王碧蕾，夏寶妹，金 虹，王錦玉

1南京特殊教育師范學(xué)院康復(fù)科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)康復(fù)教研室，江蘇 南京 210038；2東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院心血管內(nèi)科，3康復(fù)醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210009

《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2020 概要》指出，我國(guó)心血管疾病的患病率處于持續(xù)上升階段，心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，已成為威脅我國(guó)公眾健康的重要因素［1］。心肌梗死（myocardial infarction，MI）是心血管疾病最嚴(yán)重的結(jié)果之一。雖然經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療及藥物干預(yù)降低了急性心肌梗死的病死率，但長(zhǎng)時(shí)間的心肌缺血、缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死或凋亡，心肌梗死區(qū)發(fā)生心室重構(gòu)，逐漸發(fā)展為慢性心功能不全，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

指南推薦規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是保持心血管健康的重要因素，也是MI后心臟康復(fù)的重要組成部分［2-3］。中、高強(qiáng)度有氧或抗阻運(yùn)動(dòng)均可增加心肌組織血管密度［4-5］，運(yùn)動(dòng)中增高的血液層流剪切力（laminar shear stress，LSS）發(fā)揮重要介導(dǎo)作用［6］。中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)要求的時(shí)間較長(zhǎng)（30～60 min）且需達(dá)到一定強(qiáng)度（運(yùn)動(dòng)時(shí)心率為最大心率的60%～85%）。然而，大量患者因高齡、重癥、體弱或并發(fā)癥等原因不能保證充分的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，從而限制了該種運(yùn)動(dòng)方式的推廣；另外，心血管疾病的危險(xiǎn)因素也可能損害血管結(jié)構(gòu)對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的適應(yīng)。所以，積極探尋誘導(dǎo)或強(qiáng)化運(yùn)動(dòng)效果、提高運(yùn)動(dòng)獲益的治療方法，可以為MI患者帶來(lái)廣泛獲益。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族，是一種小分子二聚體蛋白質(zhì)，通過(guò)與其高親和力受體原肌球蛋白激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）結(jié)合發(fā)揮生物效應(yīng)。我們前期研究證實(shí)BDNF 介導(dǎo)了運(yùn)動(dòng)的血管保護(hù)效應(yīng)，運(yùn)動(dòng)可增加MI 大鼠血清BDNF 水平，且與其心肌血管密度和心功能改善程度密切相關(guān)［7］。但考慮到大量患者存在高血壓、糖尿病等并發(fā)疾病，其內(nèi)皮功能不佳、BDNF 分泌能力不足，可能影響其運(yùn)動(dòng)效果，那么在運(yùn)動(dòng)的同時(shí)外源性補(bǔ)充BDNF 是否可促進(jìn)運(yùn)動(dòng)效應(yīng)更好地發(fā)揮？

本研究體外構(gòu)建12 dyn/cm2LSS 模擬運(yùn)動(dòng)對(duì)血管壁的生理效應(yīng)，觀察循環(huán)中BDNF 水平對(duì)TrkB 及其下游Akt 通路激活的影響；利用MI 大鼠模型，從整體水平探討外源性補(bǔ)充BDNF是否可協(xié)同有氧運(yùn)動(dòng)強(qiáng)化其心肌血管生成及心功能改善的效應(yīng)，為臨床探求更為理想的誘導(dǎo)或強(qiáng)化運(yùn)動(dòng)獲益的途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)選用健康雄性SPF 級(jí)SD 大鼠60 只，體重220～250 g、12 周齡，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供［許可證號(hào)：SCXK（滬）20130006］。飼養(yǎng)于東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫保持20～25 ℃，濕度（55±10）%，晝夜明暗交替時(shí)間10～14 h，噪音＜60 dB，大鼠自由飲食和飲水。動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)后在實(shí)驗(yàn)前分籠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境飼養(yǎng)1周，4只/籠，期間統(tǒng)一適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練5 d，每天10 min。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：20200406021）。

