黃玉文 秦 煜 李書振

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，南寧市 530000，電子郵箱：361216794@qq.com；2 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院骨科，南寧市 530021)

【提要】 細(xì)胞療法治療骨性關(guān)節(jié)炎療效確切且安全性較高，其中間充質(zhì)干細(xì)胞作為多能基質(zhì)細(xì)胞，可以從骨組織、脂肪組織、滑膜組織等多種自體和同種異體組織中分離和分化，具有減輕炎癥并促進(jìn)血管生成的作用，目前已逐漸成為治療骨性關(guān)節(jié)炎的一種替代細(xì)胞療法。本文就間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源、給藥途徑、最佳劑量、注射頻率對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎患者的療效做一綜述。

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性、退行性、全關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未徹底闡明，其特征是關(guān)節(jié)軟骨逐漸喪失，軟骨下骨和周圍軟組織受損[1]。最近的一項(xiàng)流行病學(xué)研究表明，美國(guó)有3 080萬(wàn)人并且全世界有3億人患有OA[2]。傳統(tǒng)的藥物如對(duì)乙酰氨基酚、非甾體抗炎藥、阿片類藥物、皮質(zhì)類固醇、透明質(zhì)酸、富含血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)等適用于早中期OA患者的治療，膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)(total knee arthroplasty，TKA)則常用于晚期OA患者的治療，但是目前這些治療方法均只能控制癥狀，而不能有效地修復(fù)受損的軟骨[3]。

國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)將人間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)定義為塑料貼壁細(xì)胞，表達(dá)CD73、CD90和CD105細(xì)胞標(biāo)志物，而不表達(dá)CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45和人白細(xì)胞抗原-DR(human leukocyte antigen-DR，HLA-DR)等造血標(biāo)志物，并能分化為成骨細(xì)胞、軟骨母細(xì)胞和脂肪細(xì)胞[4]。此外，MSC具有固有免疫調(diào)節(jié)特性，可以減輕炎癥反應(yīng)，支持局部干細(xì)胞和祖細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，從而促進(jìn)血管生成、促進(jìn)細(xì)胞存活和分化，防止局部細(xì)胞及組織纖維化[5]。MSC是目前再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最有臨床應(yīng)用前景的種子細(xì)胞，其是一種多能基質(zhì)細(xì)胞，可以從骨組織、脂肪組織、滑膜組織和圍產(chǎn)期組織等多種自體和同種異體組織中分離和分化，已逐漸成為治療OA的一種替代細(xì)胞療法[6]。本文就MSC的來(lái)源、給藥途徑、最佳劑量、注射頻率對(duì)OA患者的療效進(jìn)行綜述。

1 MSC的常見(jiàn)來(lái)源

1.1 骨髓來(lái)源的MSC 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell,BM-MSC)是最早被人類發(fā)現(xiàn)的MSC，具有固有的軟骨分化潛能[7]。BM-MSC通常取自髂后上棘里的骨髓濃縮物，骨髓濃縮物還含有造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞以及相關(guān)的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子[8]。Mianehsaz等[9]總結(jié)了各種外泌體在OA中的致病作用，提出BM-MSC的外泌體可作為一種無(wú)細(xì)胞治療OA和關(guān)節(jié)損傷的新方法。Liu等[10]通過(guò)定量研究軟骨細(xì)胞增殖、遷移、軟骨基質(zhì)形成和軟骨細(xì)胞基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Kartogenin(BM-MSC的一種小分子化合物)的外泌體比BM-MSC的外泌體在促進(jìn)軟骨修復(fù)方面表現(xiàn)更加優(yōu)異。最近，關(guān)于細(xì)胞再生過(guò)程是通過(guò)移植的MSC自身分化，或是通過(guò)其在宿主細(xì)胞上的內(nèi)分泌及旁分泌作用，或者兩者兼而有之而引起爭(zhēng)論[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，外源性BM-MSC可在損傷的軟骨細(xì)胞中分泌可溶性生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，這些因子對(duì)OA及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者自身形成新組織的干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和營(yíng)養(yǎng)(再生)作用[12]。然而，基于BM-MSC的臨床試驗(yàn)中，骨髓中分離的MSC數(shù)量非常少，只有0.001%～0.01%[13]。此外，BM-MSC的再生能力還與供體的健康狀況和年齡有關(guān)，供體年齡越大，BM-MSC在體外的增殖和分化潛能越弱，并且在某些情況下還會(huì)出現(xiàn)促進(jìn)炎癥進(jìn)展的情況[14]。因此，雖然BM-MSC在軟骨修復(fù)方面的研究已取得較大進(jìn)展,但仍存在以上各種問(wèn)題,還需要更多的臨床試驗(yàn)研究來(lái)確定其最佳效果。

