覃祥龍 呂婷婷 韋媛菊 柳華英 龐翠英 江 穎 馮 原

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)1 瑞康臨床醫(yī)學(xué)院，2 研究生學(xué)院，3 第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧市 530001，電子郵箱:1357957218@qq.com；廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院4 神經(jīng)內(nèi)科，5 呼吸內(nèi)科，南寧市 530001)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是起源于支氣管黏膜、腺體和肺泡上皮的一類惡性腫瘤，分為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺鱗癌等。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中用于治療NSCLC的方法比較局限，且伴有較大的副作用，而中醫(yī)藥治療NSCLC具有獨(dú)特的優(yōu)勢，副作用較西藥治療小。加減補(bǔ)肺化瘀湯由黨參、黃芪等14味中藥組成，具有補(bǔ)氣活血化瘀的功效，主要用于氣虛血瘀型NSCLC的治療[1]。有研究顯示，補(bǔ)肺化瘀湯輔助吉非替尼治療晚期NSCLC，能改善患者免疫系統(tǒng)的功能，降低血清腫瘤標(biāo)志物水平，臨床療效滿意，藥物安全性高[2-3]；補(bǔ)肺化瘀湯結(jié)合順鉑+吉西他濱化療方案治療NSCLC的療效較好，能有效地改善患者的免疫指標(biāo)和高凝狀態(tài)，穩(wěn)定目標(biāo)病灶，并減少化療藥物的毒副作用[4-5]。上述研究結(jié)果均提示補(bǔ)肺化瘀湯對NSCLC有一定的治療效果，但是目前尚無加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC的作用機(jī)制的相關(guān)研究。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從分子水平上闡述加減補(bǔ)肺化瘀湯成分與靶點(diǎn)之間、靶點(diǎn)與NSCLC之間的潛在聯(lián)系，分析藥物成分、靶點(diǎn)、蛋白質(zhì)和疾病之間的相互作用關(guān)系，從而探討加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC的作用機(jī)制，為明確加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC的相關(guān)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 加減補(bǔ)肺化瘀湯有效活性成分及其作用靶點(diǎn)的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；http://tcmspw.com/)搜索并篩選加減補(bǔ)肺化瘀湯中所含中藥(黨參、黃芪、生地黃、紫菀、川芎、赤芍、丹參、前胡、杏仁、莪術(shù)、三棱、半枝蓮、白花蛇舌草、甘草)的活性成分，采用胃腸吸收、分布、代謝和排泄效應(yīng)模型，并以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18等為限定條件篩選出符合研究標(biāo)準(zhǔn)的有效活性成分。利用TCMSP篩選出加減補(bǔ)肺化瘀湯有效活性成分的作用靶點(diǎn)，使用自學(xué)的編程腳本perl將基因名轉(zhuǎn)換為uniProt ID。

1.2 NSCLC相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)檢索關(guān)鍵詞“non-small cell lung cancer”，以“Relevance score>2”為篩選條件篩選數(shù)據(jù)庫中NSCLC的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC相關(guān)靶點(diǎn)的選取 通過Venny平臺(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，將加減補(bǔ)肺化瘀湯有效活性成分的作用靶點(diǎn)與NSCLC相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行合并取交集，所獲得的共同靶點(diǎn)即認(rèn)為是加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并篩選核心靶點(diǎn) 將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING網(wǎng)站(https://string-db.org/)，選擇“Multiple Protein”，限定物種為“Homo sapiens”，設(shè)定最低要求互動(dòng)分?jǐn)?shù)為中度可信度0.400，導(dǎo)出相關(guān)的TSV表格，得到蛋白-蛋白互相作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)文件。將導(dǎo)出的PPI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)文件中的 Node1、Node2、Combined score值導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，從而可視化PPI網(wǎng)絡(luò)，并利用其自帶工具NetworkAnalyzer計(jì)算Degree值，選取“Degree>90”的靶點(diǎn)，即為核心靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建“有效活性成分-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 將得到的核心靶點(diǎn)及與其對應(yīng)的有效活性成分導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，構(gòu)建“有效活性成分-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 核心靶點(diǎn)的通路富集分析 將1.4步驟選取出的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING網(wǎng)站，按照上述步驟獲得核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。同時(shí)，將核心靶點(diǎn)上傳到Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/)，然后進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。設(shè)定基本參數(shù)，物種為“Homo sapiens”，采用“ORA”算法，進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。進(jìn)階參數(shù)設(shè)定中，設(shè)定“Significance Level”為P<0.05，余為默認(rèn)設(shè)置。

2 結(jié) 果

2.1 加減補(bǔ)肺化瘀湯的有效活性成分及其作用靶點(diǎn) 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，共收集到加減補(bǔ)肺化瘀湯有效活性成分342個(gè)和靶點(diǎn)4 084個(gè)，去重后得到234個(gè)有效活性成分和254個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 NSCLC的相關(guān)靶點(diǎn) 共搜索到NSCLC相關(guān)靶點(diǎn)4 908個(gè)，以“Relevance score>2”為條件進(jìn)行篩選得到相關(guān)靶點(diǎn)4 789個(gè)。