1.1.2 主要材料和試劑

HUVEC 由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管病研究所提供。ECM 培養(yǎng)基（Sciencell 公司，美國(guó)），胰酶（Hyclone公司，美國(guó)），胎牛血清（杭州四季青公司），人重組BDNF（human recombinant brain-derived neurotrophic factor，rhBDNF）（Proteintech 公司，美國(guó)），羊抗BDNF 多克隆抗體、兔抗TrkB 多克隆抗體、兔抗TrkB（phospho Y515）多克隆抗體、β-actin 多克隆抗體（Abcam 公司，英國(guó)），抗羊二抗（Thermo Fisher Scientific 公司，美國(guó)），兔抗CD34 多克隆抗體、兔抗Akt多克隆抗體、兔抗磷酸化Akt多克隆抗體（Sigma-Aldrich 公司，美國(guó)），抗兔二抗（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司），羊抗兔FITC（Proteintech 公司，美國(guó)），即用型免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），DAB顯色試劑盒（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司），BDNF檢測(cè)試劑盒（R&D Systems公司，美國(guó)），Transwell 小室（Corning 公司，美國(guó)），Matrigel 基質(zhì)膠（BD Bioscience 公司，美國(guó)），平行板流動(dòng)小室（華西醫(yī)學(xué)中心生物工程研究室），動(dòng)物跑步機(jī)（成都泰盟軟件有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 流室系統(tǒng)裝配和細(xì)胞干預(yù)

系統(tǒng)裝配：本系統(tǒng)由流室系統(tǒng)和灌流系統(tǒng)兩部分組成，包括蠕動(dòng)泵、流室、儲(chǔ)液槽和醫(yī)用硅膠管道等（圖1）。蠕動(dòng)泵為本系統(tǒng)提供穩(wěn)定的常定流。流室系統(tǒng)是由有機(jī)玻璃制成的盒裝結(jié)構(gòu)（包括流入倉(cāng)、剪切力發(fā)生倉(cāng)和流出倉(cāng)），為保證流動(dòng)液以均勻速度通過(guò)相同縫隙流入發(fā)生倉(cāng)，兩端的流入倉(cāng)和流出倉(cāng)分別外接灌流系統(tǒng)。灌流液以固定流量由蠕動(dòng)泵泵出后經(jīng)管道進(jìn)入流室系統(tǒng)而對(duì)HUVEC 施加剪切力，后經(jīng)管道流回儲(chǔ)液槽，灌流液循環(huán)利用。也可在流入、流出口分別放置儲(chǔ)液槽，一端提供新鮮培養(yǎng)液，一端接收流出液，灌流液非循環(huán)利用。

圖1 平行板流動(dòng)小室系統(tǒng)（循環(huán)流體）Figure 1 Parallel plate flow cell system（circulating flow）

流量流速計(jì)算：剪切力SS 與流量Q、流室尺寸之間的計(jì)算公式為SS=6ηQ/WH2（η為灌流液的黏度，Q 為循環(huán)液的流量，W 為流室寬度，H 為流室高度）。本實(shí)驗(yàn)中η=0.765 1 dyn/cm2，W=2.57 cm，H=0.04 cm，SS=12 dyn/cm2，Q=0.050 7 mL/s。

流體剪切力的加載：載玻片經(jīng)高壓消毒滅菌后，放入超凈臺(tái)中風(fēng)干，并使用0.2%多聚賴(lài)氨酸包被。將包被好的載玻片用PBS 清洗3 遍，再將培養(yǎng)至第2～5 代的細(xì)胞接種于載玻片上，放入培養(yǎng)皿，靜置2 h待細(xì)胞貼壁后，往培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)80%后部分繼續(xù)靜止培養(yǎng)，取出置于流室系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。流室系統(tǒng)裝備完善后，在儲(chǔ)液槽中加入ECM培養(yǎng)基，開(kāi)啟蠕動(dòng)泵，產(chǎn)生LSS 作用于HUVEC；LSS 分別由非循環(huán)流體、循環(huán)流體、循環(huán)流體加入人重組BDNF（50 ng/mL）［8］產(chǎn)生。

1.2.2 ELISA檢測(cè)循環(huán)流體BDNF濃度

收集LSS 干預(yù)0、15、30、60 min 時(shí)段的循環(huán)流體。96 孔板前2 列為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)孔，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)給出的濃度使用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品；按照1∶4加入樣品稀釋液稀釋樣品100 μL/孔，室溫孵育過(guò)夜。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各時(shí)段循環(huán)流體中BDNF的濃度。