1.2 脂肪來(lái)源的MSC 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cell，AD-MSC)是一類來(lái)源于脂肪組織的MSC，與BM-MSC相比，AD-MSC的優(yōu)勢(shì)在于其提取分離得到的MSC的比例更高(約5.0%)，并且具有侵入性較小、患者依從性較高、成本較低等優(yōu)點(diǎn)[15]。AD-MSC對(duì)OA軟骨細(xì)胞具有旁分泌作用，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的產(chǎn)生，通過(guò)降低炎癥標(biāo)志物表達(dá)水平，改善患者臨床癥狀，同時(shí)，可在一定程度上促進(jìn)軟骨的再生[16]；此外，AD-MSC與BM-MSC相比具有更高的增殖分化潛力[17]。但是，AD-MSC的增殖分化潛力在很大程度上取決于產(chǎn)生脂肪組織的部位。Tang等[18]分別對(duì)小鼠和人的皮下和內(nèi)臟脂肪組織進(jìn)行AD-MSC的分離,并分析皮下或內(nèi)臟脂肪組織的AD-MSC是否對(duì)OA具有同樣的改善作用，結(jié)果表明內(nèi)臟脂肪組織來(lái)源的AD-MSC增殖能力明顯高于皮下脂肪組織來(lái)源的AD-MSC，但皮下脂肪組織來(lái)源的AD-MSC在體外具有更好的軟骨分化潛能和免疫抑制作用。臨床上在TKA術(shù)后通常切除髕上脂肪墊(suprapatellar fat pad，SPFP)和髕下脂肪墊(infrapatellar fat pad，IPFP)分離自體AD-MSC。Muoz-Criado等[19]將TKA術(shù)后患者的SPFP和IPFP經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)分化后的AD-MSC分別移植到嚴(yán)重OA的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)SPFP來(lái)源的AD-MSC表現(xiàn)出更高的成骨和軟骨形成率，可顯著減輕OA模型小鼠的膝關(guān)節(jié)炎癥和軟骨退變程度，增加了糖胺聚糖的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)了內(nèi)源性軟骨的生成。因此，AD-MSC的使用可能有利于OA的治療，但未來(lái)仍需要大量的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證明其有效性。

1.3 滑膜來(lái)源的MSC 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(synovial mesenchymal stem cell，SMSC)來(lái)源于關(guān)節(jié)腔內(nèi)的滑膜組織。研究表明，SMSC可以從髖關(guān)節(jié)中分離，而從膝關(guān)節(jié)分離出來(lái)的SMSC顯示出更好的軟骨形成潛力[20]。SMSC可以保存在4℃或13℃的人血清中，而不會(huì)顯著影響其生存能力和軟骨形成潛力[21]。從OA患者中分離出的SMSC被證明是一種有效的替代細(xì)胞來(lái)源，可用于基于組織工程構(gòu)建的軟骨缺損治療[22]。研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自SMSC-140s的外泌體可促進(jìn)軟骨形成，而不影響細(xì)胞外基質(zhì)的分泌[23]。You等[24]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA母系印記基因3通過(guò)組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的組蛋白3上的第27位賴氨酸的三甲基化抑制Tribbles同源蛋白2表達(dá)來(lái)調(diào)控SMSC向軟骨分化。此外，有研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素1β預(yù)處理SMSC可增強(qiáng)其軟骨形成潛力[25]。在半月板撕裂模型豬實(shí)驗(yàn)中，SMSC已被證明能夠增強(qiáng)無(wú)血管區(qū)縱向撕裂半月板的修復(fù)能力[26]。Hatsushika等[27]的研究也證明了在切除內(nèi)側(cè)半月板的豬膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射SMSC能夠使其關(guān)節(jié)軟骨再生。因此，體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)SMSC具有較強(qiáng)大的軟骨再生能力，然而其具體療效還需要更多的人體試驗(yàn)加以證實(shí)。

