張 娜， 曹小勇,2*， 胡選萍,2， 秦公偉,2， 王思蘄， 趙 垚

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 漢中 723000)

蘭科植物自古以來便被賦予了不同的寓意和象征，擁有著高貴的品質(zhì)，散發(fā)著自然之美和人文之美[1]。作為種類最多、分布最廣的有花植物之一，蘭科植物的生態(tài)類型豐富，且多為珍稀瀕危植物，藥用、觀賞價(jià)值較高[2]。

蘭科植物資源再生及合理開發(fā)利用多采用種子共生萌發(fā)與非共生萌發(fā)，其中，非共生萌發(fā)應(yīng)用更為廣泛[2]。白及(Bletillastriata)[3]的非共生萌發(fā)研究表明，白及種胚膨大至突破種皮后形成原球莖，原球莖的頂端分化葉芽，基部生根形成幼苗[4]。千代蘭(Ascocenda‘FuchsGold’)[5]、西藏虎頭蘭(Cymbidiumtracyanum)[6]、蝴蝶蘭(Phalaenopsisaphrodite)[7]等植物種子非共生萌發(fā)的過程與白及相同。對建蘭(C.ensifolium)[3]的非共生萌發(fā)研究中發(fā)現(xiàn)，其種胚形成原球莖后進(jìn)行伸長生長，至根狀莖階段可持續(xù)增殖，根狀莖繼代培養(yǎng)形成芽后成苗[8]。墨蘭(C.sinense)[9]、春蘭(C.goeringii)[10]、寒蘭(C.kanran)[11]、大花蕙蘭(C.hybrid)[12]等蘭科植物種子非共生萌發(fā)的過程與建蘭的相同。蘭科植物種子非共生萌發(fā)除白及和建蘭的萌發(fā)成苗模式外，是否還存在與上述二者差異的形式，目前尚未見報(bào)道。

本課題組在對杜鵑蘭(Cremastraappendiculata)種子非共生萌發(fā)研究中，發(fā)現(xiàn)其萌發(fā)過程與白及、建蘭不同。本文通過對白及、杜鵑蘭、建蘭3種蘭科植物非共生萌發(fā)成苗過程比較觀察，展示3種蘭科植物種子非共生萌發(fā)成苗的差異，為蘭科植物非共生萌發(fā)研究提供參考。

1 試驗(yàn)

1.1 材料

非共生萌發(fā)培養(yǎng)材料：采集白及、建蘭、杜鵑蘭成熟未開裂蒴果分別置于廣口瓶內(nèi)，自來水沖洗3～4次后，置SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺(tái)上使用體積分?jǐn)?shù)75%酒精和質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%次氯酸鈉溶液對蒴果消毒，無菌水沖洗3～4次，取出置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)切除蒴果兩端，劃開側(cè)面，用鑷子夾取蒴果，將種子抖入無菌玻璃瓶內(nèi)。晾干后存儲(chǔ)于4 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

白及種子(2021年1月播種，2021年2月成苗，培養(yǎng)50 d)：1/2MS固體培養(yǎng)基；杜鵑蘭種子(2020年10月播種，2021年4月成苗，培養(yǎng)6個(gè)月)：1/2MS+2 g/L水解酪蛋白+0.5 mg/L NAA液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至多數(shù)產(chǎn)生分支后移入配制相同的固體培養(yǎng)基內(nèi)；建蘭種子(2019年10月播種，2021年5月成苗，培養(yǎng)19個(gè)月)：種子萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2MS固體培養(yǎng)基，根狀莖分化培養(yǎng)基為1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA固體培養(yǎng)基。

培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照時(shí)間12 h/d，靜置培養(yǎng)。白及光照培養(yǎng)，光照2500～3000 lx；杜鵑蘭弱光培養(yǎng)，光照500～1000 lx；建蘭種子萌發(fā)前暗培養(yǎng)，萌發(fā)后(140 d)移至光下培養(yǎng)，光照2500～3000 lx。

1.2.2 觀察記錄

Nikon SMZ800體視顯微鏡定期觀察白及、杜鵑蘭、建蘭種子的非共生萌發(fā)生長情況。觀察白及時(shí)，未形成原球莖前可隔瓶身觀察，形成原球莖后，需每次選20個(gè)樣本挑出至培養(yǎng)皿后，在體視顯微鏡下觀察；杜鵑蘭與建蘭在形成根狀莖后，不同生長階段各選20個(gè)樣本挑出觀察。圖像采集使用Leica M205C體視顯微鏡。

