

1.6 富集分析使用R軟件Version 3.5.2將“白術(shù)-茯苓”對MS有潛在治療作用的靶點進行基因本體(gene ontology，GO)分子功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，設定P<0.05，將結(jié)果以條形圖和氣泡圖的形式輸出。

2 結(jié)果

2.1 “白術(shù)-茯苓”藥對活性成分在TCMSP平臺檢索得到白術(shù)、茯苓活性成分分別有55種、34種。依據(jù)OB≥30%、DL≥0.18篩選后，最終獲得白術(shù)活性成分7種，茯苓活性成分15種。查閱相關(guān)文獻[7，10，21]，補充白術(shù)有效活性成分3種，分別為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ (atractylenolide Ⅰ)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ (atractylenolide Ⅱ)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ (atractylenolide Ⅲ)；補充茯苓有效活性成分1種，為松苓新酸(3β-hydroxylanosta-7，9(11)，24-trien-21-oic acid)。見表1。

表1 “白術(shù)-茯苓”活性成分

2.2 “白術(shù)-茯苓”藥對潛在作用靶點使用PharmMapper數(shù)據(jù)庫預測作用靶點，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫標準化，得到白術(shù)作用靶點59個，茯苓作用靶點81個，其中白術(shù)、茯苓重疊靶點共54個，去重后最終得到“白術(shù)-茯苓”藥對作用靶點86個。

2.3 MS相關(guān)靶點在GeneCards數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫及TTD數(shù)據(jù)庫中分別檢索得到MS靶點1 889個、1 125個和2個。合并三個數(shù)據(jù)庫的靶點并去重后，最終得到MS相關(guān)靶點2 584個。

2.4 “白術(shù)-茯苓”治療MS的潛在作用靶點使用R軟件將獲得的“白術(shù)-茯苓”藥對作用靶點與MS疾病靶點取交集，得到“白術(shù)-茯苓”藥對治療MS的潛在靶點共47個。見圖1。

圖1 MS靶點與“白術(shù)-茯苓”藥對作用靶點的韋恩圖

2.5 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建應用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡，共呈現(xiàn)出75個節(jié)點和463條邊。根據(jù)degree值≥25篩選得到“白術(shù)-茯苓”治療MS的重要活性成分，包括茯苓新酸A、14-乙?；?12-千里光?；?8-順式白術(shù)三醇、茯苓新酸B、7，9(11)-去氫茯苓酸、茯苓新酸C、氫化松苓酸、14-乙?；?12-千里光?；?8-反式白術(shù)三醇等。其中茯苓新酸A、茯苓新酸B、茯苓新酸C、7，9(11)-去氫茯苓酸、氫化松苓酸屬于茯苓的三萜類化合物；14-乙?；?12-千里光酰基-8-順式白術(shù)三醇和14-乙?；?12-千里光酰基-8-反式白術(shù)三醇屬于白術(shù)的多炔類化合物。見圖2。

注：粉紅色菱形代表白術(shù)、茯苓；黃色長方形代表白術(shù)的活性成分，橙色長方形代表茯苓的活性成分；綠色橢圓形代表“白術(shù)-茯苓”治療MS的靶點；灰色邊線代表藥物、成分、靶點之間的相互關(guān)聯(lián)

2.6 潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡分析和核心靶點篩選在String平臺中導入“白術(shù)-茯苓”藥對治療MS的47個潛在治療靶點，得到靶點蛋白之間的相互作用關(guān)系。在Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，網(wǎng)絡顯示了43個節(jié)點和195條邊。使用CytoHubba 插件，提取degree值前10位的核心靶點，分別為血清白蛋白(albumin，ALB)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶1 (mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、雌激素受體1 (estrogen receptor，ESR1)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC)、MAPK8、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3，CASP3)、MAPK14、一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3，NOS3)、雄激素受體(androgen receptor，AR)。見表2，圖3。

