高 原，王 琢，孫詩雨，王金鶴，王 鑫

(哈爾濱商業(yè)大學藥學院 細胞與分子生物學研究所，黑龍江 哈爾濱 150076)

降香檀(DalbergiaodoriferaT.Chen)為豆科黃檀屬喬木，主要生長在海南、廣東等地。降香檀可供藥用，其干燥芯材稱為降香。降香具備散瘀、理氣、活血止血、定痛等功效，也可以減緩由于氣滯血瘀造成的跌打傷痛、胸脅疼痛和脘腹脹痛，還具有醫(yī)治脾胃不和、腹痛嘔吐等功效[1-2]。降香屬于國家二級保護植物，其分布受到地域和生長環(huán)境的限制，生長慢，資源日益短缺。

從植物的內(nèi)生真菌中可獲得很多次生代謝產(chǎn)物，在植物提取、次生代謝產(chǎn)物研發(fā)方面具有較大的開發(fā)應用價值[3-5]；而產(chǎn)纖維素酶內(nèi)生真菌在降香及其它中藥材活性成分的提取方面具有應用價值。鑒于此，作者從降香中分離純化獲得一株產(chǎn)纖維素酶內(nèi)生真菌，測定其產(chǎn)酶活性，并對其進行分子生物學鑒定。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮降香樹枝，采于廣州市老果農(nóng)實驗基地，經(jīng)鑒定為蝶形花科、黃檀屬降香(DalbergiaodoriferaT.Chen)；營養(yǎng)肉湯、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)，北京奧博星生物科技有限責任公司。

PCR試劑盒，天根生物；DNA提取試劑盒，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；其它試劑均為分析純。

電熱鼓風干燥箱、恒溫培養(yǎng)振蕩器、高速臺式離心機、BP-9082型精密恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；金屬浴，杭州博日科技有限公司；PCR儀，Eppendorf；凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；SX-700型高壓滅菌鍋，TOMY；BSA6202S-CW型電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；pH計，Satorius。

1.2 方法

1.2.1 降香內(nèi)生真菌的分離純化

通過植物組織表面消毒法從降香樹皮中分離獲得降香內(nèi)生真菌。

采用尖端菌絲挑取法，將降香內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)皿上，置于28 ℃恒溫生化箱中培養(yǎng)7 d后反復純化3次。

1.2.2 產(chǎn)纖維素酶降香內(nèi)生真菌的篩選

待菌落長出后，通過滅菌槍頭挑取直徑約0.5 cm菌餅，接種于纖維素剛果紅培養(yǎng)皿上，做3個平行實驗，置于28 ℃恒溫生化箱中培養(yǎng)3～4 d，觀察菌落形態(tài)，測量透明圈的直徑，篩選產(chǎn)纖維素酶降香內(nèi)生真菌。

1.2.3 產(chǎn)纖維素酶降香內(nèi)生真菌的產(chǎn)酶活性檢測

1.2.3.1 粗酶液的制備

呂布有野心，他殺董卓，也是想單干。故而，投奔袁術、袁紹，這兩家世伐大族，皆不能容他，袁紹還想偷襲殺了他。當時群雄并起，他即與張邈、陳宮等合伙，豎立自己旗幟，想要分天下一杯羹。他去奪兗州，曹操說，這是我的地盤，你干嘛來奪，呂布說：“漢家城池，諸人有份，偏爾合得?！边@可是說了大實話。當時眾雄，豈非都在瓜分漢家天下？

挑取高產(chǎn)纖維素酶的降香內(nèi)生真菌菌絲，轉接至200 mL PDB液體培養(yǎng)基中，調(diào)整搖床溫度為30 ℃，培養(yǎng)7～10 d，無菌紗布過濾獲得培養(yǎng)液，乙酸乙酯萃取3次，合并萃取物，旋轉蒸發(fā)至浸膏，備用。

1.2.3.2 葡萄糖標準曲線的繪制

葡萄糖標準溶液：稱取100 mg葡萄糖(85 ℃烘干至恒重)于容量瓶中，加入蒸餾水待完全溶解后定容至100 mL，置于4 ℃冰箱中貯存。

3,5-二硝基水楊酸(DNS)顯色劑：稱取185 g酒石酸鉀鈉于裝有500 mL熱水的容量瓶中，待溶解完全后依次加入6.3 g DNS、262 mL 2 mol·L-1NaOH溶液、5 g苯酚、5 g亞硫酸鈉，完全溶解并恢復至室溫后，用蒸餾水定容至1 000 mL，貯存于棕色瓶中[6]。

葡萄糖標準曲線的繪制：配制濃度(mg·mL-1)分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6的葡萄糖標準溶液，吸取1 mL于試管中，加入1.5 mL DNS顯色劑，搖勻；沸水浴精準加熱5 min后立刻取出，降至室溫后，用蒸餾水定容至20 mL，測定540 nm處吸光度。以葡萄糖標準溶液濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線[7]。