1.4 圍產(chǎn)期來(lái)源的MSC 圍產(chǎn)期組織主要包括臍帶血、臍帶、胎盤等，這些組織在分娩后通常作為生物廢物被丟棄，不存在倫理和道德問(wèn)題，這使得它們成為MSC更理想的來(lái)源[28]。臍帶血由造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和MSC組成。與骨髓相似，臍帶血中MSC的數(shù)量極低，很難從臍帶血中分離出MSC[29]。研究發(fā)現(xiàn)，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell，UCB-MSC)的增殖潛力與胎齡有關(guān)， UCB-MSC在胎兒足月時(shí)的生長(zhǎng)速度明顯降低[30]。但是最近的一項(xiàng)研究表明，UCB-MSC比成人來(lái)源的MSC具有更強(qiáng)的軟骨分化和成骨分化潛能[31]。除了臍帶血,臍帶也被廣泛用于MSC的分離。整個(gè)臍帶分為三段，每段長(zhǎng)3 cm，分別為母體段、中間段和胎兒段，而人臍帶母體段來(lái)源的MSC是同種異體骨再生的理想細(xì)胞[32]。研究發(fā)現(xiàn)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cell，UC-MSC)與BM-MSC比較其增殖率顯示出更快的倍增時(shí)間和更強(qiáng)的傳代能力[33]。在成骨分化方面，UC-MSC顯示出更強(qiáng)的分化潛能，與BM-MSC相比，UC-MSC所表達(dá)的成骨基因1型膠原是其兩倍；此外，UC-MSC所表達(dá)的軟骨性基因Y-box 9和成骨基因2型膠原是BM-MSC的50倍[34]。然而，許多因素如妊娠年齡、分娩途徑、產(chǎn)婦年齡、妊娠糖尿病和子癇前期等都會(huì)影響圍產(chǎn)期來(lái)源的MSC的增殖和分化潛能[35]。圍產(chǎn)期來(lái)源的MSC作為一種新的替代細(xì)胞來(lái)源，在軟骨分化及基因治療中有著廣闊的應(yīng)用前景。

2 MSC治療OA的給藥途徑

目前大多數(shù)動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中，MSC的給藥途徑都是關(guān)節(jié)腔內(nèi)直接注射，而沒(méi)有使用任何支架載體。關(guān)節(jié)腔內(nèi)直接注射的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行，同時(shí)可以避免在TKA手術(shù)過(guò)程中可能產(chǎn)生的副作用[36]。然而Kim等[37]的薈萃分析提示，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSC可能不再是促進(jìn)OA軟骨再生的唯一理想途徑，因?yàn)橹挥猩儆?%的被移植細(xì)胞在注射后幾天內(nèi)留在應(yīng)用部位。Munar等[38]對(duì)50例通過(guò)關(guān)節(jié)腔注射自體MSC的OA患者進(jìn)行評(píng)估,發(fā)現(xiàn)有10例患者的軟骨質(zhì)量沒(méi)有變化，3例患者的軟骨質(zhì)量出現(xiàn)惡化，出現(xiàn)這種情況的原因是注射過(guò)程中細(xì)胞懸液泄漏和操作過(guò)程中造成的細(xì)胞損傷，從而降低了MSC的存活率[39]。因此，提高M(jìn)SC活細(xì)胞植入率對(duì)于MSC治療OA的療效至關(guān)重要。隨著組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，增強(qiáng)細(xì)胞生物學(xué)能力的支架載體的應(yīng)用將有助于提高細(xì)胞治療的療效[40]?；谥Ъ茌d體的方法是通過(guò)使用物理力學(xué)結(jié)構(gòu)作為細(xì)胞培養(yǎng)的底物，從而簡(jiǎn)化了細(xì)胞組織形態(tài)的發(fā)生過(guò)程，它允許產(chǎn)生相對(duì)較大尺寸的工程化組織，而水凝膠是最受歡迎的支架系統(tǒng)之一，因?yàn)槠淇蔀镸SC提供高度水合的3D環(huán)境，不僅保護(hù)細(xì)胞并有助于將它們保持在適當(dāng)?shù)奈恢茫龠M(jìn)軟骨再生和透明軟骨形成[41]。Brunelle等[42]開(kāi)發(fā)了一種混合支架系統(tǒng)，它將熱敏性水凝膠聚乙二醇-聚N-異丙基丙烯酰胺與可生物降解聚己內(nèi)酯結(jié)合在一起，形成復(fù)合的微纖維結(jié)構(gòu)，混合支架改善了細(xì)胞/支架結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能，同時(shí)促進(jìn)了MSC向軟骨細(xì)胞的分化。雖然水凝膠在干細(xì)胞治療中取得顯著的進(jìn)展，但隨著新的合成和加工技術(shù)的發(fā)展，水凝膠的設(shè)計(jì)也在不斷變化。因此，在未來(lái)選擇何種水凝膠應(yīng)用于干細(xì)胞治療OA患者將是主要挑戰(zhàn)之一。

