吳從文，劉曉麗，鐘世坤，馬艷清，裴 帥

(1.中國石油新疆油田分公司陸梁油田作業(yè)區(qū)，新疆 克拉瑪依 834000；2.中國石油新疆油田分公司實驗檢測研究院，新疆 克拉瑪依 834000；3.中國石油集團川慶鉆探工程有限公司國際工程公司，四川 成都 610000)

生物表面活性劑是微生物或植物在一定條件下培養(yǎng)時，在代謝過程中分泌的一種具有一定表界面活性、集親水基和疏水基結(jié)構(gòu)于一分子內(nèi)部的兩親化合物，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性類脂衍生物等[1]。生物表面活性劑無毒，可以生物降解，對環(huán)境影響很小，熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性較好，具有高效的表面活性，是合成表面活性劑的理想替代品，受到研究者的廣泛關(guān)注[2]。生物表面活性劑能增大石油烴類物質(zhì)在水相中的溶解度，降低表面張力，在石油采收和生物修復(fù)環(huán)境污染等方面具有巨大的應(yīng)用潛力[3]。研究和開發(fā)生物表面活性劑的應(yīng)用價值和潛力、優(yōu)化發(fā)酵方法和降低發(fā)酵成本、篩選和培育生物表面活性劑高產(chǎn)菌株是當(dāng)前主要的研究熱點和發(fā)展方向[4]。

生物表面活性劑的合成方法主要有微生物發(fā)酵法、酶合成法、天然生物提取法等[5-6]。其中通過微生物發(fā)酵法可以在不同的條件下得到不同類型的生物表面活性劑，在技術(shù)和經(jīng)濟上非常適合批量生產(chǎn)[7]。微生物在發(fā)酵過程中，使用的菌種一般生長較慢，并且容易出現(xiàn)菌種退化的現(xiàn)象，因此需要通過自然或誘變選育來保持菌種的優(yōu)良性能，防止菌種退化，同時進一步提高菌種的正突變率[8]。常見的誘變方法有紫外誘變、微波誘變、化學(xué)誘變等，由于微生物突變生理生化反應(yīng)復(fù)雜，單一誘變往往難以篩選到優(yōu)良菌株，因此，多采用復(fù)合誘變使菌株發(fā)生較大的突變，進而篩選出優(yōu)良菌株以提高生物表面活性劑的產(chǎn)量[9]。Zouari等[10]從石油污染土壤中篩選出假單胞菌(Pseudomonassp.)，該菌株所產(chǎn)生物表面活性劑在高鹽度(10%)、高pH值(6～12)、高溫(80 ℃)時依然能夠保持較高的活性，同時可以降解柴油。張卉等[11]以NTG為誘變劑對出發(fā)菌株P(guān)seudomonasaeruginosaJZ-5進行誘變處理，以發(fā)酵液排油圈直徑和生物表面活性劑產(chǎn)量為指標(biāo)進行復(fù)篩，選育出高產(chǎn)且遺傳穩(wěn)定的突變菌株NTG-6，其排油圈直徑為6.7 cm，生物表面活性劑產(chǎn)量達到40.83 g·L-1，較出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了50.84%。門欣等[12]篩選到一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌PseudomonasaeruginosaBQ11，在15 W紫外燈下38 cm處誘變60 s后，獲得一株正突變率達28%的生物表面活性劑高產(chǎn)菌株UBQ11-4，糖脂產(chǎn)量從5.3 g·L-1提高到6.8 g·L-1，并且突變菌株UBQ11-4所產(chǎn)生物表面活性劑的特性(乳化性能和臨界膠束濃度)優(yōu)于出發(fā)菌株。陳利娟等[13]對出發(fā)菌株進行常壓室溫等離子體誘變(ARTP)，選育出一株高產(chǎn)突變菌株P(guān)seudomonasaeruginosaSC-11，其鼠李糖脂產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了74.1%。沈薇等[14]采用紫外誘變和紫外+氯化鋰復(fù)合誘變對PseudomonasaeruginosaBS-03菌株進行誘變，篩選出一株生物表面活性劑高產(chǎn)菌株LY4，可將鼠李糖脂產(chǎn)量由4.1 g·L-1提高到6.8 g·L-1。

