余敏 崔躍 黎鵬飛 謝丹 陳芬

心肌組織在短時(shí)間內(nèi)供血或供養(yǎng)不足容易引起心血管疾病的發(fā)生，如中風(fēng)、急性心肌梗死和缺血性心臟病等[1,2]。心肌缺血再灌注損傷可以促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷[3,4]，這也是急性心肌梗死患者病死率較高的原因[5]。miRNA在心血管疾病中異常表達(dá)，可以參與細(xì)胞的增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等生物學(xué)過(guò)程，進(jìn)而參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[6,7]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制NPHP3-AS1通過(guò)調(diào)控下調(diào)miR305p減緩缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖[8]。組蛋白去乙?；?(HDAC9)在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)水平升高，抑制HDAC9表達(dá)可以減緩缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎性損傷[9]。通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)預(yù)測(cè)miR-30a-5p和HDAC9可能存在結(jié)合互補(bǔ)位點(diǎn)，但筆者發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p是否調(diào)控HDAC9對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷尚不明確，本研究通過(guò)建立缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞H9c2模型，探討miR-30a-5p通過(guò)調(diào)控HDAC9對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-NC、miR-30a-5p、si-NC、si-HDAC9、pcDNA和HDAC9序列和引物均購(gòu)自上海吉瑪制藥公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；凋亡試劑盒、BCA試劑盒、ECL試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；HDAC9抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 心肌細(xì)胞H9c2復(fù)蘇后，在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃、飽和濕度為5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的心肌細(xì)胞H9c2，將細(xì)胞分組：對(duì)照組(Control組)：正常條件培養(yǎng)心肌細(xì)胞H9c2；缺氧復(fù)氧組(H/R組)：在培養(yǎng)箱內(nèi)設(shè)置95% N2、5% CO2進(jìn)行缺氧條件培養(yǎng)12 h，倒掉培養(yǎng)液，然后在培養(yǎng)箱為37℃、20% O2、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h，建立心肌細(xì)胞H9c2的缺氧復(fù)氧模型。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟將miR-NC、miR-30a-5p、si-NC、si-HDAC9、miR-30a-5p+pcDNA、miR-30a-5p+HDAC9轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞H9c2內(nèi)，6 h后進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理，分別記為H/R+miR-NC組、H/R+miR-30a-5p組、H/R+si-NC組、H/R+si-HDAC9組、H/R+miR-30a-5p+pcDNA組、H/R+miR-30a-5p+HDAC9組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-30a-5p和HDAC9 mRNA表達(dá) 收集各組生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的心肌細(xì)胞H9c2，加入Trizol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA，在分光光度計(jì)先檢測(cè)細(xì)胞濃度和純度，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟嚴(yán)格進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板按照熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，miR-30a-5p、HDAC9 mRNA分別以U6、GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)2-△△Ct法檢測(cè)miR-30a-5p和HDAC9 mRNA表達(dá)。

1.4 Western blot檢測(cè)HDAC9、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 收集各組心肌細(xì)胞H9c2，加入蛋白裂解液用于提取細(xì)胞的總蛋白，采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白的濃度，沸水變性處理細(xì)胞。取35 μg蛋白樣品上樣凝膠電泳處理，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，用脫脂奶粉封閉處理，將膜轉(zhuǎn)移至一抗溶液內(nèi)，4℃過(guò)夜孵育，加入相應(yīng)二抗溶液，室溫孵育，按照ECL試劑盒說(shuō)明書(shū)，顯影曝光，通過(guò)Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的表達(dá)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組心肌細(xì)胞H9c2，3 000 r/min離心5 min，離心后在培養(yǎng)內(nèi)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。在各組細(xì)胞內(nèi)加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后繼續(xù)加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，嚴(yán)格按照凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)，避光反應(yīng)10 min后，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6 ELISA檢測(cè)SOD活性、MDA含量和LDH含量 取各組心肌細(xì)胞H9c2，離心后上清液，用于檢測(cè)SOD活性、MDA含量和LDH含量。具體操作步驟嚴(yán)格按照SOD、MDA和LDH檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-30a-5p和HDAC9靶向關(guān)系 通過(guò)Star Base預(yù)測(cè)顯示miR-30a-5p和HDAC9存在結(jié)合位點(diǎn)，然后構(gòu)建HDAC9 3’UTR的野生型載體(HDAC9 3’UTR-wt)和突變型載體(HDAC9 3’UTR-mut)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的心肌細(xì)胞H9c2，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)將HDAC9 3’UTR-wt和HDAC9 3’UTR-mut分別于miR-NC或miR-30a-5p轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞H9c2。最后按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-30a-5p和HDAC9在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2中的表達(dá) 與Control組比較，H/R組的心肌細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)顯著降低(P<0.05)，HDAC9 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 miR-30a-5p和HDAC9在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2中的表達(dá)

圖1 HDAC9在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2中的表達(dá)

2.2 過(guò)表達(dá)miR-30a-5p對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的影響 與Control組比較，H/R組的心肌細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)、Bcl-2蛋白表達(dá)和SOD活性均顯著降低(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA含量和LDH含量均顯著增加(P<0.05)；與H/R+miR-NC組比較，H/R+miR-30a-5p組的心肌細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)、Bcl-2蛋白表達(dá)和SOD活性均顯著增加(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA含量和LDH含量均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-30a-5p對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響；A 細(xì)胞凋亡率；B Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