表2 核心靶點

注：顏色越紅代表degree值越大

2.7 GO分子功能富集分析使用R軟件對47個潛在治療靶點進行GO分子功能富集分析。以False Discovery Rate(FDR)校正P值，篩選得到P<0.05的71條顯著結(jié)果，涉及調(diào)節(jié)類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、類固醇結(jié)合(steroid binding)、核受體活性(nuclear receptor activity)、直接配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity，direct ligand regulated sequence-specific DNA binding)、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)、ATP酶結(jié)合(ATPase binding)、MAP激酶活性(MAP kinase activity)等。用條形圖展示了前20個結(jié)果。見圖4。

圖4 GO分子功能富集分析

2.8 KEGG通路富集分析使用R軟件對47個潛在治療靶點進行KEGG通路富集分析，以FDR校正P值，共得到P<0.05的93條顯著結(jié)果，涉及內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)、松弛素信號通路(relaxin signaling pathway)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)、催乳素信號通路(prolactin signaling pathway)、晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體信號通路(advanced glycation end product-receptor signaling pathway，AGE-RAGE signaling pathway)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子信號通路(forkhead box O signaling pathway，F(xiàn)oxO signaling pathway)、受體酪氨酸激酶信號通路(receptor tyrosine-protein kinase signaling pathway，ErbB signaling pathway)、白細胞介素-17信號通路(interleukin17 signaling pathway，IL-17 signaling pathway)等途徑。用氣泡圖展示了前20個結(jié)果。見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析

3 討論

MS病情復雜多樣，患者不僅會出現(xiàn)肥胖、糖脂代謝紊亂、血壓升高，還常伴隨胰島素抵抗、肝臟脂肪變性、慢性炎癥等病理狀態(tài)?，F(xiàn)代醫(yī)學對MS發(fā)病機制的研究也多從以上幾個方面展開，但目前仍未完全闡明。中醫(yī)理論認為，脾主運化水谷精微，司升清降濁，維持人體整體的代謝平衡。過食肥甘厚膩和久坐少動是MS的常見病因。飲食不節(jié)、肥甘厚味使脾氣受損，久坐少動使脾氣不暢，導致水谷精微運化失常，痰濕內(nèi)生[3]。水谷精微不歸正化，入血則表現(xiàn)為血糖、血脂紊亂等；布散失常，聚生痰濕，百骸九竅不得濡養(yǎng)，久之則機體組織功能失調(diào)進而導致對胰島素的敏感性下降，出現(xiàn)胰島素抵抗；痰濕泛溢三焦、臟腑，可出現(xiàn)肥胖、肝脂質(zhì)沉積。因此，健脾祛濕對MS的治療有重要意義。

“白術(shù)-茯苓”是健脾祛濕的經(jīng)典組合，也是中醫(yī)治療MS處方中的常用配伍。白術(shù)味甘、苦，性溫；茯苓味淡、微甘，性平?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》認為，甘為中央脾土之味，故兩藥均有甘以健脾之效。而脾最惡濕，白術(shù)苦溫燥濕，茯苓淡滲利濕。白術(shù)入脾、胃經(jīng)，為脾家要藥，補脾之力更強；茯苓入脾、肺經(jīng)，肺通調(diào)水道，利濕之力更著，兩藥配伍，一補一滲，一燥一利，相須為用，使痰濕祛而脾運復，脾氣健而痰濕自除[22]。含有白術(shù)、茯苓配伍的方劑如參苓白術(shù)散、苓桂術(shù)甘湯、四君子湯等，在MS治療中收效甚佳。研究表明，參苓白術(shù)散、苓桂術(shù)甘湯能夠有效降低MS患者體質(zhì)量指數(shù)、血糖、血脂，改善糖脂代謝[4-5]；四君子湯能夠有效降低肥胖小鼠的腹圍、三酰甘油、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇等，減少內(nèi)臟的脂質(zhì)沉積[23]。王曉雪等[6]對112個治療MS的中醫(yī)處方分析得出“白術(shù)-茯苓”配伍發(fā)揮了核心治療作用?，F(xiàn)代藥理學研究表明，白術(shù)、茯苓相關(guān)提取物能夠調(diào)節(jié)機體糖代謝、脂代謝，提高胰島素敏感性，逆轉(zhuǎn)肝臟脂肪變性[7-12]，然而，鮮有關(guān)于“白術(shù)-茯苓”藥對整體作用機制的研究。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法分析白術(shù)、茯苓配伍對MS整體治療作用的分子機制。

