陳濤，汪娟，黃文濤

(武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)是一種慢性和非惡性泌尿生殖系統(tǒng)疾病，中老年男性高發(fā)[1]。報(bào)道顯示，BPH的發(fā)病率從40歲男性群體中的8%大幅上升至90歲男性群體中的90%[2]。BPH作為一種良性的腺體增生雖然在短期內(nèi)并不會(huì)直接危害患者的生命安全，但BPH是患者產(chǎn)生尿頻和尿潴留等下尿路綜合征(lower urinary tract symptoms，LUTS)的關(guān)鍵原因，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3]。5α-還原酶抑制藥和α-受體阻斷藥是BPH臨床治療的雙子星藥物[4]。然而，盡管5α-還原酶抑制藥和α-受體阻斷藥的廣泛應(yīng)用，BPH-LUTS的風(fēng)險(xiǎn)仍然存在。約20%有癥狀的BPH患者不得不接受手術(shù)[5]。與此同時(shí)，植物制劑也在BPH的防治中占據(jù)一定份額。但植物制劑的具體作用機(jī)制并不明確[4]。繼續(xù)尋找BPH的防治靶點(diǎn)仍是業(yè)內(nèi)關(guān)注的重點(diǎn)。筆者[6]前期研究發(fā)現(xiàn)改善前列腺膠原沉積和纖維化是防治BPH的可行方向。MMI-0100是一種細(xì)胞滲透肽，對(duì)心肌纖維化等具有一定改善作用[7]。然而有關(guān)MMI-0100在BPH和前列腺纖維化中的作用鮮有報(bào)道。本文探討MMI-0100對(duì)BPH大鼠的防治作用和可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 丙酸睪酮注射液購于天津金耀藥業(yè)有限公司(規(guī)格為1 mL：25 mg；批號(hào)：150822)。MMI-0100購于南京金斯瑞生物科技有限公司(序列：YARAAARQARAKALARQLGVAA；批號(hào)：C1392DK230-1/PE4329)?？贵wP38(批號(hào)：ab32142)和磷酸化P38(phosphorylation-P38，p-P38)-P38(批號(hào)：ab38238)購于英國Abcam公司，波形蛋白(vimentin，VIM)(批號(hào)：10366-1-AP)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)(批號(hào)：55135-1-AP)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)(批號(hào)：21898-1-AP)和絲裂原活化蛋白激酶活化蛋白激酶2(mitogen activated protein kinase activated protein kinase 2、MK2)(批號(hào)：13949-1-AP)購于美國Proteintech公司，p-MK2購于美國Santa cruz公司(批號(hào)：sc-293139)。MK3型酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司)，Ulupure型超純水機(jī)(法國 Millipore公司)，Tanon-5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模 雄性Wistar大鼠購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，7周齡，體質(zhì)量160～180 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為3組(n=6)：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和MMI-0100組。大鼠BPH模型參考文獻(xiàn)[3]，通過手術(shù)去勢(shì)(切除睪丸)后每日皮下注射 5 mg·kg-1·d-1丙酸睪酮，連續(xù)30 d。MMI-0100組每日腹腔注射40 μg·kg-1MMI-0100。給藥劑量參考文獻(xiàn)[7]并根據(jù)動(dòng)物體表面積換算得出。正常對(duì)照組大鼠切開下腹部后隨即縫合(假手術(shù))。30 d實(shí)驗(yàn)周期后，記錄大鼠體質(zhì)量。大鼠腹腔注射100 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉，處死。實(shí)驗(yàn)操作遵從《湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。處死大鼠后分離前列腺，記錄前列腺質(zhì)量。前列腺指數(shù)=前列腺質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(100 g)。隨后分割前列腺組織，部分組織在4 ℃浸泡于4%多聚甲醛用于石蠟包埋和組織切片。部分新鮮組織剪碎后液氮研磨用于提取總蛋白和總RNA。