作者以新疆油田油井采出液中分離得到的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)FC-69為出發(fā)菌株，采用紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變的方法對菌株FC-69進行種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)；以發(fā)酵液的排油圈直徑和生物表面活性劑產(chǎn)量為考核指標(biāo)，進一步篩選生物表面活性劑高產(chǎn)菌株，并對其特性進行研究，為豐富生物表面活性劑高產(chǎn)菌種資源和提高生物表面活性劑產(chǎn)量提供數(shù)據(jù)支持。

1 實驗

1.1 菌種與儀器

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)FC-69，分離自新疆油田油井采出液中，保存于克拉瑪依市新奧達石油技術(shù)服務(wù)有限公司。

紫外燈(30W/5A)，中國四通特種電光源；JA2103N型電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；LDZM-80KCS-Ⅲ型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；HC-1014型高速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；A101型全自動表面張力儀，美國科諾工業(yè)有限公司；BCD-205HK型電冰箱，廣東海信容聲冰箱有限公司；PHS-3C型pH計，上海雷磁儀器廠；SW-CS-2F型凈化工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

平板(斜面)培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖3.0，蛋白胨8.0，酵母膏3.0，磷酸二氫鉀2.7，氯化鈉5.0，瓊脂20.0。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：牛肉膏2.0，氯化鈣0.05，磷酸氫二鉀2.0，葡萄糖10.0，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀2.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖20.0，硝酸銨3.0，磷酸氫二鉀1.5，硫酸鎂0.1，硫酸鐵0.01。

1.3 菌懸液的制備

刮取活化的FC-69菌株，于30 ℃、200 r·min-1搖瓶培養(yǎng)12 h后收集菌液，4 000 r·min-1離心10 min，收集菌體，加入無菌生理鹽水，置于漩渦振蕩器上振蕩20 s使菌體混合均勻，用雙層無菌脫脂棉紗布過濾，即得菌懸液，用生理鹽水稀釋使菌濃為106個·mL-1左右，備用。

1.4 高產(chǎn)菌株的誘變選育

1.4.1 紫外誘變時間的選擇[15]

吸取5 mL菌懸液于無菌玻璃平皿，置于30 W紫外燈下15 cm處照射(紫外燈提前預(yù)熱30 min)；每隔一定時間(15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s、115 s)吸取照射過的菌懸液，稀釋后涂布于平板培養(yǎng)基上，以未經(jīng)紫外燈照射的菌懸液作為對照，用黑紙包裹后置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；觀察平板上的菌落數(shù)，按式(1)計算致死率，確定合適的紫外誘變時間。

(1)

取菌懸液，按上述方法紫外誘變合適時間，分別挑取形態(tài)、大小、色澤優(yōu)良的菌落經(jīng)種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后測定排油圈直徑；挑選排油圈直徑>3 cm的菌落進行液態(tài)發(fā)酵后再次測定排油圈直徑，平行測定3次，取平均值[16]。根據(jù)排油圈直徑增幅計算正突變率：

(2)

1.4.2 亞硝基胍濃度的選擇[17]

將菌懸液按1.4.1方法紫外誘變合適時間，稀釋后涂布于含不同濃度(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%)亞硝基胍的平板培養(yǎng)基上，以未涂布亞硝基胍的培養(yǎng)基作為對照，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；觀察平板上的菌落數(shù)，計算致死率，確定合適的亞硝基胍濃度。

取菌懸液，按上述方法紫外誘變合適時間后涂布在含合適濃度亞硝基胍的平板培養(yǎng)基上，分別挑取形態(tài)、大小、色澤優(yōu)良的菌落經(jīng)種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后測定排油圈直徑。

