賀喬喬， 周希希， 鄭世茂， 張曉娟， 張 羽

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000)

蕓薹屬植物的3個基本二倍體組物種包括白菜Brassicarapa(AA，X=10，2n=20)、黑芥菜B.nigra(BB，X=8，2n=16)和甘藍(lán)B.Oleracea(CC，X=9，2n=18)，其中白菜組在演化過程中最原始，芥菜組較進(jìn)化，甘藍(lán)組為最近分化出來的物種，進(jìn)化程度相對最高。甘藍(lán)型油菜大約在7500年前由白菜和甘藍(lán)自然雜交形成，是非常“年輕”的多倍體植物，其基因組為AACC(2n=38)。菌核病是甘藍(lán)型油菜三大病害(菌核病、霜霉病、病毒病)之首，是由真菌核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)de Bary)侵染引起的一種嚴(yán)重危害油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的廣譜性病害，抗菌核病油菜育種是油菜育種的重要目標(biāo)，抗源篩選對抗病育種非常重要。研究表明，甘藍(lán)型油菜比白菜型油菜對菌核病的抗性強[1]。目前，抗菌核病油菜分子標(biāo)記輔助育種還未在實踐中應(yīng)用，在大豆中首次報道P5CR(pyrroline-5-carboxylate reductase，吡咯林-5-羧酸還原酶)基因與菌核病抗性強關(guān)聯(lián)[2]，在油菜中關(guān)于P5CR基因方面的研究還未見報道。P5CR是真核生物中存在的一種重要管家蛋白，催化鳥氨酸、精氨酸和谷氨酸途徑的中間代謝產(chǎn)物P5C(Δ1-pyrroline-5-carboxylate，吡咯啉-5-羧酸)成為脯氨酸，是脯氨酸生物合成的最后一個酶。植物中，脯氨酸參與了蛋白質(zhì)與細(xì)胞壁的合成，在植物抗?jié)B透脅迫調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用。大量研究表明，在高鹽和干旱脅迫下，植物體內(nèi)脯氨酸積累較多，同時涉及脯氨酸生物合成的相關(guān)基因表達(dá)變化較明顯[3-9]。P5C能夠產(chǎn)生活性氧而導(dǎo)致或促進(jìn)細(xì)胞凋亡，研究表明如果把擬南芥中的P5CR基因敲除會導(dǎo)致植株胚胎死亡[10]，而脯氨酸恰好相反，是生物體內(nèi)一種重要的非酶類抗氧化劑，對抗細(xì)胞凋亡起著重要的作用，并且對細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電位也有一定的影響，這種氧化還原悖論與動物的能量代謝及人類許多疾病也有關(guān)[11-15]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用殺蟲劑三唑磷對雌性褐飛虱用藥第3天后，雌性褐飛虱轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的6個候選基因中包括P5CR[16]，說明P5CR在動物中與抗逆性也相關(guān)。通過已經(jīng)報道的在植物中克隆的P5CR基因分析表明，不同物種中的P5CR基因結(jié)構(gòu)有較大區(qū)別[17]。隨著全基因組分析技術(shù)的發(fā)展和蕓薹屬基因組數(shù)據(jù)的公布，研究發(fā)現(xiàn)同一屬內(nèi)某個基因家族中的每個基因也可能各自具有不同的表達(dá)調(diào)控模式[18]，對某個基因家族內(nèi)每個基因的生物信息學(xué)分析比較，可以為家族內(nèi)具體基因的深入研究提供選擇參考。