3 MSC治療OA的最佳劑量

目前MSC治療OA的最佳劑量尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，大多數(shù)的臨床試驗(yàn)中MSC的劑量范圍為1.18～150×106個(gè)/kg[43-44]。Koh等[43]給予18例OA患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1.18×106個(gè)/kg AD-MSC+3.0 mL PRP，并隨訪26個(gè)月，發(fā)現(xiàn)患者的西安大略和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)、Lysholm評(píng)分和視覺(jué)模擬量表評(píng)分均有明顯改善。Pers等[45]發(fā)現(xiàn)，OA患者膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射低劑量(2×106個(gè)/kg) 自體AD-MSC后，患者的疼痛感和膝關(guān)節(jié)功能較中劑量(10×106個(gè)/kg)和高劑量(50×106個(gè)/kg)均有不同程度的改善。Gupta等[44]的研究也表明，采用低劑量(25×106個(gè)/kg)同種異體BM-MSC關(guān)節(jié)腔注射治療OA患者，較其他劑量(50×106個(gè)/kg、75×106個(gè)/kg和150×106個(gè)/kg)更能改善患者的疼痛和膝關(guān)節(jié)功能。但是Jo等[46]給OA患者注射不同劑量的MSC，隨訪兩年后發(fā)現(xiàn)最高劑量組(100×106個(gè)/kg)與較低劑量組(10×106個(gè)/kg和50×106個(gè)/kg)相比，患者的疼痛感和膝關(guān)節(jié)功能均有顯著改善。Kabat等[47]分析了2004～2018年報(bào)告的914項(xiàng)MSC試驗(yàn)，建議MSC的有效低劑量為75×106個(gè)/kg，MSC預(yù)期有效劑量為150×106個(gè)/kg，以及MSC較高劑量為300×106個(gè)/kg。然而，MSC治療OA的最佳劑量還需要更多的隨機(jī)對(duì)照臨床研究來(lái)確定。

4 MSC治療OA的給藥頻率

目前大多數(shù)的研究都只使用單劑量的MSC治療OA患者，并對(duì)患者進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的6個(gè)月隨訪，在這一時(shí)間框架內(nèi)并不能充分觀察MSC治療OA的長(zhǎng)期副作用或長(zhǎng)期臨床價(jià)值。由于關(guān)節(jié)腔注射的MSC在關(guān)節(jié)內(nèi)的活性持續(xù)時(shí)間有限，單次關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSC不再被認(rèn)為是“終生OA治療”，多次關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射在一定程度上有更好的效果[48]。Matas等[49]對(duì)單次和多次(首次治療后6個(gè)月再次使用MSC)使用MSC治療OA患者的療效進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)多次使用MSC治療的患者的疼痛程度明顯低于單次使用MSC治療的患者，安全性較高，并未出現(xiàn)不良反應(yīng)。Shah等[50]的研究也得出相同的結(jié)論。Magri等[51]將28匹OA模型馬分成兩組，MSC-1組注射MSC后1個(gè)月注射安慰劑，MSC-2組注射MSC后1個(gè)月再次注射MSC，發(fā)現(xiàn)兩組馬匹的臨床總評(píng)分均較治療前有明顯改善，但是兩組的臨床總評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，MSC治療OA的給藥頻率還需要更多的對(duì)照研究才能得出明確的結(jié)論。

5 小 結(jié)

盡管目前仍缺乏MSC治療OA長(zhǎng)期療效的直接證據(jù)，但MSC用于治療OA已經(jīng)成為一種有效的潛在方法。然而目前的臨床實(shí)驗(yàn)研究對(duì)于MSC的細(xì)胞組織來(lái)源、劑量、注射次數(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)方法、移植方式、隨訪時(shí)間及用于評(píng)估改善情況的方法均沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，其細(xì)胞最佳來(lái)源仍然還處在驗(yàn)證階段。因此，在未來(lái)的臨床研究中仍需確定MSC的作用機(jī)制、最佳來(lái)源、最佳細(xì)胞劑量、理想的目標(biāo)患者群體以及最佳的給藥方法?？偠灾?，在未來(lái)MSC治療OA將擁有更加廣闊的應(yīng)用前景。