1.2.3 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)及磷酸化水平

在LSS 干預(yù)的0、15、30、60 min 檢測(cè)BDNF、TrkB 蛋白表達(dá)及TrkB、Akt 磷酸化水平。細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞樣本總蛋白，采用BCA法對(duì)蛋白含量進(jìn)行定量檢測(cè)。與上樣緩沖液按比例混合均勻后煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉溶液常溫封閉1 h，分別加入1∶200稀釋的抗BDNF、1∶50 稀釋的抗TrkB、1∶50 稀釋的抗TrkB（phospho Y515）、1∶800 稀釋的抗Akt 多克隆抗體和兔抗磷酸化Akt多克隆抗體，4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗滌3次、10 min/次；隨后以1∶800稀釋的二抗室溫孵育1 h，TBST 緩沖液洗滌3 次、15 min/次，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯色，膠片行顯影、定影后掃描。

1.2.4 Transwell小室測(cè)定HUVEC遷移能力

將HUVEC隨機(jī)分為對(duì)照組（Ctrl 組）、非循環(huán)SS組、循環(huán)SS組、BDNF組、循環(huán)SS+BDNF組，干預(yù)6 h后取出，消化重懸細(xì)胞，調(diào)整為5×108個(gè)/L，吸取0.1 mL細(xì)胞懸液加入上室，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，18 h 后取出濾膜，4%多聚甲醛固定10 min，PBS 沖洗，棉簽拭去上室表面內(nèi)殘存細(xì)胞，結(jié)晶紫染色。顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)清晰的視野拍照，計(jì)算每個(gè)視野穿膜細(xì)胞數(shù)取平均值。

1.2.5 小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC體外血管生成能力

將HUVEC隨機(jī)分為對(duì)照組（Ctrl 組）、非循環(huán)SS組、循環(huán)SS組、BDNF組、循環(huán)SS+BDNF組，干預(yù)6 h后取出，消化重懸細(xì)胞，調(diào)整為5×107個(gè)/L。將細(xì)胞外基質(zhì)膠溶解后鋪于96 孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育60 min。將上述細(xì)胞懸液加入96孔板（300 μL/孔），每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)18 h。每組隨機(jī)選取5 個(gè)視野于倒置顯微鏡下觀察、拍照并統(tǒng)計(jì)其每個(gè)視野下小管形成數(shù)量，取均值。

1.2.6 動(dòng)物造模、分組和干預(yù)措施

雄性SD 大鼠隨機(jī)分為5 組、每組12 只，分別為假手術(shù)組（Sham）、心肌梗死組（MIC）、心肌梗死+BDNF 組（MICB）、心肌梗死+運(yùn)動(dòng)組（MIE）、心肌梗死+運(yùn)動(dòng)+BDNF 組（MIEB）。心梗模型制備：使用戊巴比妥鈉（0.2 mL/10 g）腹腔注射麻醉，建立呼吸支持，行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)，結(jié)扎成功后，左心室前壁會(huì)變蒼白并且運(yùn)動(dòng)異常，逐層關(guān)胸。假手術(shù)組只開(kāi)胸穿線(xiàn)，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，手術(shù)時(shí)間與其他組匹配。有氧運(yùn)動(dòng)：參照Morais等［9］的方法，采用跑臺(tái)的方式進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。心梗手術(shù)后1周開(kāi)始跑臺(tái)適應(yīng)訓(xùn)練，訓(xùn)練時(shí)長(zhǎng)從10 min/d 開(kāi)始，逐日增加，至第5 天達(dá)到60 min/d 并長(zhǎng)期維持至訓(xùn)練結(jié)束。訓(xùn)練速度從5 m/min開(kāi)始，逐漸增加到20 m/min并長(zhǎng)期維持至訓(xùn)練結(jié)束。跑步機(jī)坡度從0°開(kāi)始，逐漸增加到25°。每周訓(xùn)練5 d、休息2 d，共訓(xùn)練4周。MICB 和MIEB 組大鼠在運(yùn)動(dòng)前10 min 尾靜脈注射BDNF蛋白0.4 μg/kg［10-11］。