1 方法

1.1 蕓薹屬AC亞基因組中P5CR基因家族鑒定

為了準(zhǔn)確而全面地鑒定到蕓薹屬3個基本物種的P5CR基因，使用：(1)利用擬南芥(http：//www.arabidopsis.org/)P5CR基因(AT5G14800.1)的CDS編碼序列(Coding sequence)作為種子序列，在蕓薹屬數(shù)據(jù)庫(https：//brassicadb.org/)對白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜基因組CDS序列進(jìn)行Blastn同源比對(Evalue=0)；(2)用擬南芥的P5CR蛋白序列作為種子序列在Pfam數(shù)據(jù)庫(http：//pfam.xfam.org/)中獲得P5CR結(jié)構(gòu)特征域的HMM profile文件，對白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜基因組的蛋白序列進(jìn)行Blastp同源搜索(Evalue=10-37)。用以上兩種方法獲得的同源序列再使用SMART軟件(http：//smart.emblheidelberg.de/)進(jìn)一步鑒定蕓薹屬AC亞基因組中的P5CR候選基因。

1.2 P5CR基因家族啟動子區(qū)域順式作用元件分析

為了進(jìn)一步研究蕓薹屬AC亞基因組中P5CR基因家族功能，綜合分析后決定從蕓薹屬基因組數(shù)據(jù)文件中提取P5CR基因上游2000 bp區(qū)域作為啟動子序列[19]，利用在線軟件Plant CARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)[20]分析脅迫響應(yīng)、激素響應(yīng)、光響應(yīng)和植物生長發(fā)育等順式作用元件，并用R語言中g(shù)gplot2作圖。

1.3 P5CR基因家族的理化性質(zhì)分析

采用在線軟件ProtParam(https：//web.expasy.org/protparam/)[21]預(yù)測P5CR基因家族蛋白質(zhì)的理論分子量(molecular weight，Mw)、等電點(theoretical，pI)、GRAVY(grand average of hydropathy)等。NetPhos3.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)[22]分析蛋白質(zhì)磷酸化。

1.4 P5CR基因家族的系統(tǒng)發(fā)育與同線性分析

用MEGA11(https：//www.megasoftware.net/index.php)[23]進(jìn)行UPGMA法構(gòu)建CesA蛋白進(jìn)化樹，Bootstrap檢驗(重復(fù)次數(shù)500)。利用在線軟件Syntenic(http：//brassicadb.org/brad/searchSynteny.php)進(jìn)行P5CR基因家族同線性分析，基因密度大的為LF，次之的為MF1，最小的為MF2。

1.5 P5CR基因家族二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與磷酸化位點分析

使用在線軟件Swiss_Model(https：//www.expasy.org/structural_bioinformatics)[24]分析P5CR二級結(jié)構(gòu)。

通過Pfam分析，將候選基因匹配的P5CR結(jié)構(gòu)域區(qū)段提取出來。利用Clustal Omega進(jìn)行序列比對，并利用在線工具WebLogo3(http：//weblogo.threeplusone.com/create.cgi)[25]繪制出結(jié)構(gòu)域logo圖，調(diào)查結(jié)構(gòu)域序列特征及其保守氨基酸出現(xiàn)情況。

采用在線軟件MEME(http：//meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)[26]分析P5CR基因家族蛋白質(zhì)序列中特征性motif，并利用Weblogo3繪制出logo圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕓薹屬P5CR基因鑒定

蕓薹屬AC亞基因組P5CR基因家族鑒定結(jié)果(見表1)表明，在白菜基因組中獲得兩條序列，位于A03和A10染色體上，分別命名為Bra006270和Bra008735；在甘藍(lán)基因組中獲得兩條序列，位于C03和C09染色體上，分別命名為Bol034305和Bol030409。在甘藍(lán)型油菜A亞基因組中獲得兩條序列，位于A03和A10染色體上，分別命名為GSBRNA2T00130008001和GSBRNA2T00135564001；C亞基因組中獲得兩條序列，位于C03和C09染色體上，分別命名為GSBRNA2T00140419001和GSBRNA2T00031643001。蕓薹屬AC亞基因組中P5CR基因的CDS序列除Bra006270(1323 bp)外都為831 bp，且都有7個外顯子。