1.4.3 高產(chǎn)菌株的篩選及遺傳穩(wěn)定性實驗

取菌懸液，在確定的最佳條件下進行紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變，篩選生物表面活性劑高產(chǎn)菌株。將最終篩選的高產(chǎn)菌株進行傳代實驗，檢測生物表面活性劑產(chǎn)量，分析其高產(chǎn)性能的遺傳穩(wěn)定性。

1.5 高產(chǎn)菌株的特性研究

將篩選的高產(chǎn)菌株經(jīng)一級種子培養(yǎng)成熟后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)4 d，每12 h取樣測定菌體密度(OD值)、表面張力、乳化值和生物表面活性劑產(chǎn)量。

采用濁度法測定菌體密度[16]；采用表面張力儀測定發(fā)酵液的表面張力，平行測定3次，取平均值[18]；采用超聲體積比法測定乳化值[19]；生物表面活性劑產(chǎn)量測定方法：將發(fā)酵液pH值調(diào)至8.0，6 000 r·min-1離心20 min，上清液用超濾膜過濾，濾液于40 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至原體積的20%，再將濃縮液pH值調(diào)至2.0，于4 ℃下靜置12 h，于4 ℃、10 000 r·min-1離心20 min，收集沉淀物(生物表面活性劑粗提物)[11]，稱重。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外誘變時間的確定

FC-69菌株在紫外誘變不同時間后，稀釋涂布于平板培養(yǎng)基上，計算致死率，結(jié)果見表1。

表1 FC-69菌株在紫外誘變不同時間后的致死率

由表1可知，隨著紫外誘變時間的延長，菌落數(shù)逐漸減少，F(xiàn)C-69菌株的致死率逐漸升高；0～75 s內(nèi)致死率快速升高，75 s之后致死率升幅趨緩。紫外誘變60 s時，致死率為88.98%；紫外誘變90 s時，僅長出1個菌落，致死率達到99.21%；紫外誘變115 s時，菌株已無法生長。通過前期實驗驗證，致死率一般在80%左右時正突變率較高，因此，選擇紫外誘變時間為60 s。

2.2 紫外誘變排油圈直徑測定結(jié)果

FC-69菌株紫外誘變60 s后，通過培養(yǎng)共篩選出52個形態(tài)、大小、色澤優(yōu)良的菌落，經(jīng)過種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后測定排油圈直徑，結(jié)果見表2。

表2 FC-69菌株紫外誘變后的排油圈直徑測定結(jié)果

由表2可知，F(xiàn)C-69菌株經(jīng)紫外誘變后，排油圈直徑基本呈正態(tài)分布。排油圈直徑在5.0～5.9 cm的菌落最多，有16個，其次是在4.0～4.9 cm的，有12個；排油圈直徑大于3.0 cm的菌落有47個，占菌落總數(shù)的90.38%；排油圈直徑大于7.0 cm的菌落有2個，占菌落總數(shù)的3.85%；排油圈直徑大于出發(fā)菌株FC-69的有9個，占菌落總數(shù)的17.31%，其中最大的達到7.2 cm，較出發(fā)菌株提高了16.13%。

2.3 亞硝基胍濃度的確定

FC-69菌株紫外誘變60 s后，稀釋涂布于含有不同濃度亞硝基胍的平板培養(yǎng)基上，計算致死率，結(jié)果見表3。

表3 FC-69菌株在復(fù)合誘變后的致死率

由表3可知，隨著亞硝基胍濃度的增加，菌落數(shù)逐漸減少，F(xiàn)C-69菌株的致死率逐漸升高；當(dāng)亞硝基胍濃度為0.5%時，僅長出1個菌落；當(dāng)亞硝基胍濃度為0.6%時，菌株已不能生長，這也是菌株對亞硝基胍的耐受臨界濃度。因此，選擇0.4%的亞硝基胍對FC-69菌株進行復(fù)合誘變。

