關(guān)建華，逯遙，黃彬，2，蘭煒蘭，林久茂，2

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122； 2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類健康，腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的一大生物學(xué)特征，其中淋巴道轉(zhuǎn)移不僅是腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要途徑[1]，還是判斷預(yù)后的一個(gè)重要依據(jù)[2]。關(guān)于腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移大多認(rèn)為是腫瘤通過誘導(dǎo)淋巴管生成之后所產(chǎn)生的現(xiàn)象，與淋巴管的生成密切相關(guān)[3]。因此，抗腫瘤相關(guān)淋巴管生成可能成為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移新的治療策略[4]。八寶丹(babao dan，BBD)屬于名貴藥物，由麝香、牛黃、羚羊角、蛇膽、三七和珍珠等中藥組成，具有清熱利濕、活血解毒、祛黃止痛等功效，在惡性腫瘤治療及輔助治療方面有著良好的效果[5]。研究表明，BBD可通過抑制腫瘤細(xì)胞自噬抑制腫瘤細(xì)胞生長[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，BBD可抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)和胃癌細(xì)胞的增殖、遷移，并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[7-10]；還可通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)/血管內(nèi)皮生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)信號(hào)通路抑制胃癌血管生成[11]。然而，BBD能否抑制淋巴管生成尚未可知，故本研究對(duì)此進(jìn)行探索。

1 材料

1.1 細(xì)胞人淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(human lymphatic endothelial cells，HLECs，貨號(hào)：JNO-061)采購于廣州吉妮歐生物技術(shù)有限公司。

1.2 藥物與試劑BBD(廈門中藥廠股份有限公司，批號(hào)：180101)。Hoechst33258染色試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，貨號(hào)：KGA211)；MTT粉末、結(jié)晶紫(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：M8180、C8470)；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM，美國ScienCell公司，貨號(hào)：SC1001)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS，美國Life Technologies公司，貨號(hào)：SH30256.01B)；Transwell遷移小室(美國Corning公司，貨號(hào)：3422)；管腔試劑盒(德國Merck Millipore公司，貨號(hào)：ECM625)；Western封閉液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：P0023B)；VEGFR-3一抗(美國Abcam公司，貨號(hào)：ab27278)；β-actin一抗、VEGF-C一抗、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (H+L)抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG (H+L)抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：66009-1-lg、22601-1-AP、SA00001-1、SA00001-2)；基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase，MMP-2)(D2O4T)兔單克隆抗體、MMP-9(D6O3H)XP?兔單克隆抗體(美國CST公司，貨號(hào)：87809S、13667S)；Western專用一抗二抗稀釋液(武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：14C12B17)。

1.3 儀器Galaxy 17型二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；Infinite M200型多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；IC1000型Countes?全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國Life Technologies公司)；DFC425型熒光顯微鏡、DMIL LED型倒置顯微鏡系統(tǒng)(德國Leica儀器有限公司)；超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 藥物制備使用PBS將BBD配置成濃度為25 g·L-1的溶液，超聲30 min助溶后，采用培養(yǎng)基配成所需要的濃度(0 g·L-1、0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)HLECs采用ECM完全培養(yǎng)基(ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基500 mL、胎牛血清25 mL、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子5 mL和青-鏈霉素雙抗 5 mL)于5%CO2及飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)采用MTT法對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測(cè)分析。取對(duì)數(shù)生長期的HLECs，消化處理后按照1×105·mL-1的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。當(dāng)細(xì)胞匯合度至50%～60%時(shí)，每孔加入含不同濃度BBD(0 g·L-1、0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1)的培養(yǎng)液100 μL，分別培養(yǎng)24 h和 48 h 后，棄掉原培養(yǎng)液，加入0.5 g·L-1MTT溶液，每孔100 μL，4 h后棄掉MTT，每孔加入100 μL DMSO，室溫孵育10 min，充分振蕩混勻，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處的光密度(optical density，OD)值，評(píng)估細(xì)胞增殖。

細(xì)胞增殖(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%

2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察取對(duì)數(shù)生長期的HLECs，消化處理后按照1×105·mL-1的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔接種2 mL。當(dāng)細(xì)胞匯合度至50%～60%時(shí)，使用含不同濃度BBD(0 g·L-1、0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1)的培養(yǎng)基干預(yù)24 h后，棄掉原培養(yǎng)基，每孔加入0.5 mL PBS進(jìn)行清洗，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期的HLECs，消化處理后按照1×105·mL-1的密度接種到12孔板中，每孔接種1 mL。當(dāng)細(xì)胞匯合度至50%～60%時(shí)，使用含不同濃度BBD(0 g·L-1、0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1)的培養(yǎng)基干預(yù)24 h后，棄掉原培養(yǎng)基，每孔加入0.5 mL PBS進(jìn)行清洗，4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞10 min，棄上清液，采用Hoechst33258染液染色10 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況并拍照記錄。