表1 蕓薹屬AC亞基因組中P5CR基因家族的基因信息

2.2 P5CR基因家族啟動子區(qū)域順式作用元件分析

順式作用元件分析如圖1所示，結(jié)果顯示除了甘藍(lán)型油菜A亞基因組上的P5CR基因(GSBRNA2T00135564001)沒有預(yù)測到核心啟動子/轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點外，其余P5CR基因都預(yù)測到順式作用元件，在所有預(yù)測到順式作用元件的P5CR基因家族啟動子序列中都發(fā)現(xiàn)了光響應(yīng)(CACGTT、GGTTAAT、ATTAAT)和茉莉酸甲酯的順式作用元件(CGTCA、TGACG)。其次為脫落酸(ACGTG)和缺氧響應(yīng)元件(AAACCA)。再次為赤霉素反應(yīng)元件(TCTGTTG、CCTTTTG、TATCCCA)，另外還有生長素(TGTCTC、TGACG)的順式作用元件、干旱響應(yīng)元件(CAACTG)、防御與應(yīng)激相關(guān)順式作用元件(如GAAAAA、GTTTTCTTAC、GTTAGTT和ATTCTCTAAC)和胚乳表達(dá)順式作用元件(TGAGTCA)。僅在Bol030409中發(fā)現(xiàn)參與低溫響應(yīng)元件(CCGAAA)。僅在GSBRNA2T00130008001中發(fā)現(xiàn)參與水楊酸元件(TCAGAAGAGG)。僅在Bra008735中發(fā)現(xiàn)參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)元件GATGA(C/T)(A/G)TG(A/G)、GTTGACGTGA。僅在Bra006270中發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控種子發(fā)育的作用元件CATGCATG。說明蕓薹屬AC亞基因組P5CR基因家族除參與光調(diào)控通路外，主要參與宿主的防御和逆境脅迫。

圖1 蕓薹屬AC亞基因組P5CR基因上游2000 bp啟動子元件

2.3 蕓薹屬AC亞基因組P5CR基因家族的系統(tǒng)發(fā)育與同線性分析

為進(jìn)一步探究蕓薹屬AC亞基因組P5CR基因家族成員在基因組間和基因組內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建擬南芥、白菜、甘藍(lán)及甘藍(lán)型油菜P5CR蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，結(jié)果顯示P5CR基因家族共形成3個分支。第I類有4個基因，包括Bol034305、GSBRNA2T00140419001、Bra006270和GSBRNA2T00130008001；第II類有2個基因，為Bra008735和GSBRNA2T00135564001；第III類有2個基因，為Bol030409和GSBRNA2T00031643001。親緣關(guān)系最近的為甘藍(lán)C亞基因組的Bol034305(Chr.03)與甘藍(lán)型油菜C亞基因組的GSBRNA2T00140419001(Chr.03)，為同一個基因，說明其在進(jìn)化過程中沒發(fā)生蛋白序列的改變。其次為白菜A亞基因組的Bra006270(Chr.A03)和甘藍(lán)型油菜A亞基因組的GSBRNA2T00130008001(Chr.A03)，白菜A亞基因組的Bra008735(Chr.A10)和甘藍(lán)型油菜A亞基因組的GSBRNA2T00135564001(A10)，甘藍(lán)C亞基因組的Bol030409(Chr.C09)和甘藍(lán)型油菜C亞基因組的GSBRNA2T00031643001(Chr.C09)。關(guān)系最遠(yuǎn)的為Bra006270和AT5G14800.1，說明擬南芥的P5CR基因最先和白菜組P5CR基因分開。

圖2 P5CR蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

由于蕓薹屬的3個二倍體基因組和擬南芥基因組來源于相同的二倍體原始基因組，通過對擬南芥、白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜的同線性分析(見表2)，結(jié)果表明，擬南芥P5CR(AT5G14800.1)在蕓薹屬白菜中有2個同源基因，甘藍(lán)中有2個同源基因，在甘藍(lán)型油菜中有4個，A、C亞基因組上各有2個，這些同源基因位于LF區(qū)或MF區(qū)。

表2 擬南芥P5CR基因在白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜共線性區(qū)的同源基因