表2 過(guò)表達(dá)miR-30a-5p對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的影響

2.3 miR-30a-5p調(diào)控HDAC9的表達(dá) 與miR-NC組比較，miR-30a-5p組中HDAC9 3’UTR-wt熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而HDAC9 3’UTR-mut熒光素酶活性沒(méi)有任何變化(P>0.05)。與anti-miR-N組比較，anti-miR-30a-5p組中miR-30a-5p表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-30a-5p組中HDAC9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-N組比較，anti-miR-30a-5p組中HDAC9蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表3、4。

圖3 miR-30a-5p調(diào)控HDAC9的表達(dá);A miR-30a-5p和HDAC9存在結(jié)合位點(diǎn)；B miR-30a-5p調(diào)控HDAC9的表達(dá)

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和anti-miR-30a-5p的轉(zhuǎn)染效率

2.4 干擾HDAC9對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡、氧化應(yīng)激的影響 與Control組比較，H/R組的心肌細(xì)胞中HDAC9蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA含量和LDH含量均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)和SOD活性均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與H/R+si-NC組比較，H/R+si-HDAC9組的心肌細(xì)胞中HDAC9蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA含量和LDH含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)和SOD活性均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表5。

表5 干擾HDAC9對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡、氧化應(yīng)激的影響

圖4 干擾HDAC9對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響;A 細(xì)胞凋亡率；B HDAC9、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

表4 miR-30a-5p調(diào)控HDAC9的表達(dá)

2.5 過(guò)表達(dá)HDAC9逆轉(zhuǎn)了miR-30a-5p對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的影響 與H/R+miR-NC組比較，H/R+miR-30a-5p組的心肌細(xì)胞中HDAC9蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA含量和LDH含量均顯著降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)和SOD活性均顯著增加(P<0.05)；與H/R+miR-30a-5p+pcDNA組比較，H/R+miR-30a-5p+HDAC9組的心肌細(xì)胞中HDAC9蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、MDA含量和LDH含量均顯著增加(P<0.05)；而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)和SOD活性均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖5，表6。

圖5 過(guò)表達(dá)HDAC9逆轉(zhuǎn)了miR-30a-5p對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響;A 細(xì)胞凋亡率；B HDAC9、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

表6 過(guò)表達(dá)HDAC9逆轉(zhuǎn)了miR-30a-5p對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的影響

3 討論

微小RNA(miRNA)在心血管疾病中研究作用已經(jīng)獲得大量研究的認(rèn)可，而且miRNA在心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等研究過(guò)程中也備受關(guān)注[10]，其中miR-143、miR-519d-3p和miR-27a-3p等已被證明[11-13]。Liu等[14]研究結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞后，miRNA-15b表達(dá)顯著增加，過(guò)表達(dá)miRNA-15b明顯促進(jìn)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡，這與本研究結(jié)果相反。Yang等[15]研究結(jié)果顯示，miR-22在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中低表達(dá)，miR-22通過(guò)調(diào)控CBP/AP-1途徑減緩缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎性損傷，進(jìn)而起到保護(hù)心臟的作用。在急性心肌梗死構(gòu)建的缺氧模型中發(fā)現(xiàn)，miR-483-5p在缺氧誘導(dǎo)人心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-483-5p明顯促進(jìn)了缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，這與本研究結(jié)果相反[16]。miR-499-5p在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-499-5p明顯抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[17]，這與本研究結(jié)果相似。miR-30a-5p報(bào)道參與可腎臟損傷、心肌缺血和再灌注損傷模型[18,19]。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)建立缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2模型，缺氧處理后明顯降低心肌細(xì)胞明顯促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激水平，以及上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)；進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，miR-30a-5p在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-30a-5p明顯抑制心肌細(xì)胞H9c2的凋亡和氧化應(yīng)激水平，以及下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，這說(shuō)miR-30a-5p參與了缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c的氧化應(yīng)激損傷的作用。

HDAC9是HDACs家族成員的轉(zhuǎn)錄因子之一，位于7號(hào)染色體q21.1位置上，與酵母HAD-I樣酶具有高度的同源性，主要存在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中[20,21]。HDAC9在多種癌癥中發(fā)揮著重要作用，且在動(dòng)脈粥樣硬化和冠狀動(dòng)脈中高表達(dá)[22,23]。研究結(jié)果顯示，HDAC9在缺血再灌注損傷模型中高表達(dá)，與缺血性腦卒中密切相關(guān)[24]。Shi等[25]研究發(fā)現(xiàn)，HDAC9在大鼠腦缺血/再灌注表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)染慢病毒HDAC9降低了腦部中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)；沉默HDAC9明顯抑制了OGD誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和凋亡。本研究結(jié)果顯示，HDAC9 mRNA和蛋白表達(dá)在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2中高表達(dá)，干擾HDAC9明顯抑制心肌細(xì)胞H9c2的凋亡和氧化應(yīng)激水平，以及下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)；通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，miR-30a-5p可以靶向調(diào)控HDAC9表達(dá)，過(guò)表達(dá)HDAC9逆轉(zhuǎn)了miR-30a-5p對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的作用，這說(shuō)明miR-30a-5p通過(guò)靶向調(diào)控HDAC9抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激水平，對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，過(guò)表達(dá)miR-30a-5p可以減緩缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激水平，其作用機(jī)制可能與HDAC9有關(guān)，起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。