1.2.2膠原沉積和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)評(píng)價(jià) 通過蘇木精-伊紅(HE)染色前列腺組織切片觀察前列腺增生情況。每張切片隨機(jī)選取視野3個(gè)，每個(gè)視野隨機(jī)選取3處測(cè)量前列腺上皮厚度。通過馬松(Masson)染色觀察前列腺膠原沉積。通過免疫組化染色前列腺組織切片、Western blotting(WB)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)檢測(cè)前列腺新鮮組織VIM和α-SMA的表達(dá)和 mRNA水平來評(píng)價(jià)前列腺EMT。VIM(NM_003380.5)前引物為5′-TGCCAACCGGAACAACGAT-3′，后引物為5′-AATTCTCTTCCATTTCACGCATC-3′和α-SMA(NM_031004.2)前引物為5′-CGGGCATCCACGAAACCA-3′，后引物為5′-GAGCCGCCGATCCAGACA-3′。GAPDH(NM_017008.4)為內(nèi)參，前引物為5′-CAAGTTCAAC-GGCACAG-3′，后引物為5′-CCAGTAGACTCCACGACAT-3′。根據(jù)RT-qPCR Master Mix說明書操作于real-time PCR system(ABI StepOne Plus)進(jìn)行qPCR檢測(cè)。

1.2.3P38/ MK2/TGF-β1信號(hào)通路評(píng)估 通過Western blotting測(cè)定MK2、p-MK2、P38、p-P38和TGF-β1的蛋白表達(dá)水平評(píng)估前列腺P38/ MK2/TGF-β1信號(hào)通路的活躍程度。提取前列腺新鮮組織總蛋白后，采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)膜。于室溫環(huán)境下，用5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后用相應(yīng)的一抗在4 ℃環(huán)境下孵育12 h。洗滌后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗于室溫環(huán)境下孵育1 h。電化學(xué)發(fā)光并采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)，通過TANONGIS軟件記錄灰度值。

2 結(jié)果

2.1MMI-0100抑制前列腺增生和膠原沉積 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和MMI-0100組大鼠前列腺指數(shù)分別為(2.72±0.15 )×10-2，(3.51±0.14 )×10-2，(3.12±0.10)×10-2。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠前列腺指數(shù)顯著升高(t=-10.129，P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，MMI-0100組前列腺指數(shù)顯著降低(t=6.026，P<0.05)。 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和MMI-0100組大鼠前列腺上皮厚度分別為(21.7±1.56)，(40.26±4.52)，(26.32±3.27) μm。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組前列腺上皮厚度顯著增加(t=-10.973，P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，MMI-0100組前列腺上皮厚度顯著減小(t=7.062，P<0.05)。Masson染色顯示，MMI-0100能夠抑制BPH大鼠的前列腺膠原沉積。見圖1。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.MMI-0100組。圖1 3組大鼠前列腺組織HE和Masson染色(×200) A.normal control group；B.model control group；C.MMI-0100 group.Fig.1 HE and Masson staining of prostate tissue in three groups of rats(×200)

2.2MMI-0100抑制前列腺EMT 從圖2定性分析可見，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠前列腺VIM和α-SMA的表達(dá)增強(qiáng)。MMI-0100能有效抑制前列腺VIM和α-SMA的表達(dá)。見圖3，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠前列腺VIM和α-SMA的mRNA水平以及蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。與BPH模型對(duì)照組比較，MMI-0100組VIM和α-SMA的mRNA水平以及蛋白表達(dá)水平均顯著降低(均P<0.05)。說明MMI-0100能夠抑制BPH大鼠前列腺的EMT。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.MMI-0100組。圖2 3組大鼠前列腺組織α-SMA和VIM表達(dá)(×200) A.normal control group；B.model control group；C.MMI-0100 group.Fig.2 Expression of α-SMA and VIM in prostate tissues of three groups of rats(×200)

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.MMI-0100組。①與正常對(duì)照組比較，t=-9.172～-3.521，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，t=-7.833～-3.454，P<0.05。圖3 3組大鼠前列腺組織α-SMA和VIM的mRNA及蛋白表達(dá)水平±s，n=6) A.normal control group；B.model control group；C.MMI-0100 group.①Compared with normal control group，t=-9.172—-3.521，P<0.05；②Compared with model control group，t=-7.833—-3.454，P<0.05.Fig.3 α-SMA and VIM mRNA and protein levels in prostate tissues of three groups of ±s，n=6)