2.6 細(xì)胞劃痕損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期的HLECs，按3×105·mL-1的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔接種2 mL。當(dāng)細(xì)胞匯合度至90%左右時(shí)，用小規(guī)格槍頭垂直于6孔板底，并按照一定力度進(jìn)行水平劃痕，棄掉原培養(yǎng)基并使用PBS清洗3次，拍照記錄后使用含不同濃度的BBD(0 g·L-1、0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1)干預(yù)，于 12 h 后觀察細(xì)胞劃痕損傷修復(fù)情況。

2.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)含不同濃度BBD(0 g·L-1、0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1)的培養(yǎng)基干預(yù)對(duì)數(shù)生長期的HLECs 24 h后，消化并收集細(xì)胞，細(xì)胞重懸混勻后密度調(diào)整為2.5×105·mL-1，取200 μL重懸液加入遷移小室內(nèi)，700 μL ECM完全培養(yǎng)基置于室外，恒溫箱孵育12 h后棄掉培養(yǎng)基，使用4%多聚甲醛固定后采用結(jié)晶紫染色10 min，超純水清洗并晾置干燥，倒置顯微鏡下觀察BBD對(duì)HLECS遷移的影響，并隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照。

2.8 管腔形成實(shí)驗(yàn)于低溫環(huán)境中預(yù)先配置基質(zhì)膠并鋪置于48孔板中，恒溫培養(yǎng)箱孵育1 h。將HLECs按照2×105·mL-1的密度接種于含有基質(zhì)膠的48孔板中，每孔200 μL，3 h后通過倒置顯微鏡觀察HLECs的管腔形成情況。

2.9 Western Blot檢測(cè)淋巴管生成相關(guān)蛋白表達(dá)水平采用Western Blot檢測(cè)HLECs中VEGF-C、VEGFR-3、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平。HLECs以1.0×105·mL-1的密度接種于6孔板，當(dāng)匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，使用含不同濃度BBD(0 g·L-1、0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1)的培養(yǎng)基干預(yù)24 h后收集細(xì)胞，提取總蛋白并進(jìn)行定量定體積。SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為10%，蛋白上樣量為50 μg，轉(zhuǎn)膜。室溫下使用Western封閉液封閉2 h，加一抗[VEGF-C(1:3 000)、VEGFR-3(1:1 000)、MMP-2(1:1 000)、MMP-9(1:1 000)和β-actin(1:5 000)]，4 ℃孵育14 h～18 h。室溫條件下TBST洗滌3次，每次10 min，加二抗(1:5 000)，室溫下孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，使用超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影并分析。

3 結(jié)果

3.1 BBD對(duì)HLECs增殖的影響與0 g·L-1BBD組比較，干預(yù)24 h及48 h后，0.25 g·L-1BBD組、0.5 g·L-1BBD組及0.75 g·L-1BBD組HLECs的增殖能力明顯降低(P<0.01)。見圖1。

注：與0 g·L-1 BBD組比較，**P<0.01

3.2 BBD對(duì)HLECs形態(tài)的影響與0 g·L-1BBD組比較，其余濃度BBD組HLECs出現(xiàn)細(xì)胞密度減少，部分細(xì)胞脫落的現(xiàn)象，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。提示BBD對(duì)HLECs生長有著抑制作用，并呈現(xiàn)劑量依賴性。見圖2。

圖2 BBD對(duì)HLECs形態(tài)的影響(×200)

3.3 BBD對(duì)HLECs凋亡的影響與0 g·L-1BBD組比較，其余濃度BBD組HLECs的細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；與0.25 g·L-1BBD組比較，0.5 g·L-1BBD組和0.75 g·L-1BBD組HLECs的細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；與0.5 g·L-1BBD組比較，0.75 g·L-1BBD組HLECs的細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。提示BBD能夠促進(jìn)HLECs凋亡，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。見圖3。

注：A：細(xì)胞凋亡圖(×200)；B：各組細(xì)胞凋亡率結(jié)果比較；與0 g·L-1 BBD組比較，**P<0.01；與0.25 g·L-1 BBD組比較，##P<0.01；與0.5 g·L-1 BBD組比較，△△P<0.01

3.4 BBD對(duì)HLECs損傷修復(fù)能力的影響與0 g·L-1BBD組比較，經(jīng)其余濃度BBD干預(yù)后，HLECs向劃痕區(qū)域愈合的速度逐漸減緩，細(xì)胞損傷的修復(fù)能力逐漸減弱。提示：BBD可抑制HLECs損傷修復(fù)能力。如圖4。

圖4 BBD對(duì)HLECs損傷修復(fù)能力的影響(×100)

3.5 BBD對(duì)HLECs遷移能力的影響0 g·L-1BBD組細(xì)胞可以成功遷移，證明HLECs自身具有遷移能力。與0 g·L-1BBD組比較，經(jīng)其余濃度BBD干預(yù)后，HLECs的遷移率顯著降低(P<0.01)，且呈現(xiàn)濃度依賴性。提示：BBD具有抑制HLECs遷移的作用。見圖5。

