王少津，許麗娃，吳和弟

（1.?？谑腥嗣襻t(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，海南?？?70000；2.?？谑腥嗣襻t(yī)院老年病科，海南?？?70000）

2 型糖尿病是指因機(jī)體胰島素分泌不足或是胰島素抵抗所致機(jī)體的血糖水平呈持續(xù)性異常升高的慢性疾病，全球2 型糖尿病病例數(shù)在1994 年約1.20 億、1999 年約1.35 億、2000 年約1.75 億、2010 年約2.39 億，預(yù)計(jì)2025 年可能會(huì)突破3 億，其發(fā)病趨勢在近幾十年呈現(xiàn)出難以緩解的趨勢[1]。過去的幾十年中2 型糖尿病在老年群體中的發(fā)病率較高，但如今在青壯年群體中的發(fā)病率呈現(xiàn)出顯著升高趨勢，甚至在兒童或青少年中也可發(fā)生，有的國家小兒2 型糖尿病占糖尿病患者的一半以上[2]。在全球糖尿病惡化趨勢的大環(huán)境下，我國每年新增糖尿病患者120萬人，其發(fā)病率僅次于印度，由于我國的人口基數(shù)大且老齡化加劇，我國糖尿病病例數(shù)有可能超過印度[3]。2型糖尿病患者若血糖水平控制不佳，可引起心、腦、腎等重要器官組織損傷，產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥，尤其是腦卒中[4]。尤瑞克林是一種用于治療急性腦缺血的血管藥物，具有選擇性地?cái)U(kuò)張腦缺血組織部位的腦血管的作用，還可以減輕腦組織中神經(jīng)細(xì)胞的損傷和促進(jìn)腦內(nèi)源性的神經(jīng)再生，但其中的干預(yù)機(jī)制尚不清楚[5]。乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）是乙醛脫氫酶的同工酶，是催化多種醛類物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，也參與腦梗死調(diào)節(jié)過程[6]。尤瑞克林對腦缺血損傷的保護(hù)作用是否與ALDH2 有關(guān)尚不清楚。因此，本研究主要是基于ALDH2 探討尤瑞克林對糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級SD 大鼠，6～7 周齡，體質(zhì)量（240±10）g，購于廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2020?0055，于SPF級環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

ALDH2 阻斷劑氨基氰（cyanamide，Cya）（美國Sigma 公司）；尤瑞克林（廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司）；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）、過氧化氫酶（catalase、CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）、白細(xì)胞介素?6（interleukin?6，IL?6）、白細(xì)胞介素?1β（inter?leukin?1β，IL?1β）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；TUNEL 試劑盒（德國Roche 公司）；兔多抗B淋巴細(xì)胞瘤?2（Bcl?2）、Bcl?2相關(guān)x蛋白（Bax）、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶?3（Cleaved?caspase?3）、ALDH2、甘油醛?3?磷酸脫氫酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗（英國Ab?cam 公司）。腦立體定位儀（美國STOELTING 公司）；普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；Light?cyce480實(shí)時(shí)定量PCR儀（羅氏診斷公司）。

1.3 糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠模型制備和分組

60 只SPF 級SD 大鼠，使用體質(zhì)量編號和隨機(jī)數(shù)表法分為對照組、模型組、尤瑞克林組、尤瑞克林+Cya 組，每組15 只。使用無菌STZ 聯(lián)合Zea?Longa法制備糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠模型[7]，糖尿病造模前禁食、禁水8 h，腹腔注射STZ，注射劑量為2 mg/100 g，1周后使用血糖儀檢測大鼠外周血血糖濃度，若連續(xù)7 d測得空腹血糖濃度≥16.7 mmol/L表示2型糖尿病模型制備成功，此次制模全部成功。對照組給予等體積的緩沖液。隨后將大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，固定在腦立體定位儀，常規(guī)消毒、暴露顱骨，前囟點(diǎn)作為定點(diǎn)并標(biāo)記，尤瑞克林+Cya 組使用微量注射器將1 mg/5 μL阻斷劑Cya注入給藥，模型組、尤瑞克林組注射等體積的助溶劑DMSO，對照組不做任何注射。完成后24 h，使用Zea?Longa法將糖尿病大鼠制成腦缺血再灌注大鼠模型，阻斷2 h再恢復(fù)血供，若大鼠出現(xiàn)身體不自主旋轉(zhuǎn)視為模型制備成功，此次制模全部成功。對照組除不進(jìn)行尼龍線插入，其余操作其他各組大鼠一樣。在恢復(fù)血供30 min時(shí)，尤瑞克林組、尤瑞克林+Cya組舌下靜脈給藥尤瑞克林8.75×10?3PNA 單位/kg，對照組、模型組舌下靜脈注射同體積的生理鹽水。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)功能評分各組大鼠缺血再灌注24 h，Longa 法[8]進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評估：無異常表現(xiàn)（0 分，無神經(jīng)損傷），左側(cè)前肢不完全伸展（1 分，輕度神經(jīng)功能缺損），爬行過程中向左轉(zhuǎn)圈（2 分，中度神經(jīng)功能缺損），爬行過程中傾倒、翻轉(zhuǎn)（3 分，重度神經(jīng)功能缺損），意識不清、無法行走（4 分），死亡（5分）。

