柳越 王巖 高艷超 魏冰

糖尿病腎病(DN)是主要的糖尿病微血管疾病之一，可影響糖尿病患者的長(zhǎng)期生存率，更是終末期腎臟疾病的主要原因[1]。腎小管細(xì)胞損傷是DN的主要特征之一，研究認(rèn)為高血糖通過多種機(jī)制促進(jìn)活性氧產(chǎn)生，加重氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加，從而導(dǎo)致腎小管損傷[2]。因此，尋找有效抑制腎小管上皮細(xì)胞損傷的策略迫在眉睫。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類具有共價(jià)閉合環(huán)的非編碼RNA，其通過與特定的微小RNA(miRNA)結(jié)合，減輕miRNA對(duì)靶mRNA的抑制作用，參與急性腎損傷、腎細(xì)胞癌、DN等多種腎臟疾病的進(jìn)展[3-5]。研究報(bào)道circ_0041795在高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，沉默circ_0041795可抑制高糖誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，是治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的潛在靶點(diǎn)[6]。然而circ_0041795在DN進(jìn)展中的作用并不清楚。靶基因預(yù)測(cè)顯示miR-361-3p是circ_0041795的潛在靶點(diǎn)。有研究報(bào)道在高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈細(xì)胞損傷中miR-361-3p表達(dá)降低，過表達(dá)miR-361-3p可抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷，是糖尿病內(nèi)皮損傷治療靶點(diǎn)[7]。本研究探討circ_0041795對(duì)高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響，并通過miR-361-3p分析其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞HK-2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素雙抗購(gòu)于武漢普諾賽生命科技公司；cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技公司；Power SYBR green master mix購(gòu)于美國(guó)ABI公司；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)、雙熒光素酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)于北京百奧萊博科技公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin-V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海凱基生物公司；兔源Cleaved-caspase3抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司；超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組:①HK-2細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，培養(yǎng)箱條件為在37℃、含5%CO2。將對(duì)數(shù)期HK-2細(xì)胞鋪6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至約60%匯合時(shí)，利用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染si-circ_0041795、si-NC、miR-361-3p mimics、miR-NC、anti-miR-361-3p、si-circ_0041795+anti-miR-361-3p至HK-2細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。②實(shí)驗(yàn)分組：正常糖(NG)組：用含有5.5 mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液孵育HK-2細(xì)胞；高糖(HG)組：用含30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液孵育HK-2細(xì)胞[8]；HG+si-NC組、HG+si-circ_0041795組、HG+miR-NC組、HG+miR-361-3p組、HG+anti-miR-361-3p組、HG+si-circ_0041795+anti-miR-361-3p組：用含30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液分別孵育轉(zhuǎn)染si-NC、轉(zhuǎn)染si-circ_0041795、轉(zhuǎn)染miR-NC、轉(zhuǎn)染miR-361-3p mimics、轉(zhuǎn)染anti-miR-361-3p、轉(zhuǎn)染si-circ_0041795+anti-miR-361-3p的HK-2細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行功能分析。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)circ_0041795和miR-361-3p表達(dá):Trizol法提取各組HK-2細(xì)胞的總RNA。為檢測(cè)circ_0041795表達(dá)，利用cDNA第一鏈合成試劑盒將1 μg總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，利用Power SYBR green master mix進(jìn)行RT-qPCR。為檢測(cè)miR-361-3p，采用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再用miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。GAPDH和U6分別作為circRNA和miRNA的內(nèi)源性對(duì)照。2-△△Ct法計(jì)算circ_0041795和miR-361-3p表達(dá)量。circ_0041795上游引物5’-CCAAGGAGTG TGCC CC TTTT-3’，下游引物5’-AGTCATGGTAAACCAGCCGAT-3’；GAPDH上游引物5’-GGTGGTC TCCTCTGACTTCAA-3’，下游引物5’-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’；miR-361-3p上游引物5’-ACACTCCAGCTGGGTCCCCCAGGTGTGATTC-3’，下游引物5’-CTCAACT GG TGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAATCAGA-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGG CAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率:將轉(zhuǎn)染HK-2或未轉(zhuǎn)染細(xì)胞以2×103個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞處理。將10 μl的CCK-8溶液添加到每個(gè)孔中，然后在37℃下孵育2 h，酶標(biāo)儀讀取450 nm處的吸光度(A)以表示細(xì)胞活力。存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔)/(A對(duì)照孔-A空白孔)×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:用胰蛋白酶消化1×106個(gè)HK-2細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。將細(xì)胞重懸在500 μl結(jié)合緩沖液中，加入5 μl PI和5 μl AnnexinV-FITC在暗室染色20 min。流式細(xì)胞儀收集熒光信號(hào)，F(xiàn)lowJo 8.7.1軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 蛋白印跡法檢測(cè)Cleaved-caspase3蛋白表達(dá):全蛋白提取試劑盒分離各組HK-2細(xì)胞總蛋白。定量后，將適量蛋白與等體積2×上樣緩沖液混合均勻，煮沸3 min使其變性。取30 μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移蛋白到聚偏二氟乙烯膜。室溫環(huán)境下將膜在5%牛血清蛋白中封閉2 h，然后用一抗(Cleaved-caspase3和GAPDH抗體1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜。室溫環(huán)境下用相應(yīng)的二抗(1∶2 000稀釋)孵育膜1 h。按照化學(xué)發(fā)光試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行顯色反應(yīng)，凝膠成像系統(tǒng)分析Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 試劑盒檢測(cè)SOD活性、MDA含量以及LDH釋放:HK-2細(xì)胞處理完畢后，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清、細(xì)胞沉淀至新的離心管中。采用LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH水平。向細(xì)胞沉淀中加入提取液，超聲破碎細(xì)胞，收集上清液，采用SOD活性檢測(cè)試劑盒、MDA含量測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn):合成含有miR-361-3p預(yù)測(cè)位點(diǎn)序列的circ_0041795野生型(wt)序列片段或突變型(mut)序列片段，將上述片段插入到psiCHECK-2載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒wt-circ_0041795、mut-circ_0041795。利用Lipofectamine 2000將上述重組質(zhì)粒分別與miR-361-3p mimics、miR-NC轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后用雙熒光素酶活性測(cè)定試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 沉默circ_0041795或過表達(dá)miR-361-3p對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷的影響 與NG組比較，HG組HK-2細(xì)胞circ_0041795表達(dá)量、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量、凋亡率顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞存活率、miR-361-3p表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與HG組、HG+si-NC組比較，HG+si-circ_0041795組HK-2細(xì)胞circ_0041795表達(dá)量、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量、凋亡率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞存活率、miR-361-3p表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與HG組、HG+miR-NC組比較，HG+miR-361-3p組HK-2細(xì)胞Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量、凋亡率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞存活率、miR-361-3p表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 沉默circ_0041795或過表達(dá)miR-361-3p對(duì)HK-2凋亡的影響；A 沉默circ_0041795或過表達(dá)miR-361-3p對(duì)HK-2中Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的影響;B 沉默circ_0041795或過表達(dá)miR-361-3p均可抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡

表1 沉默circ_0041795或過表達(dá)miR-361-3p對(duì)HK-2細(xì)胞活性和凋亡的影響

2.2 沉默circ_0041795或過表達(dá)miR-361-3p對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2氧化應(yīng)激的影響 與NG組比較，HG組HK-2細(xì)胞MDA含量、LDH釋放量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與HG組、HG+si-NC組比較，HG+si-circ_0041795組HK-2細(xì)胞MDA含量、LDH釋放量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)；與HG組、HG+miR-NC組比較，HG+miR-361-3p組HK-2細(xì)胞MDA含量、LDH釋放量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 沉默circ_0041795或過表達(dá)miR-361-3p對(duì)HK-2氧化應(yīng)激的影響

2.3 circ_0041795靶向miR-361-3p Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)顯示circ_0041795與miR-361-3p序列間存在特異性結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶胞實(shí)驗(yàn)顯示，與miR-NC和wt-circ_0041795共轉(zhuǎn)染比較，miR-361-3p mimics和wt-circ_0041795共轉(zhuǎn)染后HK-2細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)；與miR-NC和mut-circ_0041795共轉(zhuǎn)染比較，miR-361-3p mimics和mut-circ_0041795共轉(zhuǎn)染后HK-2細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性無(wú)顯著變化(P>0.05)。見圖2，表3。

圖2 circ_0041795和miR-361-3p的互補(bǔ)序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.4 抑制miR-361-3p可逆轉(zhuǎn)沉默circ_0041795對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷的影響 與HG組比較，HG+si-circ_0041795組HK-2細(xì)胞存活率、miR-361-3p表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+ anti-miR-361-3p組HK-2細(xì)胞存活率、miR-361-3p表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與HG+si-circ_0041795組比較，HG+ si-circ_0041795+anti-miR-361-3p組HK-2細(xì)胞存活率、miR-361-3p表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 抑制miR-361-3p可逆轉(zhuǎn)沉默circ_0041795對(duì)HK-2凋亡的影響

表4 抑制miR-361-3p可逆轉(zhuǎn)沉默circ_0041795對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2損傷的影響