2.3 加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC的相關(guān)靶點(diǎn) 將加減補(bǔ)肺化瘀湯有效活性成分的作用靶點(diǎn)與NSCLC的相關(guān)靶點(diǎn)取交集后獲得191個(gè)共同靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 韋恩圖

2.4 加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC的核心靶點(diǎn) 共獲得14個(gè)加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC的核心靶點(diǎn)，按照對應(yīng)的“Degree值”由大到小排序，依次為蛋白激酶B1(protein kinase B1,AKT1)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6,IL-6)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)3、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、JUN、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，CASP3)、MYC、MAPK1、MAPK8、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)，見表1。

表1 加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC的核心靶點(diǎn)

2.5 “有效活性成分-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 使用Cytoscape 3.6.0繪制中藥“有效活性成分-核心靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示共有198個(gè)節(jié)點(diǎn)和475條邊(見圖2)。

圖2 有效活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖與GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 將14個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING網(wǎng)站，制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)。GO功能富集分析結(jié)果顯示，核心靶點(diǎn)富集到16個(gè)生物學(xué)過程、6種分子功能、3種細(xì)胞成分。其中生物學(xué)過程主要包括細(xì)胞對鎘離子的反應(yīng)、DNA代謝過程的正調(diào)控、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)等；分子功能主要包括一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性、MAP激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等；細(xì)胞成分主要涉及膜筏、囊泡腔、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物，見圖4。KEGG通路富集分析共獲得9條相關(guān)通路，其中癌癥相關(guān)通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號通路、結(jié)直腸癌信號通路等與NSCLC關(guān)系最為密切(見圖5)，而癌癥相關(guān)通路為富集程度較高的信號通路(見圖6)。

圖3 核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 GO功能富集分析結(jié)果柱狀圖

圖5 KEGG通路富集分析結(jié)果柱狀圖

圖6 癌癥相關(guān)通路

3 討 論

在中醫(yī)中，NSCLC有氣陰兩虛證、陰虛內(nèi)熱證、脾虛痰濕證、氣血瘀滯證等證型。肺癌早期，邪氣盛且正氣尚足，故病機(jī)以邪實(shí)為主；肺癌中晚期，機(jī)體正氣虛弱，外邪易入里化熱，同時(shí)，肺病及脾，脾虛失運(yùn)，痰濕內(nèi)生，阻礙氣機(jī)，可致氣滯、痰濕、血瘀相互膠結(jié)，瘀而化熱，進(jìn)而耗傷氣陰[6]。