1.4.2 腦含水量神經(jīng)功能評分評估后，斷頭處死大鼠，迅速分離腦組織，沿矢狀縫切開，左腦稱質(zhì)量（計(jì)為濕質(zhì)量），100 ℃恒溫烘箱中烤72 h 并再次稱質(zhì)量（計(jì)為干質(zhì)量），計(jì)算腦含水量=（腦組織濕質(zhì)量-腦組織干質(zhì)量）/腦組織濕質(zhì)量×100%。

1.4.3 HE 染色將大鼠腦組織置于4%（φ）多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、10 μm 切片、二甲苯脫蠟、復(fù)水、蘇木素和伊紅染色、脫水、透明、固定封片，顯微鏡鏡檢。

1.4.4 TUNEL 染色取“1.3.4”中的石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化，嚴(yán)格按照TUNEL 檢測試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，封片后，隨機(jī)選取5 個(gè)不重疊視野，用Image J 軟件分析細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.5 SOD、CAT、MDA、TNF?α、IL?6、IL?1β水平檢測將腦組織制成組織勻漿，酶聯(lián)免疫吸附法檢測SOD、CAT、MDA、TNF?α、IL?6、IL?1β水平。

1.4.6 Western blot 檢測蛋白水平提取腦組織總蛋白，Bradford 調(diào)整各組蛋白濃度一致，經(jīng)SDS?PAGE凝膠電泳（濃縮膠100 V電泳1.5 h、12%分離膠70 V電泳至距離膠邊緣5 mm 停止電泳），電轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜（200 mA 電流轉(zhuǎn)移2 h），5%脫脂奶粉室溫密封2 h，加入Cleaved?caspase?3（1∶1 000）、Bcl?2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、ALDH2（1∶1 000）、GAP?DH（1∶100）一抗4 ℃孵育過夜，TBST 漂洗40 min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，顯色、定影、采集影像，Image J 軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行作圖，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用±s表示，多組間數(shù)據(jù)分析使用單因素方法分析，后兩兩比較使用SNK 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和腦含水量比較

模型組大鼠的神經(jīng)功能評分和腦含水量均高于對照組（P＜0.05），尤瑞克林組、尤瑞克林+Cya 組大鼠的神經(jīng)功能評分和腦含水量均低于模型組（P＜0.05），尤瑞克林+Cya 組大鼠的神經(jīng)功能評分和腦含水量均高于尤瑞克林組（P＜0.05），見表1、2。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較Table 1 Comparison on scores of nerve function in each group

表2 各組大鼠腦含水量比較Table 2 Comparison on brain water content in each group

2.2 各組大鼠腦組織病理情況

對照組大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)正常、細(xì)胞排列和組織染色均勻。模型組大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)異常、細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)細(xì)胞空泡化和核固縮、裂解嚴(yán)重。尤瑞克林組、尤瑞克林+Cya組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)異常和排列紊亂現(xiàn)象較模型組得到明顯改善，見圖1。

2.3 各組大鼠腦組織凋亡情況

模型組大鼠的細(xì)胞凋亡率、Cleaved?caspase?3蛋白表達(dá)均高于對照組（P＜0.05），而Bcl?2/Bax、ALDH2蛋白表達(dá)均低于對照組（P＜0.05）；尤瑞克林組、尤瑞克林+Cya 組大鼠的細(xì)胞凋亡率、Cleaved?caspase?3蛋白表達(dá)均低于模型組（P＜0.05），而Bcl?2/Bax、ALDH2蛋白表達(dá)均高于模型組（P＜0.05）；尤瑞克林+Cya 組大鼠的細(xì)胞凋亡率、Cleaved?caspase?3蛋白表達(dá)均高于尤瑞克林組（P＜0.05），而Bcl?2/Bax、ALDH2蛋白表達(dá)均低于尤瑞克林組（P＜0.05），見圖2、表3。

2.4 各組腦組織SOD、CAT、MDA水平比較

模型組大鼠的MDA 水平高于對照組（P＜0.05），而SOD、CAT活性均低于對照組（P＜0.05）；尤瑞克林組、尤瑞克林+Cya 組大鼠的MDA 水平低于模型組（P＜0.05），而SOD、CAT 活性均高于模型組（P＜0.05）；尤瑞克林+Cya 組大鼠的MDA 水平高于尤瑞克林組（P＜0.05），而Bcl?2/Bax、ALDH2 蛋白表達(dá)均低于尤瑞克林組（P＜0.05），見表4。