2.5 抑制miR-361-3p可逆轉(zhuǎn)沉默circ_0041795對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2氧化應(yīng)激的影響 與HG組比較，HG+si-circ_0041795組HK-2細(xì)胞MDA含量、SOD活性顯著升高(P<0.05)，LDH釋放量顯著降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+anti-miR-361-3p組HK-2細(xì)胞MDA含量、SOD活性顯著降低(P<0.05)，LDH釋放量顯著升高(P<0.05)；與HG+si-circ_0041795組比較，HG+si-circ_0041795+anti-miR-361-3p組HK-2細(xì)胞MDA含量、SOD活性顯著降低(P<0.05)，LDH釋放量顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 抑制miR-361-3p可逆轉(zhuǎn)沉默circ_0041795對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2氧化應(yīng)激的影響

3 討論

研究證實(shí)circRNA參與DN進(jìn)展的多個(gè)生物學(xué)過程。circ_15698在DN小鼠和小鼠系膜細(xì)胞中高表達(dá)，其通過與miR-185相互作用增加轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1蛋白水平，促進(jìn)纖維化相關(guān)蛋白合成[9]。circRNA低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(circLRP6)調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積累和炎性反應(yīng)[10]。circ_0003928通過靶向miR-151-3p并上調(diào)Anxa2促進(jìn)糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)[11]。上述表明circRNA可能是DN治療的潛在治療靶標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)高糖刺激后HK-2細(xì)胞circ_0041795表達(dá)量顯著增加，提示circ_0041795高表達(dá)可能有助于DN進(jìn)展。功能分析表明，沉默circ_0041795表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率，抑制Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)。持續(xù)高血糖可增加活性氧的產(chǎn)生，當(dāng)超過機(jī)體內(nèi)源性抗氧化能力時(shí)，導(dǎo)致MDA產(chǎn)生、細(xì)胞損傷以及LDH釋放[12]。SOD是DN大鼠重要的抗氧化防御系統(tǒng)，與健康大鼠比較DN大鼠中SOD表達(dá)顯著減少[13]。因此，MDA、LDH和SOD是DN中氧化應(yīng)激損傷的生物標(biāo)志物。本研究中高糖刺激導(dǎo)致HK-2細(xì)胞、SOD活性降低，凋亡率、MDA水平、LDH釋放增加，表明高血糖促進(jìn)氧化應(yīng)激、加重腎小管上皮細(xì)胞損傷。沉默circ_0041795可增加HK-2細(xì)胞活力，抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，這與前期報(bào)道沉默circ_0041795可減輕高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷[6]一致。因此，靶向circ_0041795可能是治療DN小管上皮損傷的重要策略。

迄今為止，circRNA的最典型的調(diào)控方式是miRNA分子海綿作用。最近研究證實(shí)一些circRNA在DN中表達(dá)失調(diào)，并通過miRNA調(diào)控DN進(jìn)展，如circ_0080425在DN小鼠和高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞中上調(diào)，circ_0080425通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-24-3p促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖和纖維化，促進(jìn)DN進(jìn)展[14]。本研究中通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-361-3p是circ_0041795的下游靶點(diǎn)。目前已在宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌、阿爾茨海默病(AD)、糖尿病血管并發(fā)癥中發(fā)現(xiàn)了異常表達(dá)的miR-361-3p[15-17,7]。研究報(bào)道AD細(xì)胞模型中miR-361-3p下調(diào)，過表達(dá)miR-361-3p可抑制β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，抑制AD進(jìn)展[18]。本研究探討miR-361-3p在DN進(jìn)展中的作用，結(jié)果表明miR-361-3p在高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，這與其在高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的下調(diào)[7]相一致。功能分析證實(shí)，miR-361-3p過表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡和LDH釋放，提高細(xì)胞存活率、SOD活力，降低MDA水平和Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量。沉默circ_0041795后高糖誘導(dǎo)HK-2中miR-361-3p表達(dá)顯著升高，且過表達(dá)miR-361-3p與沉默circ_0041795對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用一致，提示circ_0041795可能靶向miR-361-3p調(diào)控高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷。此外，本研究顯示抑制circ_0041795表達(dá)則加劇高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷，并逆轉(zhuǎn)沉默circ_0041795對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷的影響，這進(jìn)一步證實(shí)沉默circ_0041795對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用是通過靶向上調(diào)miR-361-3p表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，沉默circ_0041795可通過抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡來(lái)抵抗高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞損傷，其機(jī)制與靶向上調(diào)miR-361-3p表達(dá)有關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)為治療DN提供了新的潛在有效靶點(diǎn)。