本研究通過藥物活性成分、作用靶點篩選以及“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)茯苓有效活性成分較白術(shù)多，其潛在的治療靶點也較多，說明在MS治療中茯苓可能發(fā)揮了更重要的作用。研究中挖掘的茯苓活性成分茯苓新酸A、茯苓新酸B、茯苓新酸C、去氫茯苓酸等大多為三萜類化合物。既往研究表明，茯苓的三萜類成分能夠有效緩解小鼠因過食肥甘導致的脾虛癥狀[24]。茯苓新酸介導肝臟脂質(zhì)代謝，可誘導游離脂肪酸處理的肥胖小鼠肝癌HepG2細胞中AMP蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)磷酸化，降低細胞內(nèi)TG的積累，減輕肝臟脂肪變性[25]。而去氫茯苓酸具有顯著的胰島素增敏活性，可增加3T3-L1脂肪細胞中胰島素刺激下的葡萄糖攝取，改善胰島素抵抗[26]。白術(shù)在MS治療中同樣發(fā)揮重要作用，本研究挖掘的活性成分以多炔類和內(nèi)酯類為主。既往研究關(guān)于內(nèi)酯類成分較多，白術(shù)內(nèi)酯能通過激活AMPK和PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)途徑促進小鼠骨骼肌C2C12細胞對葡萄糖的攝取，改善腫瘤壞死因子-α誘導的骨骼肌胰島素抵抗，發(fā)揮降血糖作用[21]。

通過潛在治療靶點PPI網(wǎng)絡構(gòu)建和核心靶點篩選，本研究發(fā)現(xiàn)ALB、EGFR、ESR1、MAPK1、SRC、MAPK8、MAPK14等靶點與MS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。既往研究表明，高脂飲食誘導的MS大鼠肝臟中ALB基因表達明顯上調(diào)，且與三酰甘油含量存在正相關(guān)性[27]。ALB基因編碼的血清白蛋白是血漿的主要蛋白質(zhì)，對脂肪酸、激素、藥物等具有良好的結(jié)合能力。研究發(fā)現(xiàn)，老年群體血清ALB濃度越高，出現(xiàn)高血糖的風險越高[28]。而在體質(zhì)量正常的中青年MS患者中也觀察到了較高的血清ALB濃度[29]。因此，ALB可以作為MS的篩查指標之一。EGFR基因編碼的表皮生長因子受體，是受體酪氨酸激酶ErbB家族的成員，又稱ErbB1。研究表明，EGFR介導的ErbB信號通路能夠間接激活細胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、Src激酶等途徑影響細胞的分化、凋亡。抑制EGFR活性，一方面能夠減少氧化應激和胰島巨噬細胞浸潤并促進胰島自噬，增加葡萄糖耐量，提高胰島素敏感性和胰島素表達[30]；另一方面能夠抑制PI3K/PKB信號通路以及固醇反應性基本結(jié)合蛋白1和2(sterol regulatory element binding protein 1/2，SREBP1/2)的表達，減少脂肪生成和膽固醇合成，增強脂肪酸氧化，減少肝脂肪沉積[31]。ESR1基因編碼雌激素受體1，也稱ESRα，ESRα與雌激素結(jié)合后激活雌激素信號通路，進一步調(diào)節(jié)機體血糖、血脂、血壓[32]；還可調(diào)節(jié)白色脂肪組織中血管內(nèi)皮生長因子A的表達，對促進血管生成，減少炎癥和改善脂肪組織功能有重要意義[33]。MAPK1、MAPK8、MAPK14基因編碼的蛋白激酶都是MAPK家族最經(jīng)典的成員，通過將細胞外信號傳遞至細胞內(nèi)來調(diào)節(jié)多種細胞活動，包括細胞增殖、分化、遷移、凋亡等[34]。MAPK1又稱細胞外信號調(diào)節(jié)激酶2 (extracellular regulated protein kinase 2，ERK2)，與脂質(zhì)代謝有關(guān)，可通過自噬相關(guān)蛋白7依賴性自噬調(diào)節(jié)肝脂質(zhì)代謝[35]。MAPK8又稱為c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase，JNK1)，主要通過激活炎性因子的釋放或減少肝細胞中脂肪酸的氧化分解等，在肥胖誘導的胰島素抵抗形成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[36]。MAPK14是p38 MAPK中的一種，其活性在MS患者單核細胞中選擇性增加，可作為改善胰島素抵抗和炎癥的關(guān)鍵分子靶標[37]。

