劉慧娟，陶愛群，姜小文

（湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 衡陽 421005）

喜樹屬于山茱萸目藍(lán)果樹科，是中國特有樹種和國家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物，主要分布在長江流域及西南各省[1]。喜樹全身是寶，用途廣泛，全株含有抗腫瘤作用的生物堿；枝葉含豐富的營養(yǎng)元素，是較好的綠肥樹種；果實(shí)富含人體必須的不飽和脂肪酸，極具開發(fā)價(jià)值；木材纖維素含量高，形態(tài)好，長度大，花紋美觀，油漆后光亮性較好，適于造紙、室內(nèi)裝修等；此外，喜樹對(duì)二氧化硫、氟化氫等有害氣體抗性較強(qiáng)，是常用的園林綠化樹種[2]。

野生喜樹資源十分有限，無法實(shí)現(xiàn)喜樹資源綜合利用的產(chǎn)業(yè)化和規(guī)模化。喜樹種子易休眠，萌發(fā)率低，是喜樹人工培育的瓶頸。利用喜樹不同部位作為外植體組織培養(yǎng)已有報(bào)道[3]，但以種子作為外殖體的培養(yǎng)體系并不完整。本試驗(yàn)以喜樹種子無菌萌發(fā)為基礎(chǔ)，建立種子組培體系，旨在為喜樹產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供所需苗木。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 種子。喜樹種子于2019 年11 月采自南岳衡山海拔595 m 處的野生喜樹集生地，樹齡18 年。采收后陰干，冰箱冷藏。

1.1.2 培養(yǎng)基。本研究以MS、1/2MS、WPM、改良WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同的激素，建立喜樹組織培養(yǎng)的5組培養(yǎng)基配方，詳見表1～表5。

表2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基

表3 愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基

表4 增殖培養(yǎng)基

表5 生根培養(yǎng)基

以上培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L、瓊脂粉7 g/L，pH 值5.8。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子消毒與萌芽。將儲(chǔ)存待用的種子篩選去掉雜質(zhì)，去除果皮，留下種胚。使用洗潔精清洗1 次，清水沖洗3 次，75%酒精浸泡30 s，流水沖洗1 h。在超凈工作臺(tái)內(nèi)將種子放入燒杯中，使用75%酒精浸泡1 min，然后用無菌水沖洗3～4 次；再用10%次氯酸鈉溶液抽濾20 min，再用無菌水沖洗3～4 次。將種子接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接10 瓶，每瓶接5 顆種子，3 次重復(fù)，放在培養(yǎng)室培養(yǎng)。接種20 天后，觀察各個(gè)處理的喜樹種子萌芽情況。

萌芽率=萌芽數(shù)/接種數(shù)×100%。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化培養(yǎng)。將種子萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)30 天的喜樹無菌苗分為根、莖、葉3 個(gè)部分，分別接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接10瓶，每瓶接種5個(gè)，重復(fù)3次，30 天后統(tǒng)計(jì)各個(gè)愈傷組織誘導(dǎo)率。將誘導(dǎo)培養(yǎng)30 天的莖愈傷組織接種到愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接10 瓶，每瓶接5 塊，30 天后統(tǒng)計(jì)不定芽分化率。

誘導(dǎo)率=產(chǎn)愈傷數(shù)/接種數(shù)×100%

不定芽分化率=分化出不定芽愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織數(shù)×100%

1.2.3 不定芽增殖培養(yǎng)。切取長2～3 cm 的不定芽，接種到不定芽增殖培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接10 瓶，每瓶接5 個(gè)不定芽，重復(fù)3 次，30 天后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)=增殖后苗總數(shù)/接入苗數(shù)

