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        可視化高通量檢測(cè)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的方法

        2022-04-26 09:48:06高博馮旭東李春
        化工進(jìn)展 2022年4期
        關(guān)鍵詞:天冬氨酸高通量光度

        高博,馮旭東,李春,2

        (1 北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,北京 100081;2 清華大學(xué)化學(xué)工程系,北京 100084)

        天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(ATCase,EC 2.1.3.2)催化L-天冬氨酸(L-Asp)和氨甲酰磷酸(CP)合成-氨甲?;?L-天冬氨酸(-CP-L-Asp),是嘧啶生物合成途徑的第一個(gè)酶。大腸桿菌來(lái)源的ATCase 是其中研究最多的酶,該酶是十二聚體,由兩個(gè)三聚體催化亞基(c)和三個(gè)二聚體調(diào)節(jié)亞基(r)組成。每個(gè)催化亞基存在兩個(gè)底物的結(jié)合域:Asp 結(jié)構(gòu)域和CP 結(jié)構(gòu)域。當(dāng)L-Asp 和CP 與酶的催化亞基結(jié)合時(shí),酶發(fā)生變構(gòu)并使兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間距離縮短,進(jìn)而引發(fā)L-Asp 的氨基對(duì)CP 的羰基碳進(jìn)攻,發(fā)生轉(zhuǎn)氨甲?;磻?yīng)。此外,ATCase的活性還受到嘌呤和嘧啶代謝途徑產(chǎn)物的影響,三磷酸胞苷(CTP)和三磷酸腺苷(ATP)可以在ATCase 調(diào)節(jié)亞基的不同位點(diǎn)結(jié)合,并分別顯著抑制和促進(jìn)酶活。ATCase 的這一反饋調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要的生理功能,它在生物體內(nèi)控制嘌呤和嘧啶合成途徑的代謝平衡,在生命活動(dòng)中具有重要意義。

        體外活性檢測(cè)可以直觀研究ATCase 反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的影響。目前,檢測(cè)ATCase 活性最普遍的方法是Kantrowitz 等提出的分光光度計(jì)法,該方法中使用了兩個(gè)顯色試劑,即2,3-丁二酮肟和安替比林,將它們分別溶于酸溶液中并混合。將顯色劑加入反應(yīng)后的溶液,在黑暗條件下室溫靜置16h,再在45℃水浴中加熱并均勻光照30min,最后測(cè)定466nm 處的吸光度。盡管該方法與早期的pH 檢測(cè)法和同位素示蹤法相比,已經(jīng)很大程度地簡(jiǎn)化了操作要求并提高了檢測(cè)范圍,但仍然需要過(guò)夜反應(yīng),且需要通過(guò)水浴和均勻光照來(lái)穩(wěn)定顯色產(chǎn)物的吸光度,因此無(wú)法滿(mǎn)足高通量檢測(cè)的需求。曹飛等研究表明,對(duì)二甲氨基苯甲醛(PDAB)可以在酸性溶液中與-CP-L-Asp 發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生黃色物質(zhì),并且在438nm處的吸光度與-CP-L-Asp的濃度呈現(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系。因此,本研究使用PDAB 建立快速、簡(jiǎn)單和可視化的測(cè)定ATCase 活性的比色法,通過(guò)觀察加入PDAB 顯色劑后不同濃度的-氨甲?;?DL-天冬氨酸(-CP-DL-Asp)的顏色變化,并測(cè)定吸光度,確定該檢測(cè)方法的可行性;通過(guò)精密度實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該方法的精確度;通過(guò)檢測(cè)粗酶液和純酶液反應(yīng),驗(yàn)證該方法檢測(cè)ATCase 活性的準(zhǔn)確度;通過(guò)酶標(biāo)儀實(shí)驗(yàn),確定該檢測(cè)方法可以用于ATCase 的高通量檢測(cè)。本研究為ATCase 的酶學(xué)研究和分子改造提供了更加方便、高效的檢測(cè)方法。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        1.1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

        大腸桿菌DH5,BL21(DE3)以及DH5-pET28a 均為本實(shí)驗(yàn)室保存。原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a 通過(guò)天根生化科技公司的質(zhì)粒提取試劑盒獲得。LB 培養(yǎng)基:酵母膏5g,氯化鈉10g,蛋白胨10g,蒸餾水1000mL。

