聶麗珍 黃淑琪 楊靜＊

（1.衡陽市市場監(jiān)督檢驗檢測中心，湖南衡陽 421200；2.南華大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南衡陽 421200）

茶皂素（tea saponin），又名茶皂苷，是一種性能優(yōu)良的天然非離子型表面活性劑，可配置無公害洗滌劑、各類工業(yè)乳化劑、無公害殺蟲劑，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤等多種生物活性而被廣泛應(yīng)用于日用化工、建筑材料、食品和漁業(yè)養(yǎng)殖等不同生產(chǎn)領(lǐng)域[1-5]，其市場發(fā)展前景巨大。

油茶籽粕是油茶籽餅經(jīng)浸出油脂并除去溶劑后剩余的物料[6]，含有茶皂素、茶多糖、茶蛋白、生物堿等多種有效組分，其中，油茶籽粕中茶皂素的含量高于其他組分[7]。近年來，國家對油茶產(chǎn)業(yè)的重視程度越來越高，中央已經(jīng)將油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展與國家糧油安全、生態(tài)安全聯(lián)系在一起。我國油茶林種植面積也呈現(xiàn)出逐年增加的趨勢，因此，從油茶籽粕提取茶皂素，可提高茶油加工附加值，具有較好的現(xiàn)實意義和應(yīng)用前景。然而，我國每年有很大部分油茶餅粕被當做燃料或廢物直接丟棄，造成資源的嚴重浪費[8]。茶皂素中茶皂苷含量的高低又是衡量皂素產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標，因此茶皂素的定量分析是研究皂素提取純化及其應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)，目前檢測茶皂素的方法主要有重量法[9-10]、比色法[11]、光譜法[12]、高效液相色譜法[13-15]等。國內(nèi)茶皂素的研究熱點主要是以茶皂素為乳化劑制備山茶油、甜橙油等納米乳液以及用響應(yīng)面法優(yōu)化茶皂素提取工藝；國際上茶皂素的研究熱點主要集中在茶皂苷單體的提取以及體外抗氧化活性研究[16]，而對茶皂素液相色譜定量檢測分析報道較少。

由于SN/T 1852—2006《出口茶皂素皂苷含量的測定》已作廢，目前沒有新的國家標準替代并提出油茶產(chǎn)品中茶皂素的檢測方法，因此本研究根據(jù)國標GB/T 35131-2017《油茶籽餅、粕》中的要求，建立一種快速、簡單、穩(wěn)定測定油茶籽粕中粗茶皂素含量的檢驗方法，進一步將該方法應(yīng)用到茶皂素中皂苷含量的測定，以及油茶籽餅、粕中茶皂素的測定，為制訂行業(yè)標準、地方標準提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶皂素標準品（上海如吉生物科技，含量95%）；實驗室自制脫脂茶粕；甲醇（色譜純，德國默克股份有限公司）；無水乙醇（分析純AR，湖南匯虹試劑有限公司）；乙腈（色譜純，德國默克股份有限公司；磷酸（優(yōu)級純GR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；純水（湖南中沃水務(wù)環(huán)保科技有限公司超純水系統(tǒng)制備）。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2030C 3D 島津高效液相色譜儀（日本島津公司）；PDA 二極管陣列檢測器（190 nm～650 nm，254 nm 為監(jiān)控波長）；博納艾杰爾Venusil C18 Plus 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；METLER 分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DH500-8S 電熱恒溫干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；DZKW-S-4 電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療器械有限公司）；GM-0.5A 隔膜真空泵（津騰）；超聲波清潔儀（天津科貝爾公司）；XH-D 渦旋混勻器（上海汗諾儀器有限公司）

1.3 試驗方法

1.3.1 茶皂素粗提物的制備及茶皂素樣品待測液的配制

采用有機溶劑提取法，選用乙醇-水作為提取試劑；精密稱取已烘干至恒重的脫脂茶粕粉2 g 于三角燒瓶中，加入80%乙醇20 mL，水浴鍋中80℃回流提取2 h，趁熱將三角燒瓶中的提取液過濾至50 mL 容量瓶中，濾渣再用80%乙醇洗滌一次，合并濾液，80%乙醇定容至刻度，混勻，精密移取上清液2.00 mL 至10 mL 容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，混勻，即為茶皂素樣品提取液，取適量上清液過0.22 μm 有機濾膜，供高效液相色譜測定。

1.3.2 標準溶液配制

精密稱取茶皂素標準品0.616 0 g 于50 mL 容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，再用甲醇定容至刻度，配制成12.32 mg/mL的茶皂素標準儲備液，精密移取一定體積的標準儲備液，分別用甲醇稀釋成0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、5.0 mg/mL 標準系列工作溶液。

1.3.3 色譜條件

Venusil C18 Plus 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇:水（90:10），采用等度洗脫；流速0.5 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30℃；檢測波長：348 nm。

1.3.4 標準曲線繪制

將1.3.2 小節(jié)中配置好的6 個標準系列溶液（STD 0.05、STD 0.1、STD 0.25、STD 0.5、STD 1.0、STD 5.0）按上述色譜條件上機分析，測定相應(yīng)濃度下的峰面積。然后按照峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

2.1.1 波長的選擇

同一茶皂素標準溶液，在其它色譜條件相同的情況下，觀察二極管陣列檢測器（PDA）在190 nm 至800 nm 之間掃描的波長處掃描出來的光譜視圖，如圖1 所示，掃描出的光譜視圖出現(xiàn)了3 個吸收峰，分別是206 nm、265 nm、348 nm。其中，茶皂素峰在206 nm 波長處有吸收峰，但存在與溶劑甲醇峰相近難以分開，在265 nm 波長的吸收峰尖銳、靈敏度高，但標準物質(zhì)色譜峰存在拖尾，在348 nm 波長的吸收峰與265 nm波長處的吸收峰相比稍寬，但標準物質(zhì)色譜峰未存在拖尾且峰型尖銳對稱。故選檢測波長為348 nm。