1.2.4 生根培養(yǎng)與練苗移栽。切取長3 cm 以上的無菌苗，接入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個(gè)處理接10 瓶，每瓶接5 株，重復(fù)3 次，30 天后統(tǒng)計(jì)生根率。生根良好的瓶苗在3 月煉苗7 天后取出小苗，洗凈根部殘留培養(yǎng)基，移栽在泥炭土:蛭石:珍珠巖=1:1:1 的基質(zhì)中。適當(dāng)遮蔭，加強(qiáng)土、肥、水管理，30 天后統(tǒng)計(jì)存活率。生根率=生根苗叢數(shù)/接種苗叢數(shù)×100%存活率=成活株數(shù)/移栽株樹×100%

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌外植體培養(yǎng)結(jié)果

種子處理接種培養(yǎng)第8 天觀察發(fā)現(xiàn)，喜樹種子開始長出胚根；11 天開始萌芽；20 天長出2 片真葉；30 天后苗高2.5～3.0 cm。

由表6 及圖1 可知，以MS 培養(yǎng)基為啟動(dòng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)萌發(fā)最佳，長勢(shì)旺且萌發(fā)率最高為86.7%。

表6 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)萌芽情況

圖1 誘導(dǎo)萌芽結(jié)果

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果

由表7 可知，以WPM+NAA0.2 mg/L+BA1.5 mg/L 培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織平均值最高為58.67%；以無菌苗外植體的莖作為愈傷組織誘導(dǎo)最佳，誘導(dǎo)率為82%。

表7 不同培養(yǎng)基愈傷組織培養(yǎng)情況

2.3 愈傷組織分化培養(yǎng)結(jié)果

由表8 可知，以WPM+BA1.0 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織不定芽分化誘導(dǎo)率最高為82%，平均不定芽數(shù)最高為4.55 個(gè)。

表8 不同培養(yǎng)基不定芽分化情況

2.4 增殖培養(yǎng)結(jié)果

由表9 可知，不定芽增殖培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為WPM+BA 0.5 mg/L，增殖系數(shù)最高為5.8，且平均芽長最長為0.74 cm。

表9 不同培養(yǎng)基不定芽增殖培養(yǎng)情況

2.5 生根培養(yǎng)結(jié)果

由表10可知，生根培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為WPM+IBA 0.5 mg/L，生根率最高為88%，平均根數(shù)最多為6 條，且平均根長最長為1.26 cm。

表10 不同培養(yǎng)基生根培養(yǎng)情況

2.6 組培苗室外煉苗

由表11 可知，生根良好的瓶苗經(jīng)過煉苗存活率較高為91%，適合移栽到室外。

表11 煉苗成活率

3 結(jié)論與討論

在喜樹組織培養(yǎng)過程中，外植體的選擇尤為重要，喜樹組織培養(yǎng)所選用的外植體大多采自當(dāng)?shù)囟嗄晟矘溆酌鏪4～7]。而喜樹種子本身存在休眠現(xiàn)象，所需時(shí)間較長，本試驗(yàn)利用種子進(jìn)行無菌苗誘導(dǎo)，解決了時(shí)間長的問題。試驗(yàn)中成功利用當(dāng)年生喜樹種子作為外植體，通過種子滅菌消毒、培養(yǎng)基篩選、激素處理等，建立了喜樹愈傷組織誘導(dǎo)、增殖誘導(dǎo)、生根培養(yǎng)和煉苗移栽體系。

本試驗(yàn)中，喜樹種子最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基，萌芽率為86.7%；30 天齡喜樹試管苗莖在WPM+NAA 0.5 mg/L+BA1.5 mg/L 培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為82%；愈傷組織脫分化不定芽分化最佳培養(yǎng)基為WPM+BA1.0 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L，分化率達(dá)82%，每塊愈傷組織平均分化芽數(shù)4.55 個(gè)；不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為WPM+BA0.5 mg/L，增殖系數(shù)最大為5.8，平均芽長0.74 cm；生根培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為WPM+IBA0.5 mg/L，生根率最高為88%，平均根數(shù)6 根，平均根長1.26 cm。移栽至泥炭土:蛭石:珍珠巖=1:1:1 的基質(zhì)中生長良好，存活率達(dá) 91%。本次試驗(yàn)為喜樹工廠化育苗提供了關(guān)鍵解決途徑。