注：A：細(xì)胞遷移圖(×200)；B：細(xì)胞遷移率統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；與0 g·L-1 BBD組比較，**P<0.01；與0.25 g·L-1 BBD組比較，##P<0.01；與0.5 g·L-1 BBD組比較，△△P<0.01

3.6 BBD對(duì)HLECs管腔生成能力的影響0 g·L-1BBD組HLECs有較多的管腔生成，提示HLECs自身具有較好的管腔生成能力。與0 g·L-1BBD組比較，其余濃度BBD干預(yù)后，HLECs管腔生成數(shù)量顯著減少(P<0.05)，且呈劑量依賴性。提示，BBD能夠抑制HLECs的管腔生成。見圖6。

注：A：管腔生成圖(×100)；B：管腔生成率統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；與0 g·L-1 BBD組比較，*P<0.05；與0.25 g·L-1 BBD組比較，#P<0.05；與0.5 g·L-1 BBD組比較，△P<0.05

3.7 BBD對(duì)HLECs中淋巴管生成相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響與0 g·L-1BBD組比較，其余濃度BBD干預(yù)HLECs 24 h后，HLECs中VEGF-C、VEGFR-3、MMP-2與MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。提示，BBD可抑制HLECs中淋巴管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。見圖7。

注：A：HLECs中淋巴管生成相關(guān)蛋白免疫印疫圖；B：各組HLECs中淋巴管生成相關(guān)蛋白結(jié)果比較；與0 g·L-1 BBD組比較，*P<0.05，**P<0.01；與0.25 g·L-1 BBD組比較，#P<0.05，##P<0.01；與0.5 g·L-1 BBD組比較，△△P<0.01

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，淋巴道轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤對(duì)人類生命健康的最大威脅[12-13]，因此，抑制淋巴管生成是目前研究抗腫瘤轉(zhuǎn)移的熱點(diǎn)之一。VEGF由多種組織細(xì)胞分泌，是腫瘤血管生成的重要指標(biāo)，對(duì)腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移有著至關(guān)重要的作用[14]。VEGF-C作為目前發(fā)現(xiàn)的唯一特異性血管生長因子，與其特異性受體VEGFR-3成為目前公認(rèn)的促進(jìn)淋巴管生成關(guān)鍵因子[15]。研究證實(shí)，VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合后，可以促進(jìn)HLECs的增殖、遷移，促進(jìn)淋巴管生成[16-17]。

細(xì)胞外基質(zhì)在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著重要作用，與細(xì)胞外基質(zhì)完整性相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[18-19]。MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)Ⅳ型膠原及基底膜，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤與轉(zhuǎn)移，還能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和新血管生成，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[20-21]。MMP-2與MMP-9能夠共同發(fā)揮降解多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的作用，如IV型膠原、層粘連和纖維連接蛋白[22]。Ⅳ型膠原是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要蛋白，MMP-2、MMP-9是降解Ⅳ型膠原最主要的酶，在血管基底膜降解的早期發(fā)揮重要作用。因此，抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)可有效防止血管基底膜降解，進(jìn)而減少腫瘤血管的生成[23]。研究證明，MMP-2與MMP-9表達(dá)水平的高低與腫瘤轉(zhuǎn)移密切正相關(guān)[18，24-25]，推測(cè)，MMP-2與MMP-9蛋白表達(dá)水平與淋巴管生成及遷移密切相關(guān)。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，中草藥提取物乃至復(fù)方制劑在辨證論治的基礎(chǔ)上，運(yùn)用中醫(yī)理論來指導(dǎo)用藥，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有重要影響[26]。如川芎具有活血化瘀的功效，對(duì)惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有一定的治療效果[27]；解毒消癥飲對(duì)體外血管生成有著一定程度抑制作用[28]；清解扶正顆粒能有效抑制體外淋巴管生成[29]。BBD同樣具有清熱利濕，活血解毒的功效，其是否能夠一定程度上抑制淋巴管生成尚未可知。因此，本研究選擇人淋巴內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，考察BBD在體外抑制淋巴管生成的能力。

MTT及Hoechs33258染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著BBD濃度增加，對(duì)HLECs增殖的抑制作用逐漸增加，促凋亡能力也逐漸增加，說明BBD能夠抑制HLECs增殖，促進(jìn)HLECs凋亡；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BBD能夠抑制HLECs的損傷修復(fù)能力及遷移能力，且呈現(xiàn)明顯劑量依賴性；管腔形成實(shí)驗(yàn)及Westem Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BBD能夠抑制HLECs的管腔生成能力，顯著下調(diào)淋巴管生成相關(guān)蛋白VEGF-C、VEGFR-3、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)水平。

綜上所述，BBD可以促進(jìn)HLECs凋亡，抑制HLECs增殖、遷移及淋巴管的生成，其作用可能與下調(diào)VEGF-C、VEGFR-3、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平有關(guān)。