        1.1.2 試劑、儀器及軟件

        -氨甲酰基-DL-天冬氨酸(-CP-DL-Asp,純度95%)、L-天冬氨酸(純度98%),上海畢得醫(yī)藥;氨甲酰磷酸二鈉鹽(純度80%,在冷的50%乙醇中重結(jié)晶純化)、PDAB (純度98%),Sigma-Aldrich;2×mix 聚合酶,聚合美公司;2×fastmix 聚 合 酶,Trans 2K、Trans 2K Plus DNA marker,全式金公司;質(zhì)粒提取試劑盒,天根生化科技公司;膠回收試劑盒,Protein Ladder 26614,Thermofisher 公司;Gibson assembly master mix由實(shí)驗(yàn)室自制。

        PCR 儀,型號(hào)GE-TOUCH,杭州柏恒公司;電泳儀, 型號(hào)DYY-7C, 北京六一公司;Nanodrop,型號(hào)Nano-500,杭州奧盛公司;臺(tái)式搖床,型號(hào)ZQZY-CS9,知楚儀器公司;高速冷凍離心機(jī),型號(hào)J6-XP,貝克曼公司;高壓破碎儀,型號(hào)JN-3000,廣州聚能納米公司;AKTA 蛋白純化儀(型號(hào)AKTA purifer)和His Trap FF 預(yù)裝柱,GE Healthcare; 酶 標(biāo) 儀, 型 號(hào)infinite M200,TECAN 公司。引物設(shè)計(jì)和序列比對(duì)使用SnapGene軟件。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 目的基因的擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

        在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索大腸桿菌K12 MG1655中表達(dá)ATCase 的基因B 和I(在基因組中相鄰),將這兩個(gè)基因的序列在SnapGene中組合,并在其上下游設(shè)計(jì)引物P1、P2。在大腸桿菌DH5(大腸桿菌K12 系菌株)中擴(kuò)增出BI 基因。同時(shí),設(shè)計(jì)引物P3、P4,通過(guò)PCR 將pET28a 線(xiàn)性化。線(xiàn)性化的基因片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,并通過(guò)膠回收試劑盒回收。通過(guò)Gibson 組裝方法,將兩個(gè)片段構(gòu)建成含有Kan抗性標(biāo)記的重組質(zhì)粒。

        用于擴(kuò)增目的片段的引物序列如下:P1,5'-CTTGCGGCCGCACTCGAATGGCTAATCCGCTATAT CAG-3';P2,5'-GTGGTGGTGGTGGTGGTGATTGGC CAGCACCAC-3';P3,5'-CATAATGTGGTGCTGGCC AATCACCACCACCACCACCACTG-3';P4,5'-GATA TAGCGGATTAGCCATTCGAGTGCGGCCGCAAG-3'。

        PCR 體系:Nuclease-Free Water,22μL;2×fastmix,25μL;引物(10μmol/L),1μL;模板(質(zhì)?;蚓海?,1μL。PCR 條件:預(yù)變性,95℃,2min;變性,95℃,20s;退火,60℃,20s;延伸,72℃,2kb/min;完全延伸,72℃,8min。共30個(gè)循環(huán),最后存放于4℃冰箱。

        1.2.2 重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化

        將重組質(zhì)粒pET28a-ATCase 轉(zhuǎn)化至DH5中。在100μL DH5感 受 態(tài) 中 加 入10μL Gibson 組裝的質(zhì)粒,冰上孵育30min,42℃熱擊60s,冰上孵育5min,加入600μL LB 液體培養(yǎng)基,37℃、200r/min 搖床中復(fù)蘇1h。菌液在5000r/min離心3min,并全部涂布于含有卡那霉素的LB 平板上,放于37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜。挑取單克隆,使用T7 引物進(jìn)行菌落PCR 鑒定,將陽(yáng)性克隆挑入含有卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基。使用天根生化科技公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取出重組質(zhì)粒,并送金唯智公司測(cè)序。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)中,用于表達(dá)目的蛋白。