2.5 各組腦組織TNF?α、IL?6、IL?1β含量比較

模型組大鼠的TNF?α、IL?6、IL?1β水平高于對照組（P＜0.05），尤瑞克林組、尤瑞克林+Cya 組大鼠的TNF?α、IL?6、IL?1β水平低于模型組（P＜0.05），尤瑞克林+Cya 組大鼠的TNF-α、IL?6、IL?1β水平高于尤瑞克林組（P＜0.05），見表5。

3 討論

糖尿病是短暫性腦缺血發(fā)作早期卒中和晚期復(fù)發(fā)卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高血糖可以引起內(nèi)膜損傷、乳酸累積、破壞血腦屏障、促進(jìn)興奮性氨基酸聚集，一旦出現(xiàn)腦缺血、缺氧時(shí)，機(jī)體組織中無氧酵解增多，酸性物質(zhì)堆積增多，從而使細(xì)胞內(nèi)外的酸中毒加重，進(jìn)一步加劇患者的腦組織中能量代謝過程[9]。因此，急性腦缺血患者發(fā)病期間必須了解患者血糖情況，控制血糖升高程度。糖尿病所致的動(dòng)脈粥樣硬化先是損傷動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞，若還存在代謝障礙、內(nèi)分泌紊亂或免疫功能障礙會(huì)進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷[10]。糖尿病患者機(jī)體的血小板的聚集性增強(qiáng)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷處容易聚集血小板和形成血小板、白色的血栓，產(chǎn)生釋放反應(yīng)，同時(shí)釋放能夠促進(jìn)血小板聚集、動(dòng)脈收縮等物質(zhì)，加重腦血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[11]。本研究通過構(gòu)建糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠模型顯示模型組大鼠的神經(jīng)功能評分和腦含水量均較健康大鼠呈出明顯升高趨勢，腦含水量增加表明腦組織存在組織損傷，本研究結(jié)果表明糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠確實(shí)存在神經(jīng)功能損傷。

尤瑞克林為人尿激肽原酶，對激肽有裂解作用，從而產(chǎn)生激肽，目前常用于急性進(jìn)展性腦梗死臨床治療，表現(xiàn)出良好的治療效果[12]。ALDH2基因是位于人12號染色體上，其編碼的蛋白屬于核基因編碼蛋白，具有酯酶、脫氫酶和還原酶的活性，通過多肽入線粒體中發(fā)揮作用，可在心、肝、腦等重要器官組織中表達(dá)[13]。本研究結(jié)果顯示模型組大鼠腦組織中的ALDH2 蛋白表達(dá)較健康大鼠呈現(xiàn)出明顯降低趨勢，經(jīng)尤瑞克林干預(yù)大鼠腦組織中的ALDH2蛋白表達(dá)較模型組大鼠呈現(xiàn)出明顯升高趨勢，而在尤瑞克林干預(yù)增加ALDH2 阻斷劑Cya 大鼠的腦組織中的ALDH2 蛋白表達(dá)較尤瑞克林干預(yù)組降低，推測尤瑞克林可提高ALDH2 蛋白表達(dá)。通過大鼠腦組織病理HE 染色觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)異常、分布紊亂，尤瑞克林干預(yù)可以明顯改善糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠腦組織病理情況，增加ALDH2阻斷劑Cya干預(yù)可部分逆轉(zhuǎn)尤瑞克林的改善效果，再次說明尤瑞克林可以改善糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠腦組織損傷，可能與ALDH2有關(guān)。

圖1 大鼠腦組織HE染色Figure 1 HE staining of brain tissues in rats(200×,n=5)

圖2 各組大鼠海馬組織中細(xì)胞蛋白及ALDH2表達(dá)Figure 2 Expressions of cellular proteins and ALDH2 in hippocampus of each group