2 結(jié)果觀察

2.1 白及非共生萌發(fā)成苗

培養(yǎng)7 d，大多數(shù)種子種胚膨大，變綠，種胚突破種皮，形成原球莖(圖1-A)，原球莖呈卵圓形，綠色均勻。培養(yǎng)15 d，原球莖頂端生長出葉片(圖1-B)，基部形成簇狀假根，均勻分布。培養(yǎng)約30 d，原球莖基部分化出不定根(圖1-C)。培養(yǎng)50 d,形成三葉兩根幼苗(圖1-D)。

圖1 白及非共生萌發(fā)成苗過程

2.2 杜鵑蘭非共生萌發(fā)成苗

培養(yǎng)約20 d，種胚膨大至突破種皮(圖2-A)。培養(yǎng)30 d，形成原球莖，出現(xiàn)假根。培養(yǎng)約60 d,形成根狀莖(圖2-B)，少數(shù)根狀莖形成分支，一些呈綠色，頂端鱗片無色。根狀莖生長過程中會(huì)彎曲，形成背腹面，假根在背面較多，腹面較少。培養(yǎng)約90 d，出現(xiàn)褐變，根狀莖產(chǎn)生多級分支，次級分支頂端形成休眠芽(圖2-C，上面箭頭)。培養(yǎng)約130 d，根狀莖頂端產(chǎn)生葉片。培養(yǎng)180 d，著生葉片的部位分化出根，形成幼苗(圖2-D)。培養(yǎng)240 d，形成假鱗莖。杜鵑蘭根狀莖大多為水平生長，不伸入培養(yǎng)基內(nèi)部。根狀莖也存在不產(chǎn)生分支的情況，根狀莖伸長，產(chǎn)生多枚鱗片后，頂端出現(xiàn)葉片分化成苗。

圖2 杜鵑蘭非共生萌發(fā)成苗過程

杜鵑蘭種子非共生萌發(fā)過程與白及不同。白及非共生萌發(fā)成苗過程為種胚膨大至突破種皮，形成原球莖，原球莖上端形成葉片，隨后形成根直接成苗。杜鵑蘭原球莖形成后，伸長生長形成根狀莖，頂端分化出葉芽，葉基部長出根發(fā)育成苗。白及非共生萌發(fā)各階段整齊度高，杜鵑蘭整齊度較低。

2.3 建蘭非共生萌發(fā)成苗

種子在萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)約140 d，種胚膨大突破種皮，形成無色的原球莖(圖3-A)。培養(yǎng)約250 d形成基部為綠色根狀莖(圖3-B)。根狀莖持續(xù)分支，呈現(xiàn)明顯向地性，頂端沒有芽的分化，培養(yǎng)450 d形成大量鮮綠色分支(圖3-C)。根狀莖頂端呈錐狀，具鱗片，下側(cè)是大量簇狀假根(圖3-D)。當(dāng)根狀莖轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)60 d，根狀莖頂端膨大，形成由數(shù)枚光滑覆瓦狀鱗片包裹的芽(圖3-E)。培養(yǎng)約120 d形成具有葉和根的幼苗(圖3-F)。圖3-E中箭頭指示部位表示根狀莖分化，圖3-F中箭頭指示根的位置。

圖3 建蘭非共生萌發(fā)成苗過程

杜鵑蘭原球莖形成根狀莖后僅進(jìn)行有限分支即可分化成苗，分支期間會(huì)形成休眠芽且大多水平分布于培養(yǎng)基表面。建蘭原球莖形成根狀莖后，持續(xù)產(chǎn)生分支增殖，改變培養(yǎng)基激素后才可進(jìn)入分化階段，且其根狀莖有明顯向地性。

3 分析與討論

大多數(shù)蘭科植物的非共生萌發(fā)培養(yǎng)過程與白及相同，如千代蘭(Ascocenda‘FuchsGold’)[5]、西藏虎頭蘭(C.tracyanum)[6]、扇形文心蘭(Psygmorchispusilla)[13]、蝴蝶蘭(Phalaenopsisaphrodite)[7]、鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)[14]、小葉兜蘭(Paphiopedilumbarbigerum)[3]、卡特蘭(Cattleyahybrida)[3]、大花君子蘭(Cliviaminiata)[3]、金邊龍舌蘭(Agaveamericana‘Variegata’Nichols)[15]、樹蘭(EpidendreaeHumb)[16]、鶴望蘭(Strelitziareginae)[17]等。3種成苗模式的蘭科植物如圖4所示。