        1.2.3 目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

        將轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的BL21(DE3)菌液接種于400mL 含有卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中,37℃、200r/min 培 養(yǎng) 至OD=0.6 左 右,加 入0.1mmol/L 的IPTG,16℃誘導(dǎo)20h。使用高速冷凍離心機(jī)收集菌體,用20mL 的50mmol/L 的Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸,高壓破碎,取上清液,在AKTA 蛋白純化儀中用含0.5mol/L 咪唑的緩沖液洗脫,獲得純酶,并通過(guò)SDS-PAGE 驗(yàn)證。通過(guò)ATCase 的 吸 光 系 數(shù),=0.59cm2/mg 計(jì) 算 純 酶濃度。

        1.2.4 ATCase活性的測(cè)定

        酶活反應(yīng)體系如下:5mmol/L 的L-Asp,5mmol/L 的CP,ATCase 純酶液(濃度為6nmol/L),加入緩沖液補(bǔ)足至0.5mL,與25℃水浴中反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后加入0.5mL 的10% PDAB 顯色液(溶于2.4mol/L HCl 溶液中),避光靜置15min。使用Nanodrop 檢測(cè)438nm 的吸光度。定義每分鐘催化生成1μmol-CP-L-Asp 為1 個(gè)酶活力單位(U),酶的比活力為酶活力除以蛋白質(zhì)的質(zhì)量。

        粗酶酶活驗(yàn)證:在反應(yīng)體系中,分別加入10μL、20μL、30μL、50μL ATCase 粗酶液替代純酶液,其他條件不變。由于BL21(DE3)自身也表達(dá)ATCase,因此構(gòu)建了含有pET28a 質(zhì)粒的菌株作為對(duì)照。

        高通量檢測(cè):配置0~5mmol/L 的-CP-DLAsp 溶液和純酶反應(yīng)體系各0.5mL,加入顯色液反應(yīng)后用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

        將pET28a線(xiàn)性化片段和擴(kuò)增得到的BI片段進(jìn)行Gibson組裝,將組裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5中,挑單菌落,使用T7 引物進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證,結(jié)果如圖1。

        圖1 重組質(zhì)粒的菌落PCR驗(yàn)證

        T7 引物是pET28a 上的特異性引物,因此菌落PCR 驗(yàn)證結(jié)果表明,目的基因已經(jīng)被構(gòu)建到載體上。將陽(yáng)性菌落挑入液體培養(yǎng)基,通過(guò)質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒并送金唯智公司測(cè)序和比對(duì),確認(rèn)目的基因被成功構(gòu)建到載體上,重組質(zhì)粒命名為pET28a-ATCase。

        2.2 ATCase的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

        將轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株接種于液體培養(yǎng)基中,在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段加入IPTG,16℃下過(guò)夜誘導(dǎo),收集菌體并用高壓破碎儀破碎。在AKTA 蛋白純化儀中,將含有ATCase 的上清液用His Trap FF預(yù)裝柱吸附,分別用含有0.5mol/L和1mol/L咪唑的Tris-HCl緩沖液洗脫,結(jié)果如圖2。

        圖2 ATCase的SDS-PAGE驗(yàn)證

        ATCase 是十二聚體,因此重組蛋白含有12 個(gè)His標(biāo)簽,與His Trap FF預(yù)裝柱的結(jié)合能力強(qiáng),需要使用較高濃度的咪唑洗脫。SDS-PAGE的結(jié)果顯示,兩個(gè)梯度的洗脫液中均含有ATCase 的催化亞基(34kDa)和調(diào)節(jié)亞基(17kDa),表明蛋白的純化成功。使用100kDa 的超濾濃縮管濃縮洗脫液,除去咪唑并將緩沖液替換為含有20%甘油的緩沖液,通過(guò)Nanodrop測(cè)定A280計(jì)算酶的濃度,-80℃低溫保存酶液。

        2.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

        在Tris-HCl 緩沖液中,加入-CP-DL-Asp,配置濃度為1~5mmol/L 的梯度溶液,按照體積比1∶1 加入10%PDAB 顯色液,室溫靜置15min。通過(guò)Nanodrop 測(cè)定438nm 的吸光度。將Tris-HCl 緩沖液作為對(duì)照,顯色反應(yīng)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖3所示。