圖1 茶皂素190 nm～800 nm 波長段光譜圖

2.1.2 流動相、流動相比例和流速的選擇

試驗分別采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈甲醇（v:v=1:1）-水及乙腈-0.1% 磷酸水不同比例作為流動相對茶皂素進行分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水、乙腈甲醇-水及乙腈-0.1%磷酸水不論是梯度洗脫還是等度洗脫時，分離效果均不理想；而當采用甲醇-水體系作為流動相時，獲得的圖譜峰型尖銳對稱、分離效果最佳。在此流動相下，更改流動相比例，依次用30%、40%、50%、75%、80%、90%、100%的甲醇進行分析，結(jié)果表明，當流動相比例為100%甲醇時，茶皂素的峰型尖銳對稱，與雜峰的分離度好。保留時間適中，因此最佳洗脫條件，流動相選用100%甲醇。在同一色譜條件下，再依次將流速調(diào)為1.0 mL·min-1、0.9 mL·min-1、0.8 mL·min-1、0.7 mL·min-1、0.6 mL·min-1、0.5 mL·min-1進行分析試驗。結(jié)果表明：當流速采用0.50 mL/min 時，茶皂素的出峰時間在5.359 min，峰型對稱，柱效高，消耗的流動相少。色譜圖如圖2 所示，所以最佳洗脫條件，流動相流速選用0.50 mL/min。

圖2 茶皂素標準色譜圖

2.2 標準曲線及線性范圍

將配置好的標準系列工作溶液分別進樣10 μL，得出對應(yīng)濃度下的峰面積，以峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標，根據(jù)濃度與峰面積繪制標準曲線，濃度與峰面積數(shù)據(jù)以及標準曲線如圖3 所示?；貧w方程為Y=412 947×X-3 633.95（Y 表示峰面積，X 表示質(zhì)量濃度），線性回歸系數(shù)r=0.999 94。擬合度R2=0.999 98 結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度在0.05 mg/mL 至5.0 mg/mL 范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.3 茶皂素含量的測定

精密稱取脫脂茶粕2 g，平行5 份，按本文分析方法進行提取稀釋及上機，根據(jù)標準曲線計算粗提物中茶皂素含量。粗提物中茶皂素含量計算公式如下：

式中：c為提取液中茶皂素濃度（單位：mg/mL），v為樣品定容的體積（單位：mL），f為稀釋倍數(shù)，m為脫脂茶粕的質(zhì)量（單位：g）。

2.4 加標回收試驗

精密稱取已知茶皂素含量的脫脂茶粕粉3 份（每份2 g 左右），按照低、中、高三個水平分別加入12.32 mg/mL 的茶皂素標準使用液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL，按照1.3.1 小節(jié)處理，每份樣品進行6 次平行測定，考查方法的回收率及儀器精密度。結(jié)果如表1 所示，回收率范圍為90.2%～95.8%，說明本方法準確性良好。另在做樣品處理的同時取兩個空三角瓶，一份按空白樣處理，另一份加適量濃度的標準儲備液做空白加標回收試驗，如圖4 至圖7 所示，可以看出空白樣品加標圖與樣品加標圖譜相比較，空白加標色譜圖基線更平穩(wěn)，樣品加標圖譜色譜峰稍許拖尾，基線些許波動，這可能是由于基質(zhì)效應(yīng)及雜質(zhì)干擾導(dǎo)致。

表1 茶皂素加標回收率

圖4 茶皂素樣品色譜峰

圖5 樣品空白色譜圖

圖6 空白加標色譜圖

圖7 樣品加標色譜圖

2.5 精密度及檢出限

取同一樣品溶液，連續(xù)進樣6 次，所得峰面積的RSD 為0.433%，表明本方法精密度良好。選擇一系列較低濃度的茶皂素標準溶液上機分析，測試檢出限與定量限，以3倍的信噪比（S/N=3）計算方法的檢出限為0.027 mg/kg，以10 倍的信噪比（S/N=10）計算方法的定量限為0.090 mg/kg。

2.6 樣品檢測

應(yīng)用本文方法對衡陽市不同地區(qū)收集的6 份樣品脫脂處理后進行測定，結(jié)果如表2 所示。

表2 樣品測定結(jié)果

從表2 中可以看出脫脂茶粕粉中的茶皂素含量差異較大，究其原因，可能是因為地域和品種差異，也有可能是因為本文所提取的茶皂素含量為粗茶皂素含量，未進行純化，雜質(zhì)對結(jié)果造成一定干擾，但此方法可以快速測定茶粕粉中粗茶皂素含量，能夠滿足對茶皂素日常檢測的要求。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明：以80%乙醇為提取溶劑，經(jīng)加熱回流提取樣品，流動相稀釋樣品，以純甲醇為流動相對茶粕中的茶皂素進行液相色譜分析，得到茶皂素標準曲線，通過標準曲線的回歸方程計算出粗提物中茶皂素樣品的濃度，再通過含量計算公式得出粗茶皂素含量，該方法相關(guān)系數(shù)為（R）=0.999 942 9，檢出限為0.027 mg/kg，定量限為0.090 mg/kg。樣品測試的精密度RSD 為0.433%，加標回收率為90.2%～95.8%。綜上所述，用高效液相色譜法檢測粗提物中茶皂素不僅可以快速得到檢測結(jié)果，而且前處理簡單，實用性強，穩(wěn)定性好，能夠滿足在實際工作中對茶皂素的檢測需要，值得廣泛推廣。