1.2.3.3 酶活力的測定

酶活力定義：底物為羧甲基纖維素鈉，pH值為6，反應條件為50 ℃水浴恒溫加熱30 min，定義每30 min催化羧甲基纖維素鈉生成1 μg葡萄糖所需的纖維素酶量為一個酶活力單位，用IU·mL-1表示[12]。

羧甲基纖維素酶活力(X，IU·mL-1)按下式計算：

式中：m為依據(jù)標準曲線方程計算的葡萄糖含量，mg；n為酶液稀釋倍數(shù)；V為酶液體積，mL；t為培養(yǎng)時間，min；5.56為1 mg葡萄糖的μmol數(shù)，1000/180=5.56。

1.2.4 產(chǎn)纖維素酶降香內(nèi)生真菌的分子生物學鑒定

采用CTAB法提取降香內(nèi)生真菌DNA，對降香內(nèi)生真菌JXP2-2目的基因 ITS rDNA片段擴增并測序。上游引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)，下游引物為ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測JXP2-2目的片段的PCR擴增產(chǎn)物；委托生工生物工程(上海)股份有限公司測定PCR擴增產(chǎn)物序列；利用Mega 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對降香內(nèi)生真菌JXP2-2進行分類鑒定，參數(shù)設置：鄰接樹方法(neighbor-joining)，最大概似法(maximum composite likelihood)模型，自展值為1 000。

2 結果與討論

2.1 分離純化

從保存完好的降香內(nèi)生真菌培養(yǎng)皿中挑取5株具有不同形態(tài)、大小、顏色的菌落進行純化。利用纖維素剛果紅培養(yǎng)皿完成初篩，獲得一株產(chǎn)纖維素酶效果較好的降香內(nèi)生真菌JXP2-2，其菌落形態(tài)如圖1所示。

圖1 菌株JXP2-2的菌落形態(tài)

菌株JXP2-2經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的透明圈直徑為2.20 cm，透明圈直徑與其菌落直徑的比值(D/d)為2.75。

2.2 產(chǎn)酶活性

按1.2.3.2方法繪制葡萄糖標準曲線，得到線性回歸方程：y=0.1314x+0.0051，R2=0.9993。取粗酶液，稀釋100倍，按1.2.3.3方法測定纖維素酶活力，結果如圖2所示。

從圖2可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株JXP2-2粗酶液的酶活力逐漸升高，4.5 d時達到最高，為84.50 IU·mL-1；繼續(xù)延長培養(yǎng)時間，酶活力反而下降，第4.5 d～第5.5 d，酶活力下降顯著，從84.50 IU·mL-1降至73.32 IU·mL-1，第5.5 d～第6.5 d，酶活力降幅趨緩，從73.32 IU·mL-1降至71.06 IU·mL-1，第6.5 d～第7.5 d，酶活力基本穩(wěn)定。隨著培養(yǎng)時間的延長，對照組的酶活力也逐漸升高，4.5 d時達到最高，為80.65 IU·mL-1；繼續(xù)延長培養(yǎng)時間，酶活力基本呈直線下降。

圖2 菌株JXP2-2粗酶液酶活力變化曲線

2.3 分子生物學鑒定

2.3.1 JXP2-2 ITS序列PCR擴增

采用CTAB法提取產(chǎn)纖維素酶降香內(nèi)生真菌JXP2-2的基因組DNA，使用ITS1、ITS4引物對內(nèi)生真菌JXP2-2 ITS序列進行PCR擴增，以基因組DNA為模板擴增獲得ITS產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，共536個堿基。

2.3.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構建

在GenBank數(shù)據(jù)庫中，對PCR擴增得到的菌株JXP2-2的ITS-DNA基因序列進行BLAST比對[13]，發(fā)現(xiàn)該序列與尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)KX347475的相似度高達99%，并利用Mega 5.0軟件進行分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。

圖3 基于ITS基因構建的菌株JXP2-2系統(tǒng)發(fā)育樹

從圖3可以看出，菌株JXP2-2與尖孢炭疽菌聚為一枝，表現(xiàn)出較近的親緣關系。菌株JXP2-2與尖孢炭疽菌遺傳距離最近，堿基相似度為99%，但是從系統(tǒng)發(fā)育的角度來講親緣關系程度達到95%，初步鑒定菌株JXP2-2為尖孢炭疽菌。

3 結論

采用植物組織表面消毒法分離獲得降香內(nèi)生真菌，使用纖維素剛果紅培養(yǎng)皿篩選獲得一株產(chǎn)纖維素酶的降香內(nèi)生真菌。初步鑒定該菌株屬尖孢炭疽菌，具有較高的產(chǎn)纖維素酶活性。該研究在節(jié)約降香資源、保護植物生長環(huán)境、輔助提取中藥活性成分等方面具有重要意義，為構建高產(chǎn)纖維素酶工程菌提供了參考。