1.2.7 心功能檢測(cè)

心梗手術(shù)后1 周、運(yùn)動(dòng)方案實(shí)施前以及最后一次運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練完成后48 h，每組分別取6只大鼠，異氟烷吸入麻醉下進(jìn)行經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，用來(lái)評(píng)估心功能。選取頻率為12 MHz 的超聲探頭進(jìn)行心臟大小和功能參數(shù)的采集，用高分辨率超聲Vevo770系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。探頭放置于大鼠左前胸，在心臟乳頭肌水平進(jìn)行M 型超聲檢測(cè)，測(cè)量舒張末期左心室內(nèi)徑（left ventricular internal diameter at enddiastole，LVIDd）、收縮末期左室內(nèi)徑（left ventricular internal diameter at end-systolic，LVIDs），系統(tǒng)自動(dòng)算出射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、短 軸 縮 短 率（left ventricular fraction shortening，LVFS）。所有檢測(cè)指標(biāo)均取3個(gè)心動(dòng)周期的平均值，超聲測(cè)量依據(jù)美國(guó)超聲心動(dòng)圖學(xué)會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.8 免疫組化檢測(cè)心肌血管密度

最后一次運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練完成后3 h，每組取6 只大鼠，迅速摘取大鼠心臟，沿心梗結(jié)扎線(xiàn)以下取部分左心組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)抗原修復(fù)后，用3% H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，抗原修復(fù)，滴加兔抗CD34多克隆抗體4 ℃過(guò)夜，PBS 沖洗3 次，加入二抗37 ℃孵育60 min，PBS 沖洗3 次，用DAB 顯色，再經(jīng)蘇木素復(fù)染，最后脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察，CD34主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，呈黃色至褐色。每張免疫組化切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性血管總數(shù)。毛細(xì)血管判斷標(biāo)準(zhǔn)：以黃染的血管內(nèi)皮細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞圍成管腔，直徑小于10 μm或單細(xì)胞管腔均作為1個(gè)毛細(xì)血管計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)流程重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LSS干預(yù)對(duì)BDNF表達(dá)的影響

循環(huán)流體和非循環(huán)流體產(chǎn)生的LSS 分別干預(yù)HUVEC 0、15、30、60 min。循環(huán)流體中BDNF 蛋白濃度隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，各時(shí)段間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2A）。兩種流體干預(yù)下，HUVEC 中BDNF 蛋白表達(dá)水平均隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，各時(shí)段間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2B、C）。

圖2 循環(huán)流體及非循環(huán)流體干預(yù)下BDNF蛋白表達(dá)水平Figure 2 BDNF levels in the circulating flow and non?circulating flow

2.2 LSS干預(yù)過(guò)程中流體BDNF水平對(duì)TrkB磷酸化的影響

循環(huán)流體和非循環(huán)流體產(chǎn)生的LSS 分別干預(yù)HUVEC 0、30、60 min。非循環(huán)流體環(huán)境中，TrkB 蛋白磷酸化水平隨著LSS 干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯變化，各時(shí)段間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；循環(huán)流體環(huán)境中，TrkB蛋白磷酸化水平隨著LSS干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，各時(shí)段間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；循環(huán)流體加入BDNF 后，TrkB 蛋白磷酸化水平較單純循環(huán)流體干預(yù)組進(jìn)一步增強(qiáng)，各時(shí)段間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 Western blot檢測(cè)不同BDNF水平的流體干預(yù)下TrkB蛋白磷酸化情況Figure 3 TrkB phosphorylation states in the flows with different BDNF levels detected by Western blot

2.3 LSS干預(yù)過(guò)程中增加流體BDNF水平對(duì)TrkB下游Akt通路激活的影響

循環(huán)流體和非循環(huán)流體產(chǎn)生的LSS 分別干預(yù)HUVEC 0、30、60 min。非循環(huán)流體環(huán)境中，TrkB 蛋白磷酸化水平隨著LSS 干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯變化，各時(shí)段間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；循環(huán)流體環(huán)境中，Akt 蛋白磷酸化水平隨著LSS干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，各時(shí)段間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；循環(huán)流體加入BDNF 后，Akt 磷酸化水平較單純循環(huán)流體干預(yù)組進(jìn)一步增強(qiáng)，各時(shí)段間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