        圖3 N-氨甲?;?DL-天冬氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

        由圖3 可以看出,隨著-CP-DL-Asp 濃度的升高,顯色反應(yīng)后的溶液呈更深的黃色,表明在該濃度范圍內(nèi),可以通過(guò)觀察顏色變化判斷-CPDL-Asp 的含量。通過(guò)紫外測(cè)定,得到的線(xiàn)性方程為=0.3467-0.0022,=0.9998,線(xiàn)性關(guān)系良好。為確定PDAB顯色法的檢測(cè)下限,通過(guò)梯度稀釋配置了濃度為0.5mmol/L、0.1mmol/L、0.05mmol/L、0.01mmol/L 的-CP-DL-Asp 溶液并進(jìn)行檢測(cè)。在濃度為0.1mmol/L時(shí),平均吸光度為0.036,與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的誤差較小,而當(dāng)濃度為0.05mmol/L時(shí),平均吸光度為0.025,與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的誤差較大,推測(cè)在此濃度下儀器的測(cè)量誤差對(duì)吸光度影響比較明顯。因此,PDAB顯色法的檢測(cè)范圍為0.1~5mmol/L。根據(jù)文獻(xiàn),ATCase 對(duì)CP 的飽和濃度為4.8mmol/L,因此PDAB顯色法可以滿(mǎn)足ATCase酶活測(cè)定的要求。

        2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

        為保證顯色反應(yīng)的可重復(fù)性,配置濃度為2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L 的-CP-DL-Asp 溶液各6組,加入顯色劑反應(yīng)后測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品測(cè)定3次吸光度,取平均值。將6組樣品測(cè)定結(jié)果取平均值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。

        表1 精密度測(cè)定結(jié)果

        由表1 可得,PDAB 顯色反應(yīng)的精密度RSD 為0.87%~1.52%,表明檢測(cè)結(jié)果精確度高。

        2.5 加標(biāo)回收率的測(cè)定

        選擇-CP-DL-Asp 濃度為1mmol/L 的溶液,加入-CP-DL-Asp 標(biāo)準(zhǔn)品使溶液濃度分別提高至2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L。加入顯色劑反應(yīng),測(cè)定吸光度,并根據(jù)圖3 中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算回收率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

        表2 加標(biāo)回收率的測(cè)定

        由表2 可得,在檢測(cè)范圍內(nèi)進(jìn)行加標(biāo)回收時(shí),PDAB 顯色法具有良好的回收率,結(jié)果為96.6%~101.9%,準(zhǔn)確度較高。

        2.6 使用PDAB顯色法測(cè)定ATCase的活性

        根據(jù)1.2.4 節(jié)的方法進(jìn)行ATCase 活性的測(cè)定,為證明該顯色法測(cè)定ATCase 活性的高效性,首先使用粗酶液進(jìn)行顯色反應(yīng),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 和表3所示。

        圖4 粗酶液顯色反應(yīng)

        表3 粗酶液顯色反應(yīng)的紫外吸收

        圖4 表明,PDAB 顯色法可用于定性檢測(cè)ATCase 粗酶液的酶活。對(duì)照組顯色結(jié)果表明,PDAB酸性顯色液與大腸桿菌裂解液中的某些物質(zhì)也會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng),顏色呈淡粉紅色,同時(shí)還會(huì)與其他某些物質(zhì)反應(yīng),產(chǎn)生沉淀。當(dāng)加入粗酶液的體積大于20μL 時(shí),能觀察到顯色液有渾濁。當(dāng)加入含有ATCase 的粗酶液時(shí),除了-CP-L-Asp 發(fā)生反應(yīng)呈黃色以外,上述兩個(gè)反應(yīng)也會(huì)同時(shí)發(fā)生,隨著加入粗酶液體積的增加,出現(xiàn)的沉淀明顯增多,但是-CP-L-Asp和粉紅色的顯色反應(yīng)沒(méi)有明顯增加,表明粗酶液與PDAB顯色液發(fā)生沉淀的反應(yīng)更優(yōu)先。再根據(jù)表3 發(fā)現(xiàn),粗酶液體積的增加對(duì)438nm的吸光度幾乎沒(méi)有影響,這表明沉淀的出現(xiàn)影響了PDAB 與-CP-L-Asp 的顯色。當(dāng)加入粗酶液體積為小于10μL 時(shí),能更好地觀察到顯色反應(yīng)的發(fā)生。粗酶液顯色反應(yīng)的結(jié)果表明,PDAB顯色法可以用于高通量定性檢測(cè)ATCase 的活性且不需要復(fù)雜耗時(shí)的蛋白純化操作。

