焦 健，張理茜

（中國科學(xué)院科技戰(zhàn)略咨詢研究院，北京 100190）

目前，越來越多的小分子RNA，如miRNA 或siRNA 等，通過測序或生物信息學(xué)預(yù)測的手段被報道，而其中僅有少數(shù)研究較多。表達(dá)和沉默小分子RNA 是廣泛使用的反向遺傳學(xué)策略[1]，為了研究小分子RNA 在植物病原菌與其寄主互作中的生物學(xué)功能，尤其是與麥類作物寄主互作機(jī)制，本文研究了基于VIGS 的小分子RNA 沉默技術(shù)體系。

大麥條紋花葉病毒（Barley Stripe Mosaic Virus，BSMV）載體應(yīng)用于單子葉麥類作物的研究，最早于2002 年由Holzberg 等[2]報道。研究通過改造BSMV病毒載體，如刪除BSMV的外殼蛋白等，以PDS 基因作為試驗對象，系統(tǒng)研究了BSMV-β 或BSMV-γ鏈插入片段的位點、方向和同源性等，詳細(xì)闡明了BSMV 病毒載體在麥類作物中可作為反向遺傳學(xué)研究工具的可行性。該研究首次在單子葉麥類作物中證明了應(yīng)用BSMV 病毒載體的有效性，為麥類作物基因功能的驗證和單子葉植物RNA 沉默機(jī)制的研究提供了有效工具。本研究利用BSMV 作為載體，開展麥類作物及其病原真菌的小分子RNA 沉默技術(shù)體系研究，旨在為麥類作物及其病原真菌的相互作用提供一種反向遺傳學(xué)的技術(shù)策略。

1 材料與方法

1.1 植株材料

小麥材料：小偃54；其他植株材料：本生煙、擬南芥等。

1.2 載體和菌株

VIGS 相關(guān)的病毒載體：BSMV-LIC 載體（α，β 和γ 均為DNA 質(zhì)粒）。

表達(dá)載體：pGreen 載體，用于內(nèi)源siRNA 或miRNA 在本生煙中高表達(dá)。

克隆載體：pEASY-T、Gateway 相關(guān)載體。

大腸桿菌菌株：DH5α 和DH10B；農(nóng)桿菌菌株：GV3101和EHA105。

1.3 BSMV pCaBS-γ-LIC 載體的構(gòu)建

用于內(nèi)源基因沉默：PCR 擴(kuò)增目的片段時，最優(yōu)片段大小約為200～400 bp。正向引物5’端需加LIC 接頭的序列為5’-AAGGAAGTTTAA-3’，反向引物5’端需加LIC 接頭的序列為5’-AACCACCACCACCGT-3’。

操作流程：PCR 擴(kuò)增帶有LIC 接頭的目的片斷；將pCaBS-γ-LIC 載體用ApaI 完全酶切，并依照圖1 流程將目的片段與載體用LIC 克隆方法連接。

圖1 BSMV pCaBS-γ-LIC 載體的構(gòu)建示意圖

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建BSMV pCaBS-γ-LIC 沉默載體

首先構(gòu)建了用于沉默目標(biāo)小分子RNA 基因的載體，將BSMV 載體與AtIPS1 序列相連接，詳見圖2，表達(dá)這些小分子RNA 靶標(biāo)模擬序列，已達(dá)到沉默小分子RNA 的目的。

圖2 BSMV-γb 載體及基于AtIPS1 的MIM 序列示意圖

構(gòu)建過程。在BSMV pCaBS-γ-LIC 載體的LIC 端插入MIM 序列，即基于AtIPS1 序列改造的基本骨架序列，而且圖中虛線所示片段被替換為目標(biāo)小分子RNA 的同源片段，所有片段都采用高保真堿基人工合成方法。

2.2 沉默技術(shù)體系的效果驗證

利用構(gòu)建的BSMV-MIM 載體，有效沉默了小麥miR159a。BSMV 表達(dá)MIM159a 序列可以通過半定量RT PCR 檢測到，BSMV 侵染小麥葉片也出現(xiàn)了明顯的病毒癥狀。通過qPCR 檢測小麥miR159a 及其靶標(biāo)基因TaMYB3，發(fā)現(xiàn)小麥miR159a 轉(zhuǎn)錄水平相對表達(dá)量顯著下降，而靶標(biāo)基因TaMYB3 的轉(zhuǎn)錄水平相對表達(dá)量顯著升高。結(jié)果說明，BSMV 表達(dá)MIM159a 序列可有效沉默miR159a。

3 結(jié)論與討論

在植物中，少數(shù)帶注釋的miRNA 基因家族在植物家族之間是保守的，而大多數(shù)是家族或物種特異性的[3]。許多經(jīng)典miRNA 是保守的，一些調(diào)節(jié)保守的目標(biāo)在植物界中顯示出保守的功能。小麥特異性miRNAs 在小麥生長和發(fā)育中可能以物種特異性方式發(fā)揮作用。miR159 在單子葉植物和雙子葉植物中是保守的，是小麥葉片中具有較高表達(dá)水平的幾個miRNA 之一。

miRNA 的過表達(dá)和沉默是研究miRNA 功能的兩種最廣泛使用的反向遺傳策略。研究miRNA 功能的傳統(tǒng)方法通常需要繁瑣且耗時的工作，才能生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物。

基于BSMV 的miRNA 沉默系統(tǒng)具有優(yōu)于其他植物miRNA功能分析的幾個優(yōu)勢。首先，基于BSMV 的miRNA 沉默系統(tǒng)高效快速，4 周內(nèi)即可觀察到miRNA 沉默介導(dǎo)的表型。其次，基于BSMV 的miRNA 沉默系統(tǒng)不需要復(fù)雜的小麥穩(wěn)定轉(zhuǎn)化程序，只需要簡單的農(nóng)桿菌滲透技術(shù)即可進(jìn)行miRNA 沉默。這對于miRNA的功能表征特別有效，這些miRNA 的敲除可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因品系中的孢子體或配子體致死，以及不適用于穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化的小麥作物。此外，除了自然寄主大麥和小麥外，BSMV 的寄主范圍很廣。

本次研究證明了改良的BSMV 介導(dǎo)的小分子RNA 沉默系統(tǒng)可用于抑制普通小麥中的內(nèi)源miRNA 活性，成功沉默了小麥中的miR159a。通過PCR 或小分子RNA Stem-loop Real-Time PCR 技術(shù)，檢測到相應(yīng)的MIM 序列，并且在表達(dá)MIM 序列的小麥植物中，miR159a 靶基因的水平顯著增加，但在BSMVEV 感染的植物中沒有檢測到。結(jié)果表明，基于BSMV 的小分子RNA 沉默系統(tǒng)通過過表達(dá)小分子RNA 的目標(biāo)模擬物，可有效沉默小麥中的內(nèi)源性小分子RNA。