圖4 Western blot檢測(cè)不同BDNF水平的流體干預(yù)下Akt蛋白磷酸化情況Figure 4 Western blot measurement of Akt phosphorylation states in the flows with different BDNF levels

2.4 LSS干預(yù)過(guò)程中增加流體BDNF水平對(duì)HUVEC體外血管生成能力的影響

體外細(xì)胞遷移和小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，非循環(huán)流體干預(yù)組HUVEC 遷移和小管形成能力與對(duì)照組（Ctrl 組）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。BDNF 干預(yù)組HUVEC 遷移和小管形成能力較對(duì)照組顯著增高（P＜0.05），但仍低于循環(huán)流體干預(yù)組（P＜0.05）。循環(huán)流體+BDNF干預(yù)組HUVEC遷移和小管形成能力較其他各組均顯著增高（P＜0.05，圖5）。

圖5 不同BDNF水平的流體干預(yù)對(duì)HUVEC遷移及小管形成能力的影響Figure 5 Effects of the flows with different BDNF level on HUVEC migration and tube?forming capacity

2.5 BDNF協(xié)同有氧運(yùn)動(dòng)促進(jìn)MI大鼠心肌血管生成

圖5為各組心肌組織免疫組化CD34染色切片代表照片，黃染部位為毛細(xì)血管。MIC組和MICB組心肌毛細(xì)血管密度顯著低于Sham 組（P＜0.05）；MIC組和MICB 組心肌毛細(xì)血管密度無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；MIE組心肌毛細(xì)血管密度顯著高于MIC、MICB組（P＜0.05），仍低于Sham組（P＜0.05）；MIEB組心肌毛細(xì)血管密度顯著高于MICB 組和MIE 組（P＜0.05），低于Sham組（P＜0.05，圖6）。

圖6 外源性注射BDNF、運(yùn)動(dòng)及兩者協(xié)同作用對(duì)MI大鼠心肌血管生成的影響（×200）Figure 6 Effects of intraventricular application of BDNF，exercise training and synergistic action of the two factors on myocardial angiogenesis of MI rats（×200）

2.6 BDNF協(xié)同有氧運(yùn)動(dòng)改善MI大鼠心臟功能

造模術(shù)后1 周，MIC、MICB、MIE、MIEB 組大鼠LVEF、LVFS 顯著低于Sham 組（P＜0.05），LVIDd、LVIDs 較Sham 組顯著增高（P＜0.05）；MIC、MICB、MIE、MIEB 組間LVEF、LVFS、LVIDd、LVIDs 無(wú)明顯差異（P＞0.05，圖7）。

經(jīng)過(guò)4周的干預(yù)，MIE組和MIEB組LVEF、LVFS均較干預(yù)前升高（P＜0.05），LVIDd、LVIDs 均降低（P＜0.05），且MIEB 組變化較MIE 組更為明顯（P＜0.05），但與Sham組比較，差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MIC組和MICB 組LVEF、LVFS、LVIDd、LVIDs與干預(yù)前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖7）。

圖7 外源性注射BDNF、運(yùn)動(dòng)及兩者協(xié)同作用對(duì)MI大鼠心功能的影響Figure 7 Effects of intraventricular application of BDNF，exercise training and synergistic action of the two factors on cardiac function of MI rats

3 討論

循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，以運(yùn)動(dòng)療法為核心的心臟康復(fù)在降低心血管病致殘率和死亡率以及提高心血管病患者生活質(zhì)量方面有確切獲益［2-3］。其中，冠心病運(yùn)動(dòng)康復(fù)的中心效應(yīng)發(fā)揮了重要的心臟保護(hù)作用。中心效應(yīng)的原理主要是指運(yùn)動(dòng)能夠促進(jìn)心肌血管生成及增強(qiáng)心肌收縮能力。