2.4 P5CR家族基因蛋白理化性質(zhì)分析

利用在線軟件Plant-mPLoc(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)對蕓薹屬AC亞基因組中鑒定的P5CR蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)。使用ProtParam在線分析工具對P5CR蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析(見表3)，結(jié)果表明，蕓薹屬AC亞基因組中的白菜組P5CR蛋白均包含20種常見氨基酸。蛋白序列長度最長的為440個氨基酸(Bra006270)；其次為326個(Bol030409)，剩余全為276個。分子量最大的為47233.01(Bra006270)，最小為28624.09(Bra008735)；等電點(pI)最高為9.02(Bol030409)，最低為6.00(Bol034305、GSBRNA2T00140419001)；不穩(wěn)定性系數(shù)最大為37.77(Bra006270)，最小為34.58(Bol034305、GSBRNA2T00140419001)，8個P5CR均為穩(wěn)定蛋白(<40)；脂肪族氨基酸系數(shù)最大為98.59(AT5G14800.1)，最小為84.43(Bra006270)；帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)(Asp/Glu)最大值為43(Bra006270)，最小值為28(GSBRNA2T00031643001)，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)(Arg/Lys)最大值為43(Bra006270)，最小值為26(Bol034305、GSBRNA2T00140419001)。親疏水性分析發(fā)現(xiàn)肽鏈總體均表現(xiàn)為疏水性(正值)，疏水性系數(shù)最大為0.180(Bra008735)，最小為0.021(Bra006270)，可見這些P5CR蛋白雖然均表現(xiàn)為疏水性，但疏水性強弱差異較大。

表3 蕓薹屬AC亞基因組P5CR蛋白的理化性質(zhì)

從蕓薹屬AC亞基因組P5CR蛋白氨基酸組成(見圖3)可以看出，P5CR蛋白在氨基酸組成上差異很小，各種氨基酸的含量在P5CR蛋白之間的變化不大。Ala含量最高，其次為Val，表明P5CR蛋白由大量疏水性氨基酸殘基組成，使其表現(xiàn)出較強的疏水性。Cys在白菜組中含量很低，甘藍(lán)組和油菜組中不含半胱氨酸(Cys)。均不含有稀有氨基酸吡咯賴氨酸(Pyl)和硒代半胱氨酸(Sec)。

圖3 蕓薹屬AC亞基因組P5CR蛋白氨基酸組成

2.5 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與磷酸化位點分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是連接一級和高級結(jié)構(gòu)的重要紐帶和橋梁，它為高級結(jié)構(gòu)分析奠定了基礎(chǔ)。對P5CR蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(見表4)，發(fā)現(xiàn)P5CR蛋白主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角4種結(jié)構(gòu)組成，α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主要二級結(jié)構(gòu)元件，分別平均占46.13%和38.21%，β-折疊所占比例較少(平均值15.67%)，與人源P5CR蛋白的二級結(jié)構(gòu)比例相似。

表4 P5CR蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)磷酸化是生物體內(nèi)普遍存在的一種重要活性調(diào)節(jié)機制。使用NetPhos 3.1軟件對蕓薹屬AC

表5 P5CR蛋白的磷酸化位點分析

亞基因組中P5CR蛋白的磷酸化位點進(jìn)行分析(見表5)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜的P5CR均具有多種不同的磷酸化位點。其中，絲氨酸磷酸化位點(Ser)最多為38個(Bra006270)，最少為15個(Bol034305、GSBRNA2T00140419001)；蘇氨酸磷酸化位點(Thr)最多為16個(Bra006270)，最少為7個(Bra008735、GSBRNA2T00130008001)；酪氨酸磷酸化位點(Tyr)變化較小，只有Bra006270具有2個，其余都為1個。說明P5CR蛋白的磷酸化主要以絲氨酸和蘇氨酸磷酸化為主。

通過Pfam提取P5CR基因結(jié)構(gòu)域區(qū)段，得到每個基因的特征結(jié)構(gòu)域范圍(見表1)。利用Clustal Omega進(jìn)行序列比對后，發(fā)現(xiàn)其保守結(jié)構(gòu)域區(qū)段長度約為105個氨基酸。采用WebLogo3繪制出的結(jié)構(gòu)域logo圖(見圖4)，P5CR-Dimer Motif為高度保守motif，只在3個位點有多態(tài)性(18位、41位和100位)。