圖4 3種成苗模式的蘭科植物

扇形文心蘭種子非共生萌發(fā)種胚一端產(chǎn)生芽，隨后產(chǎn)生多枚葉片，形成根(圖4-A)[13]。蝴蝶蘭原球莖頂端存在生長點(diǎn)，根由原球莖下部分化產(chǎn)生，且其原球莖增殖產(chǎn)生大量原球莖，或直接分化成苗(圖4-B)[7,18]，故白及是絕大多數(shù)蘭科植物種子萌發(fā)成苗的模式。

與建蘭非共生萌發(fā)過程相同的蘭科植物有墨蘭(C.sinense)[9]、春蘭(C.goeringii)[10]、寒蘭(C.kanran)[11]、大花蕙蘭(C.hybrid)[12]、蕙蘭(C.faberi)[19]、蓮瓣蘭(C.tortisepalum)[20]等。墨蘭根狀莖持續(xù)增殖最合適的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基(圖4-C)[9]；寒蘭根狀莖在分化培養(yǎng)基中頂端分生組織分化出芽(圖4-D)[11]。建蘭類的成苗模式中存在根狀莖持續(xù)增殖階段，需改變培養(yǎng)基激素才能分化成苗。

與杜鵑蘭相同的蘭科植物有黃花火燒蘭(Epipactisflava)[21]、多花指甲蘭(Aeridesrosea)[22]、巨蘭(Grammatophyllumspeciosum)[23]、山蘭(Oreorchispatens)[24]、地寶蘭(Geodorumdensiflorum)[25]等。E.flava的體外繁殖研究中展示了其成苗模式圖，與杜鵑蘭的相似，存在休眠芽，呈現(xiàn)顯著頂端優(yōu)勢(圖4-E)[21]；地寶蘭根狀莖水平生長，只進(jìn)行有限分支后便可成苗(圖4-F)[25]。杜鵑蘭根狀莖大多水平分布在培養(yǎng)基表面，但當(dāng)培養(yǎng)基中萘乙酸濃度呈倍數(shù)高于6-BA濃度時(shí)，其根狀莖也存在伸入培養(yǎng)基內(nèi)部的情況，故激素可能會(huì)影響植物的形態(tài)發(fā)生。建蘭持續(xù)增殖根狀莖與分化根狀莖，杜鵑蘭根狀莖上的休眠芽與繼續(xù)生長的分支，除外部形態(tài)存在差別外，內(nèi)部結(jié)構(gòu)也可能存在差異，可制作石蠟切片觀察。

蘭科作為被子植物第三大科[2]，種子萌發(fā)過程可能存在更多類型。現(xiàn)有資料中還存在兩種特別的類型：鬼蘭(Dendrophylaxlindenii)種子發(fā)育成個(gè)體的過程沒有葉的分化，光合作用器官為根(圖5-A)[26]；天麻(Gastrodiaelata)種子萌發(fā)形成個(gè)體的過程沒有根和葉的分化，植株只具莖和花(圖5-B)[3]。圖5-A中箭頭指示為根[26]；圖5-B中上側(cè)箭頭指示花序，下側(cè)箭頭指示塊莖。二者種子萌發(fā)產(chǎn)生的個(gè)體形態(tài)與本文描述的3種模式存在差異，也可據(jù)此作為兩種“成苗”模式，但廣義的成苗過程包括葉與根的發(fā)生[27]，上述二者可能不符合廣義的成苗模式。

圖5 兩種蘭科植物

綜上所述，本文將蘭科植物種子離體培養(yǎng)成苗區(qū)分為3種模式(白及、杜鵑蘭、建蘭)，白及是絕大多數(shù)蘭科種子萌發(fā)成苗的模式。在蘭科植物的非共生萌發(fā)研究中，培養(yǎng)早期就可根據(jù)這3種成苗模式，確定該材料后續(xù)培養(yǎng)方案。另外，原球莖或根狀莖的增殖有利于優(yōu)良品種的高效工廠化生產(chǎn)和蘭科植物快速繁殖技術(shù)的發(fā)展。白及模式的原球莖和杜鵑蘭模式的根狀莖增殖與芽分化均可同時(shí)進(jìn)行，建蘭模式根狀莖的持續(xù)增殖特點(diǎn)可提供大量根狀莖，分瓶轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基上便可大規(guī)模生產(chǎn)幼苗。