大量研究證實(shí)BDNF/TrkB 通路作為一種誘導(dǎo)性配體/受體系統(tǒng)在體內(nèi)展現(xiàn)出強(qiáng)大的促血管生成和心臟保護(hù)作用［12］。冠心病患者循環(huán)BDNF水平與血管內(nèi)皮功能［13］和心肺適應(yīng)能力（峰值耗氧量）呈正相關(guān)［14］。血清BDNF 水平降低與心衰患者的死亡和再住院有關(guān)［15］。而低水平BDNF 和低水平峰值耗氧量結(jié)合可預(yù)測(cè)心衰患者的心血管相關(guān)死亡率［16］。我們前期的研究結(jié)果揭示，有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可提高M(jìn)I 大鼠血清BDNF 濃度，并與心肌血管密度及心功能水平的改善呈正相關(guān)，提示該系統(tǒng)在運(yùn)動(dòng)的心血管獲益中發(fā)揮重要作用；同時(shí)，我們構(gòu)建了12 dyn/cm2LSS，以模擬運(yùn)動(dòng)對(duì)血管的生理效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)LSS 作用下內(nèi)皮細(xì)胞BDNF 合成和分泌顯著增加，從而判斷運(yùn)動(dòng)主要通過(guò)其誘導(dǎo)的LSS 增高促進(jìn)BDNF生成［7］。在血液循環(huán)過(guò)程中，血流與血管內(nèi)皮接觸而生成和血流方向一致的摩擦力，稱(chēng)為血流剪切力（shear stress，SS）。其中，LSS 是通過(guò)與血流方向相同的層流血流形成的。在生理范圍LSS（10～15 dyn/cm2）作用下，內(nèi)皮細(xì)胞可釋放多種生物活性物質(zhì)，維持血管適度的張力、抑制血小板黏附及血管重塑，并且隨著剪切力在一定范圍內(nèi)的適度增大，這種作用得到進(jìn)一步增強(qiáng)。適度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠通過(guò)心率的加快及心輸出量的增加，加快血流速度、提高外周血管張力，從而導(dǎo)致平均LSS 的增加［17］。運(yùn)動(dòng)性充血狀態(tài)下，加速的血流可引起動(dòng)脈系統(tǒng)反饋性舒張以降低局部剪切力至基礎(chǔ)水平，從而間接改善局部血供；但毛細(xì)血管順應(yīng)性有限，運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致其承受的剪切力維持在較高水平，其機(jī)械應(yīng)力傳導(dǎo)是微血管重構(gòu)的重要因素［18］。升高的剪切力可以加速內(nèi)皮細(xì)胞分裂，在體內(nèi)，局部血管生成情況也與局部組織充血程度、即局部微血管剪切力密切相關(guān)［19］。

隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的適度提升，局部血管LSS 水平相應(yīng)升高，其發(fā)揮的血管保護(hù)效應(yīng)亦隨之增強(qiáng)。研究證實(shí)，BDNF的生成與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度呈正相關(guān)，且可影響運(yùn)動(dòng)獲益程度［20-22］，而低強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)提高BDNF的效果不明顯［23］。故而，充足的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度才能確保LSS 上升、BDNF 濃度提高至獲益水準(zhǔn)；充足的運(yùn)動(dòng)時(shí)間才能達(dá)到足夠的LSS 作用起效時(shí)限。然而，相當(dāng)一部分患者因重視程度不足、醫(yī)療條件欠缺、高齡、重癥后虛弱等原因不能保證充足的訓(xùn)練強(qiáng)度和時(shí)間。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，本研究亦發(fā)現(xiàn)在LSS 干預(yù)下，BDNF 是配體濃度依賴(lài)性地發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的。LSS誘發(fā)的TrkB及其下游Akt通路的磷酸化持續(xù)增強(qiáng)依賴(lài)于流體中BDNF水平的維持。在平行板流動(dòng)小室中，循環(huán)和非循環(huán)流體產(chǎn)生的LSS均可使BDNF表達(dá)增加。但在使用開(kāi)放回路的非循環(huán)流體進(jìn)行干預(yù)時(shí)，非循環(huán)流體中HUVEC分泌的BDNF不停隨液體流出，故BDNF濃度極低、可忽略不計(jì)；同時(shí)，其中的TrkB 受體及下游Akt 通路亦處于未激活狀態(tài)。而Akt通路在心臟血管生成方面發(fā)揮重要作用，Cao等［8］證實(shí)老化的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞TrkB 表達(dá)降低以及相應(yīng)的BDNF-TrkB-PI3K/Akt 信號(hào)通路的損傷可導(dǎo)致BDNF介導(dǎo)的細(xì)胞遷移障礙。在使用循環(huán)流體產(chǎn)生的LSS 進(jìn)行干預(yù)時(shí)，灌流液中BDNF 濃度隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)增高，TrkB 及其下游Akt 通路激活程度呈持續(xù)增高趨勢(shì)。在循環(huán)流體中加入BDNF 后，TrkB、Akt 的磷酸化水平較單純循環(huán)流體干預(yù)組顯著增高，相應(yīng)的HUVEC 體外血管生成能力也顯著增強(qiáng)。這也進(jìn)一步解釋了為何運(yùn)動(dòng)后BDNF水平與心肌血管生成及心功能改善呈正相關(guān)性。循環(huán)BDNF 濃度越高，其受體TrkB 表達(dá)及其下游通路激活程度越高，能夠發(fā)揮出更顯著的生物學(xué)效應(yīng)。