腦缺血再灌注損傷會(huì)引起腦神經(jīng)功能損傷，此過程受到多種生理過程調(diào)節(jié)，本研究結(jié)果顯示模型組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率、Cleaved caspase?3 蛋白表達(dá)升高，而Bcl?2/Bax 比值降低，尤瑞克林干預(yù)降低糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠腦組織凋亡率、Cleaved caspase?3 蛋白表達(dá)和提高Bcl?2/Bax 比值，而ALDH2 阻斷劑Cya 干預(yù)可部分逆轉(zhuǎn)尤瑞克林的調(diào)節(jié)趨勢。Bcl?2、Bax均為Bcl?2家族中參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的重要蛋白，其比值與線粒體的功能有關(guān)，同時(shí)其在線粒體結(jié)構(gòu)完整性方面表現(xiàn)出拮抗作用，在細(xì)胞凋亡過程分別發(fā)揮抑制、促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用[14]。caspase?3是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡多種途徑的最終執(zhí)行者，其在正常生理狀態(tài)下是以非生物活性形式存在，當(dāng)接受到細(xì)胞凋亡信號刺激時(shí)，caspase 家族成員通過剪切作用轉(zhuǎn)化為生物活性的狀態(tài)，參與細(xì)胞凋亡過程[15]。由此說明，尤瑞克林對糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)損傷的改善作用可能與調(diào)節(jié)ALDH2水平有關(guān)。

腦缺氧缺血時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基并誘導(dǎo)機(jī)體的氧化應(yīng)激增強(qiáng)，適當(dāng)?shù)难趸瘧?yīng)激可以提

表3 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白相對表達(dá)水平比較Table 3 Comparison on apoptosis rates and relative expression levels of apoptosis proteins in brain tissues of each group(±s,n=15)

表3 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白相對表達(dá)水平比較Table 3 Comparison on apoptosis rates and relative expression levels of apoptosis proteins in brain tissues of each group(±s,n=15)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與尤瑞克林組比較：&P＜0.05。

組別對照組模型組尤瑞克林組細(xì)胞凋亡率/%8.36±1.41 44.26±3.24*20.41±3.68#Bcl?2/Bax 2.58±0.08 0.16±0.04 1.44±0.07#Cleaved?caspase?3 0.23±0.08 0.94±0.08*0.46±0.05#ALDH2 0.84±0.05 0.20±0.06*0.69±0.04#尤瑞克林+Cya組31.85±2.74�.68±0.04�.78±0.05�.49±0.05&#

表4 各組腦組織SOD、CAT、MDA水平比較Table 4 Comparison of SOD，CAT and MDA levels in brain tissues of each group(±s,n=15)

表4 各組腦組織SOD、CAT、MDA水平比較Table 4 Comparison of SOD，CAT and MDA levels in brain tissues of each group(±s,n=15)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與尤瑞克林組比較：&P＜0.05。

組別對照組模型組尤瑞克林組尤瑞克林+Cya組SOD/（U·L-1）16.39±1.74 3.98±1.05*13.69±1.87#7.98±1.85&#MDA/（mmol·mL-1）14.99±1.69 49.62±2.84*26.98±2.87#37.11±3.22&#CAT/（U·L-1）21.94±2.99 8.96±1.42*17.58±2.34#12.67±2.41&#

表5各組腦組織TNF?α、IL?6、IL?1β含量比較

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與尤瑞克林組比較：&P＜0.05。

Table 5Comparison on the levels of TNF?α，IL?6 and IL?1βin brain tissues of each group(±s,n=15)高機(jī)體自身抵抗力，但是過度的氧化應(yīng)激會(huì)超出機(jī)體自身SOD、CAT 清除氧自由基能力，過量的氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)發(fā)生細(xì)胞膜攻擊和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，對細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性損傷，并給機(jī)體造成損傷，而MDA 就是此損傷過程中的代謝產(chǎn)物之一[16]。糖尿病患者自身血糖一直處于較高水平，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，腦組織缺氧缺血會(huì)加重這種應(yīng)激狀態(tài)，高血糖還會(huì)加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)可促進(jìn)血小板等物質(zhì)在損傷處聚集，加重腦缺血缺氧性損傷。本研究結(jié)果顯示尤瑞克林可以降低糖尿病合并腦缺缺血再灌注大鼠腦組織MDA、TNF?α、IL?6、IL?1β水平和提高SOD、CAT 活性，而Cya 可以部分逆轉(zhuǎn)這種趨勢。已有研究[17]表明抑制ALDH2 表達(dá)可以明顯提高脂多糖誘導(dǎo)下的心肌細(xì)胞的IL?6 和TNF?α水平升高，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。還有學(xué)者[18]研究顯示ALDH2 可在氯胺酮所致的膀胱炎中發(fā)揮抗炎、抗纖維化的作用，Tsai 等[19]發(fā)現(xiàn)ALDH2 可以通過減少活性氧、血管炎癥和血管平滑肌細(xì)胞凋亡來預(yù)防腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生。本研究結(jié)果也呈現(xiàn)出相似的趨勢，說明尤瑞克林對糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)損傷、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的改善作用可能與提高ALDH2表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，尤瑞克林可改善糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)損傷、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，其發(fā)揮這些作用可能與提高ALDH2 表達(dá)有關(guān)，但其中的詳細(xì)機(jī)制還需要在分子生物學(xué)層面開展探討。