2.3MMI-0100抑制前列腺P38/ MK2/TGF-β1信號(hào)通路 由圖4可見，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠前列腺P38和MK2的磷酸化水平以及TGF-β1的表達(dá)均顯著升高(均P<0.05)。MMI-0100組MK2的磷酸化水平及TGF-β1的表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)。同時(shí)，MMI-0100組大鼠前列腺P38的磷酸化水平并未明顯改變(P>0.05)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.MMI-0100組。①與正常對(duì)照組比較，t=-9.456～3.515，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，t=-0.792，-7.563，-3.223，P<0.05。圖4 3組大鼠前列腺組織p-P38、P38、p-MK2、MK2和TGF-β1表達(dá)水平 A.normal control group；B.model control group；C.MMI-0100 group.①Compared with normal control group，t=-9.456-3.515，P<0.05；②Compared with model control group，t=-0.792，-7.563，-3.223，P<0.05.Fig.4 Expression levels of p-P38，P38，p-MK2，MK2 and TGF-β1 in prostate tissues of three groups of rats

3 討論

BPH-LUTS的病因?qū)W復(fù)雜，其確切的病理機(jī)制至今尚未完全闡明。器官纖維化是結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)重建過程，包括成肌細(xì)胞活化、膠原沉積和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)重塑等[8]。器官纖維化是衰老、組織損傷和器官功能紊亂的病理基礎(chǔ)之一[9]。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺纖維化造成尿道周圍組織硬度增加是BPH導(dǎo)致LUTS的重要原因[8，10]。ECM是一類由支持細(xì)胞分泌的細(xì)胞外分子的總稱，其成分和比例對(duì)維持細(xì)胞外環(huán)境穩(wěn)定和正常生理功能至關(guān)重要[11]。其中，α-SMA的過量產(chǎn)生是肌成纖維細(xì)胞分化的標(biāo)志之一[10]。EMT是細(xì)胞由上皮表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型的過程，將破壞上皮屏障中的細(xì)胞-細(xì)胞粘附[12]。該過程中間質(zhì)標(biāo)記物VIM和α-SMA表達(dá)明顯上升。其中，VIM在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和細(xì)胞粘附方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。細(xì)胞失去極性、喪失細(xì)胞間的粘附能力并引起細(xì)胞骨架成分改變，新形成的間質(zhì)細(xì)胞沿基底ECM侵入下層組織，是器官纖維化的核心基礎(chǔ)之一[14]。本研究結(jié)果顯示MMI-0100能夠抑制BPH模型大鼠的前列腺膠原沉積，并改善前列腺EMT，說明MMI-0100具有防治BPH和前列腺纖維化的潛力。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物過程[15]。報(bào)道顯示MAPKs家族中的經(jīng)典通路均參與BPH[11]。其中，P38是MAPKs家族重要的一員。其磷酸化激活具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化和膠原沉積的作用[7]。MK2是一種細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶，也是MAPK的活化蛋白激酶。MK2是P38的下游，其磷酸化水平與P38的磷酸化水平成正比[15]。不僅如此，經(jīng)P38活化后，磷酸化的MK2將作用于P38信號(hào)鏈的遠(yuǎn)端下游靶點(diǎn)TGF-β[16]。TGF-β作為器官纖維化病變的關(guān)鍵因素之一，能夠明顯促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞增殖、成纖維細(xì)胞活化和ECM蛋白產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)膠原沉積[10，17]。MK2是TGF-β誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)和肌成纖維細(xì)胞分化的必需節(jié)點(diǎn)[16]。TGF-β家族包括多種分型，其中TGF-β1與纖維化過程密切相關(guān)。抑制TGF-β1表達(dá)，從而阻斷經(jīng)典的TGF-β1/Smad(drosophila mothers against decapentaplegic protein)信號(hào)通路和非Smad依賴的TGF-β1信號(hào)通路是抗纖維化治療的方向之一[18]。通過BPH患者前列腺組織的染色分析發(fā)現(xiàn)，5α-還原酶抑制藥和α-受體阻斷藥治療失敗的可能原因之一便是導(dǎo)致前列腺TGF-β的表達(dá)上升[10]。

細(xì)胞滲透肽MMI-0100是MK2的抑制劑，對(duì)心臟纖維化、肺纖維化等具有明顯的改善作用[7]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MMI-0100能夠減輕前列腺纖維化，其作用機(jī)制與抑制前列腺M(fèi)K2的磷酸化表達(dá)從而阻斷P38/ MK2/TGF-β1信號(hào)通路有關(guān)，為BPH-LUTS的防治提供了可供參考的思路。在今后的研究中，筆者將深入探討MMI-0100干預(yù)對(duì)5α-還原酶抑制藥和α-受體阻斷藥耐受型BPH的治療潛力。