本研究通過KEGG通路富集推測“白術(shù)-茯苓”治療MS可能通過雌激素信號通路、AGE-RAGE信號通路、FoxO信號通路、ErbB信號通路、IL-17 信號通路等途徑。這些信號通路的激活或抑制通?？梢栽贛S治療中發(fā)揮著改善血糖、降低血脂、穩(wěn)定血壓等雙重或多重作用。①雌激素信號通路：對MS患者的血糖、血脂、血壓均有調(diào)節(jié)作用。雌激素與ESR1結(jié)合后激活通路，促進胰島β細胞分泌胰島素，提高胰島素的敏感性[38]；還可上調(diào)α腎上腺素能受體的表達而加速脂肪的分解，下調(diào)SREBP-1等抑制脂肪的積累[39]；通過降低血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性，影響腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)降低血壓[40]。②AGE-RAGE信號通路：高脂高糖飲食會造成內(nèi)源性晚期糖基化終末產(chǎn)物的形成與積累。AGEs增加可誘導RAGE產(chǎn)生并通過 AGE-RAGE信號通路激活下游細胞信號的級聯(lián)反應，導致氧化應激和慢性炎癥，進而出現(xiàn)胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂，形成MS[41]。③FoxO信號通路：FoxO介導的肝胰島素信號具有調(diào)節(jié)肝臟糖異生和脂質(zhì)合成的作用[42]。FoxO1的磷酸化和乙?；捎绊懫咸烟悄褪埽黾犹悄虿〉幕疾★L險[43]。持續(xù)高熱量飲食使肥胖小鼠FoxO1基因表達增加誘發(fā)肝臟胰島素抵抗[44]。④ErbB信號通路：EGFR二聚化是ErbB1信號傳導的初始步驟，可刺激酪氨酸殘基的磷酸化，激活下游MAPK途徑和PI3K/PKB途徑影響糖脂代謝[31]。⑤IL-17信號通路：IL-17能夠激活包括ERK、JNK、p38在內(nèi)的MAPK途徑[45]，對糖代謝起調(diào)節(jié)作用；還可通過抑制羥甲基戊二酰輔酶A還原酶減少脂質(zhì)的合成，顯著降低三酰甘油、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的水平[46]。

本研究初步探討了“白術(shù)-茯苓”藥對治療MS的分子機制，體現(xiàn)出中藥多成分、多靶點、多途徑的整體治療優(yōu)勢。但考慮到各數(shù)據(jù)庫分析算法的機械性、藥物煎煮的成分變化等問題，后期需要通過細胞、動物實驗等進一步精準驗證。本研究為“白術(shù)-茯苓”藥對治療MS的機制研究提供大致方向，有一定的理論參考價值。