加減補(bǔ)肺化瘀湯由黨參、黃芪、生地黃、紫菀、川芎、赤芍、丹參、前胡、杏仁、莪術(shù)、三棱、半枝蓮、白花蛇舌草、甘草14味中藥組成，方中黨參補(bǔ)脾益肺，黃芪益氣健脾，生地黃具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津、活血化瘀之功效[7]，紫菀具有潤肺下氣、化痰止咳之功效[8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黨參和黃芪均有清除氧自由基、抗氧化、保肝、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等功效[9-10]。有研究顯示，采用加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC的效果確切，可有效地改善患者機(jī)體的凝血功能和免疫功能[11-12]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探討加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC的機(jī)制，共獲得加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC的核心靶點(diǎn)14個(gè)，包括AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA、EGFR、JUN、CASP3、MYC、MAPK1、MAPK8、EGF、STAT3、PTGS2、ESR1。大部分靶點(diǎn)與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展具有一定的關(guān)系。(1)AKT1作為蛋白激酶，與細(xì)胞的增殖、生長、凋亡密切相關(guān)[13-14]，同時(shí)還可促進(jìn)受體細(xì)胞的自噬激活[15]；研究表明，AKT1直接參與微小RNA-99a介導(dǎo)的腫瘤抑制過程[16]，參與微小RNA-5481誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲的抑制過程[17]。(2)IL-6是經(jīng)典的炎癥指標(biāo)，可用于預(yù)測NSCLC患者的療效[18]。(3)MAPK3/1信號通路在調(diào)控NSCLC細(xì)胞間充質(zhì)特性方面起著關(guān)鍵作用，阻斷該信號通路可以提高EGFR抑制劑對NSCLC細(xì)胞的干預(yù)效果[19]；此外，抑制MAPK1的表達(dá)可降低NSCLC細(xì)胞對吉非替尼的耐藥性，并阻止細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[20-21]。(4)有學(xué)者指出，肺腺癌中VEGFA與程序性細(xì)胞死亡蛋白1的蛋白和mRNA表達(dá)密切相關(guān)[22]，且與腫瘤細(xì)胞的侵襲和潛在轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)聯(lián)[23-24]。(5)攜帶常見的EGFR基因突變可能與NSCLC患者預(yù)后不良相關(guān)[25]，而抑制EGFR可以顯著降低凋亡前細(xì)胞表面CD47的表達(dá)，有利于樹突狀細(xì)胞有效地吞噬癌細(xì)胞[26]，因此EGFR的酪氨酸激酶抑制劑在NSCLC的治療中發(fā)揮著重要的作用[27]。(6)MAPK通路組分當(dāng)中的c-Jun N端激酶與促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖和NSCLC進(jìn)展有關(guān)[28]，而生物活性成分重樓皂苷Ⅰ通過調(diào)控c-Jun的表達(dá)可以抑制NSCLC細(xì)胞的生長[29]。(7)上調(diào)CASP3的表達(dá)可以抑制NSCLC細(xì)胞株A549的活力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[1,30-33]。(8)研究表明，蛋白激酶C-iota 可通過上調(diào)c-MYC/葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1信號通路而參與NSCLC細(xì)胞中糖代謝的葡萄糖積累和糖酵解過程[34]，并阻斷c-MYC介導(dǎo)的自噬功能及BIN1與c-MYC之間的相互作用，從而促進(jìn)NSCLC的發(fā)展[35-36]；此外，直接下調(diào)c-MYC的表達(dá)，會使NSCLC細(xì)胞增殖[37]。(9)EGF激活的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白和缺氧誘導(dǎo)的毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變可抑制毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白的表達(dá)，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)肺腺癌細(xì)胞中核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α2的表達(dá)，具有潛在的抑癌作用[38]；此外，降低EGF誘導(dǎo)的AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可抑制肺鱗腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[39]。(10)STAT3信號通路也與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，泛素特異性肽酶28可通過誘導(dǎo)STAT3信號通路促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的生長[40]，而下調(diào)STAT3可增加癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感性[41-43]。(11)研究表明，抑制PTGS2可顯著地逆轉(zhuǎn)耐藥NSCLC體外和體內(nèi)的化療耐藥，故PTGS2可作為一種輔助治療靶點(diǎn)，提高NSCLC患者對治療藥物的應(yīng)答率[44]。由此推測，補(bǔ)肺化瘀湯的有效活性成分通過作用于上述多個(gè)靶點(diǎn)，從而發(fā)揮治療NSCLC的作用。已有研究表明，補(bǔ)肺化瘀湯聯(lián)合化療治療NSCLC可以有效地降低患者的VEGF水平,改善免疫功能,減輕毒副作用[45]；補(bǔ)肺化瘀湯聯(lián)合吉非替尼治療晚期EGFR突變型NSCLC可提高療效,降低患者的轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率[46]。

GO功能富集分析結(jié)果顯示，加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC的過程與細(xì)胞對鎘離子的反應(yīng)、DNA代謝過程的正調(diào)控、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程相關(guān)。KEGG信號通路富集分析結(jié)果提示，加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC的核心靶點(diǎn)主要涉及癌基因相關(guān)信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號通路、結(jié)直腸癌信號通路、癌癥中的蛋白多糖信號通路等。其中癌癥相關(guān)通路為富集程度較高的信號通路，其包含了MAPK、磷酸酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)等信號通路。Chen等[47]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，通過靶向神經(jīng)纖維蛋白1以激活ERK信號傳導(dǎo)，可顯著地增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞對埃羅替尼的耐藥性；Hou等[48]的體內(nèi)外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)PI3K信號通路可抑制肺腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的生長；Lu等[49]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，阻斷MAPK/C-Jun N末端激酶通路可以抑制NSCLC細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制腫瘤的生長,起到抑癌作用。結(jié)合所獲得的核心靶點(diǎn)和KEGG信號通路，我們推測加減補(bǔ)肺化瘀湯中的多個(gè)活性成分可能通過AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA等靶點(diǎn)調(diào)控PI3K/ERK、MAPK等多種信號通路達(dá)到治療NSCLC的作用。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)加減補(bǔ)肺化瘀湯治療NSCLC的作用機(jī)制可能與AKT1、CASP3、VEGF、ERK等靶點(diǎn)有關(guān)。加減補(bǔ)肺化瘀湯中的多個(gè)活性成分可能通過以下途徑發(fā)揮治療NSCLC的作用：調(diào)節(jié)AKT1以調(diào)控肺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，降低VEGF水平以減少癌細(xì)胞的侵襲和潛在轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)ERK以提高EGFR抑制劑的治療反應(yīng)等過程，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞有效地吞噬癌細(xì)胞，降低EGF誘導(dǎo)的AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增加CASP3、c-MYC基因的表達(dá)以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移，下調(diào)STAT3以增加癌細(xì)胞對治療藥物的敏感性等。