同時通過MEME進(jìn)行全蛋白的motif分析，基于最大期望值(EM)算法識別motif(見圖5)。按P<0.01標(biāo)準(zhǔn)，在P5CR基因內(nèi)共找到8個motif區(qū)段，motif 1—motif 4具有50個氨基酸殘基，位于81～130個氨基酸之間，Bra006270從第245個氨基酸開始。Motif 5具有21個氨基酸殘基，位于133～153個氨基酸之間，Bra006270從第297個氨基酸開始。Motif 6和Motif 7為15個氨基酸殘基，位于66～80個氨基酸之間，Bra006270從第230個氨基酸開始。Motif 8為11個氨基酸殘基，位于1～11個氨基酸之間，Bra006270從第165個氨基酸開始。8個P5CR基因都含有motif 1—motif 8。

圖4 P5CR-dimer結(jié)構(gòu)域

圖5 各蛋白質(zhì)motif序列和分布

3 討論

植物基因家族擴張主要通過全基因組加倍和基因串聯(lián)重復(fù)兩種方式，P5CR基因在不同植物中的拷貝數(shù)差異較大，但在不同植物中非常保守[17，27]，本研究也表明蕓薹屬AC亞基因組在演化過程中，P5CR基因數(shù)目及其特征穩(wěn)定，可能在不同植物中P5CR具有相同的基因功能。

對蕓薹屬AC亞基因組上的P5CR基因啟動子區(qū)的預(yù)測表明，該基因除含有轉(zhuǎn)錄增強因子外，還含有與誘導(dǎo)表達(dá)相關(guān)的順式作用元件，如光響應(yīng)、激素響應(yīng)、脅迫響應(yīng)和植物生長發(fā)育等順式作用元件。在植物防御反應(yīng)中，有大量轉(zhuǎn)錄因子的參與，而茉莉酸甲酯在大部分情況下誘導(dǎo)這些轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄，這與本研究鑒定到的8個P5CR基因都預(yù)測到茉莉酸甲酯、脅迫應(yīng)激等反應(yīng)順式元件相互印證，也與前人報道的該基因為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控吻合。

研究顯示來源于進(jìn)化程度更高的C亞基因組上的P5CR基因啟動子區(qū)域具有干旱、低溫等應(yīng)答應(yīng)激的順式元件，而A亞基因組上的P5CR基因啟動子區(qū)域沒有。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，同為十字花科的擬南芥中的P5CR基因最先和白菜型油菜中的P5CR基因分開，也驗證了A亞基因組在蕓薹屬演化過程中為最原始。

P5CR基因參與植物滲透脅迫的報道很多，但與植物病原菌脅迫關(guān)聯(lián)的報道只出現(xiàn)在大豆中[28]。大豆中與菌核病抗性強關(guān)聯(lián)的P5CR基因(Glyma-03gl29100)同源比對到甘藍(lán)型油菜中的A10和C09染色體上，而A10染色體上的P5CR基因2000 bp啟動子區(qū)域沒有預(yù)測到順式作用元件，可能A10上的P5CR基因為一個假基因，而C09上的P5CR預(yù)測出啟動子區(qū)含有HNF-1、INF.1、TCR-beta_decamer、c-fos_US5、beta-pol_CS、EivF/CREB、EivF、ATF、CREB、GCF、TFIID、TATA等元件。其中ATF(活化轉(zhuǎn)錄因子)以3次且權(quán)重最高被預(yù)測到；CREB被3次預(yù)測到，它能刺激基因轉(zhuǎn)錄，被稱為轉(zhuǎn)錄增強因子。綜上，本研究通過對蕓薹屬AC亞基因組P5CR基因家族的生物信息學(xué)分析，可以為深入研究該屬植物P5CR基因家族的功能和調(diào)控機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。