然而，心血管疾病危險(xiǎn)因素可損害血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，影響B(tài)DNF 分泌。冠心病患者循環(huán)BDNF濃度顯著降低，且與血管性血友病因子呈正相關(guān)，提示內(nèi)皮功能障礙是循環(huán)BDNF水平受損的重要決定因素［13］。動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)均證實(shí)存在高血壓［24］、糖尿?。?5-26］、肥胖［27］等情況下，個(gè)體血清BDNF水平低于對(duì)照組，且對(duì)運(yùn)動(dòng)的敏感度也可能相對(duì)較低，無(wú)論是心肌梗死后的心肌代償水平還是運(yùn)動(dòng)后心臟恢復(fù)能力都有所下降。Val66Met 單核苷酸多態(tài)性（SNP）攜帶者中BDNF 的鈍化表達(dá)亦可能不會(huì)表現(xiàn)出血清BDNF 濃度的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度依賴(lài)性變化，也為其運(yùn)動(dòng)獲益帶來(lái)不確定性［28］。

所以，改善血管內(nèi)皮功能、從而誘導(dǎo)或強(qiáng)化運(yùn)動(dòng)效果的治療藥物的產(chǎn)生，可以為醫(yī)學(xué)界帶來(lái)廣泛的益處。這也為外源性注射BDNF強(qiáng)化運(yùn)動(dòng)效應(yīng)帶來(lái)了理論可行性。Hang 等［10］發(fā)現(xiàn)靜脈注射BDNF可減輕阿霉素對(duì)心臟的毒性作用；皮下注射BDNF可改善心功能不全小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，進(jìn)一步證實(shí)其在體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)［29-30］。這些研究結(jié)果均提示外源性BDNF 對(duì)于心血管疾病亦存在一定的治療意義。我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)靜脈注射BDNF協(xié)同運(yùn)動(dòng)可顯著提高M(jìn)I大鼠心肌血管密度及左心功能，考慮運(yùn)動(dòng)時(shí)增高的LSS結(jié)合較高濃度的BDNF 能夠強(qiáng)化其TrkB 及下游Akt 通路激活程度，從而有效改善內(nèi)皮細(xì)胞功能。其心功能的改善，一方面與心肌細(xì)胞血供改善有關(guān)，另一方面外源性BDNF 可能對(duì)心肌細(xì)胞本身亦有一定的保護(hù)作用，這也是我們下一步研究中擬進(jìn)一步探討的問(wèn)題。

在后續(xù)研究中，我們還會(huì)進(jìn)一步摸索BDNF 的給藥濃度、給藥方式和給藥時(shí)機(jī)，探討B(tài)DNF協(xié)同有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌BDNF/TrkB 及其下游信號(hào)通路的影響，在爭(zhēng)取獲得更佳療效的同時(shí)，為臨床優(yōu)化有氧運(yùn)動(dòng)效果改善MI 預(yù)后尋找新策略并提供理論和實(shí)踐依據(jù)。