        進(jìn)一步使用PDAB 顯色法測(cè)定ATCase 純酶的比活性。根據(jù)1.2.4節(jié)的方法進(jìn)行ATCase 純酶活性的測(cè)定。定義每分鐘催化生成1μmol-CP-L-Asp為1個(gè)酶活力單位(U),酶的比活力為酶活力除以蛋白質(zhì)的質(zhì)量,測(cè)定結(jié)果如表4。

        表4 PDAB顯色法測(cè)定ATCase純酶的比酶活

        由表4,通過(guò)PDAB 顯色法測(cè)定三個(gè)平行反應(yīng)的比酶活并取平均值,得到ATCase 的比酶活為56.83U/mg,RSD為2.60%,表明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確。

        2.7 使用酶標(biāo)儀高通量測(cè)定ATCase的活性

        為表明PDAB顯色法可用于高通量測(cè)定ATCase的活性,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)2.6 節(jié)中同一批純酶液反應(yīng)的樣品,并與Nanodrop 的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。配置0~5mmol/L 的-CP-DL-Asp 溶液,并根據(jù)1.2.4 節(jié)的方法,將每個(gè)樣品取三組平行測(cè)定。酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果如表5、表6。

        根據(jù)表5的結(jié)果,擬合酶標(biāo)儀測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為=0.0989+0.0555,=0.9931,線(xiàn)性關(guān)系較好。由表6 得到ATCase 的比酶活為57.61U/mg,RSD為4.91%,結(jié)果與分光光度計(jì)誤差很小,表明該方法可重復(fù)性較高。

        表5 酶標(biāo)儀測(cè)定的N-CP-DL-Asp的吸光度

        表6 酶標(biāo)儀測(cè)定ATCase純酶的比酶活

        表7列出本文構(gòu)建的PDAB檢測(cè)法與Kantrowitz等的傳統(tǒng)方法的對(duì)比。

        表7 兩種檢測(cè)方法的對(duì)比

        盡管與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比,本文建立的PDAB檢測(cè)法的靈敏度有所下降,但由于ATCase 可以在30min 內(nèi)生成濃度高達(dá)約3mmol/L 的產(chǎn)物,因此靈敏度對(duì)該方法的適用性沒(méi)有顯著影響。此外,PDAB檢測(cè)法在保持高精確度的同時(shí),大幅縮短反應(yīng)時(shí)間并明顯簡(jiǎn)化操作步驟,從而大幅提高測(cè)定效率,適用于高通量檢測(cè)ATCase的活性。

        3 結(jié)論

        本研究基于PDAB與-氨甲?;?天冬氨酸反應(yīng)生成黃色物質(zhì)的性質(zhì),建立了高效檢測(cè)ATCase活性的比色法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在0.1~5mmol/L 的濃度范圍內(nèi),PDAB 對(duì)-氨甲?;?DL-天冬氨酸顯色后,在438nm 的吸光度具有良好的線(xiàn)性關(guān)系,且精確度高,加標(biāo)回收準(zhǔn)確度高。將該顯色法用于測(cè)定ATCase 的活性時(shí),可以通過(guò)顏色的變化可視化地判斷反應(yīng)進(jìn)行的程度。對(duì)于粗酶液,該顯色法可以定性檢測(cè)酶促反應(yīng)是否發(fā)生,對(duì)于純酶液,該方法可用于定量檢測(cè)。通過(guò)分光光度計(jì)比色法測(cè)定ATCase 的比酶活,三組平行實(shí)驗(yàn)證明該方法的可重復(fù)性高。與傳統(tǒng)方法相比,該檢測(cè)法還具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),可以滿(mǎn)足高通量篩選ATCase的需求。

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