2.4 復(fù)合誘變排油圈直徑測定結(jié)果

FC-69菌株紫外誘變60 s后，稀釋涂布于含有0.4%亞硝基胍的平板培養(yǎng)基上，通過培養(yǎng)共篩選出55個形態(tài)、大小、色澤優(yōu)良的菌落，經(jīng)過種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后測定排油圈直徑，結(jié)果見表4。

表4 FC-69菌株復(fù)合誘變后的排油圈直徑測定結(jié)果

由表4可知，F(xiàn)C-69菌株經(jīng)復(fù)合誘變后，排油圈直徑在5.0～5.9 cm的菌落最多，有14個；排油圈直徑大于7.0 cm的菌落有3個，占菌落總數(shù)的5.45%；排油圈直徑大于出發(fā)菌株FC-69的有10個，占菌落總數(shù)的18.18%，其中最大的達到7.35 cm，較出發(fā)菌株提高了18.55%。

2.5 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性

在紫外誘變時間為60 s、亞硝基胍濃度為0.4%的條件下對FC-69菌株進行復(fù)合誘變，挑選6個排油圈直徑較大的菌落進行重復(fù)驗證實驗，經(jīng)過種子和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后測定排油圈直徑和生物表面活性劑產(chǎn)量，結(jié)果見表5。

表5 高產(chǎn)菌株的篩選

由表5可知，F(xiàn)C-69-52菌株的排油圈直徑達到7.12 cm，生物表面活性劑產(chǎn)量達到42.86 g·L-1，分別較出發(fā)菌株FC-69提高了14.84%和19.06%。

對高產(chǎn)菌株FC-69-52進行遺傳穩(wěn)定性實驗，結(jié)果顯示：該菌株在傳代1～5代后的生物表面活性劑產(chǎn)量分別為：42.31 g·L-1、41.92 g·L-1、42.56 g·L-1、42.19 g·L-1、42.03 g·L-1，變化不大，說明復(fù)合誘變選育的高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性較好。

2.6 高產(chǎn)菌株的特性(圖1)

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液表面張力呈先降低后升高的變化趨勢，菌體密度、乳化值、生物表面活性劑產(chǎn)量則呈先升高后降低的變化趨勢。發(fā)酵0～48 h，較強的疏水性能增加了高產(chǎn)菌株FC-69-52與環(huán)境有機物的接觸機會，菌體密度顯著上升，發(fā)酵液表面張力大幅下降，并產(chǎn)生大量的生物表面活性劑；發(fā)酵48 h，發(fā)酵液表面張力降至最低(27.05 mN·m-1)，生物表面活性劑產(chǎn)量達到最高(42.21 g·L-1)，乳化值也達到最高(65.68%)；發(fā)酵60 h后，高產(chǎn)菌株FC-69-52生長進入衰亡期，菌體密度開始緩慢下降，發(fā)酵液表面張力維持在30.00 mN·m-1左右，乳化值和生物表面活性劑產(chǎn)量緩慢下降，但整體穩(wěn)定性良好，說明菌株FC-69-52所產(chǎn)生物表面活性劑對油水界面的親和力更強，可使乳化相在96 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

圖1 高產(chǎn)菌株FC-69-52的特性

3 結(jié)論

以銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)FC-69為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變，篩選得到了一株生物表面活性劑高產(chǎn)菌株FC-69-52，其排油圈直徑達到7.12 cm、生物表面活性劑產(chǎn)量達到42.86 g·L-1，分別較出發(fā)菌株提高了14.84%和19.06%。該高產(chǎn)菌株發(fā)酵48 h，生物表面活性劑產(chǎn)量達到42.21 g·L-1，乳化值達到65.68%，發(fā)酵液表面張力降至27.05 mN·m-1，對油水界面的親和力更強，可使乳化相在96 h內(nèi)保持穩(wěn)定，可作為優(yōu)良高產(chǎn)菌株保存使用。該研究為微生物發(fā)酵法產(chǎn)生物表面活性劑的工業(yè)化提供了優(yōu)質(zhì)菌種資源和發(fā)酵工藝指導(dǎo)。