苑寶潔，李 磊，張紅杰，石延霞，柴阿麗，謝學(xué)文*，李寶聚*

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2. 河北北方學(xué)院，張家口 075000）

黃瓜細菌性角斑病是由扁桃假單胞流淚致病變種Pseudomonas amygdalipv.Lachrymans侵染引起的一種細菌性病害[1,2]，該病在苗期和成株期均可發(fā)生，苗期以子葉危害為主，成株期以葉片、葉柄以及卷須危害為主，發(fā)生嚴重時還可造成莖蔓和果實的危害[3-5]，嚴重影響黃瓜產(chǎn)量。黃瓜細菌性角斑病菌主要在種子內(nèi)或隨病殘體殘留在土壤中存活，也可從傷口或氣孔侵入對黃瓜造成危害[6]。目前，黃瓜細菌性角斑病的防治主要依靠銅制劑及農(nóng)用抗生素等，與殺真菌的藥劑相比種類單一，且長期使用單一藥劑易造成抗藥性增強[7]。因此，有針對性地篩選黃瓜細菌性角斑病菌拮抗菌株，開發(fā)可以防治黃瓜細菌性角斑病的微生物殺菌劑是病害生物防治研究的重要方向。

芽胞桿菌具有強大的繁殖能力、對營養(yǎng)要求不高、在各種復(fù)雜的環(huán)境下都能夠生存等優(yōu)點，在生物防治中有巨大的開發(fā)潛力。已經(jīng)報道的能防治植物病害的芽胞桿菌主要有枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、多粘類芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa、蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis、地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis、蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus、側(cè)孢芽胞桿菌Bacillus laterosporus、短小芽胞桿菌Bacillus pumilus和貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis等[8,9]。

本試驗旨在從黃瓜根際土壤中篩選出高效的生防細菌，并對其抑菌效果進行初步研究，以期為黃瓜細菌性角斑病的生物藥劑開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種Pectobacterium carotovorumsubsp. carotovorum、扁桃假單胞流淚致病變種Pseudomonas amygdalipv. lachrymans、丁香假單胞番茄致病變種Pseudomonas syringaepv.tomato、西瓜嗜酸菌Acidovorax citrulli、野油菜黃單胞野油菜致病變種Xanthomonas campestrispv.campestris、密執(zhí)安棒桿菌馬鈴薯環(huán)腐致病變種Clavibacter michiganensesubsp.sepedonicums、茄匍柄霉Stemphylium solaniWeber、多主棒孢菌Corynespora cassiicola、炭疽菌Colletotrichumsp.、辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、西瓜殼二孢菌Ascochyta cittulinaSmith、茄鏈格孢菌Alternaria solani，以上菌株均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母提取物5 g、瓊脂18 g，1 L蒸餾水，用于拮抗菌株的分離和培養(yǎng)；NA固體培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化鈉5 g、瓊脂 18 g，1 L蒸餾水，用于病原細菌的培養(yǎng)及拮抗試驗；NB液體培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化鈉5 g，1 L蒸餾水，用于病原細菌菌懸液的搖培；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g，1 L蒸餾水，用于病原真菌的培養(yǎng)及拮抗試驗。

1.1.3 供試黃瓜品種 黃瓜品種“中農(nóng)6號”，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育。

1.2 拮抗細菌的分離及純化

先將從河北滄州，山東濰坊、壽光，北京通州、大興等地區(qū)采集的黃瓜根際土壤樣品中稱取10 g土樣放入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，置于28 ℃、180 r/min的搖床上震蕩30 min，土壤樣品充分懸浮后取出置于80 ℃的水浴鍋中水浴10 min，然后將土壤樣品按10-4、10-5、10-6進行梯度稀釋，每個梯度吸取100 μL于LB平板上涂布，置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，菌落長出后選取不同形態(tài)經(jīng)平板劃線法進行純化后保存編號，備用[10-12]。

1.3 黃瓜細菌性角斑病拮抗細菌的篩選

以黃瓜細菌性角斑病為靶標菌，采用雙層培養(yǎng)法[12]對1.2分離的拮抗細菌進行篩選。首先將活化好的拮抗細菌和病原菌用無菌接種針挑取單菌落分別轉(zhuǎn)接到LB和NB液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、180 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)24 h，制成菌懸液備用。在90 mm的LB固體培養(yǎng)皿中央點入5 μL待測拮抗細菌菌懸液，于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。待測拮抗細菌長出后取出培養(yǎng)皿倒置放入通風櫥中，在每個培養(yǎng)皿的蓋子里加入3 mL氯仿，放置12 h取出。在4 mL 5%水瓊脂中加入100 μL黃瓜細菌性角斑病菌懸液，混勻后倒入LB平板中，作為上層。置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出觀察抑菌圈，并采用十字交叉法對抑菌圈的直徑進行測量，計算抑制率。抑菌率（%）＝抑菌直徑/對照菌落直徑×100。

1.4 拮抗細菌ZF145的鑒定

1.4.1 菌株ZF145形態(tài)觀察和生理特性測定 采用三線法用接種環(huán)挑取活化好的單菌落在 LB固體平板培養(yǎng)基上進行劃線，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出觀察其菌落的顏色、形態(tài)和大小。依據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》第八版及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，28 ℃培養(yǎng) 24～48 h后，對生理生化特征進行鑒定[13]。

1.4.2 Biolog測定 挑取菌株ZF145單菌落接種至LB培養(yǎng)基試管斜面上，28 ℃培養(yǎng)24 h。由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心使用BIOLOG GENⅢ試劑盒（按照試劑盒說明書操作）對菌株ZF145進行唯一碳源利用的測定。

1.4.3 多基因擴增及序列分析 采用細菌基因組 DNA 提取試劑盒（試劑盒購北京自天根生化科技有限公司）提取菌株ZF145的總DNA，利用細菌16S rDNA的通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），針對目標基因設(shè)計引物gyrB-F（5′-GCAGCAAAACAGT TATGATGAA-3′）和 R（5′-AGTCTTCTCCGATACCTGTGC-3′）、atpD-F（5′-ACAAGTTTGTCTTCCTC GCC-3′）和R（5′-TGAGGTCGCTCTTCATTTAGG-3′），菌株ZF145進行PCR擴增[11,15]。反應(yīng)總體系為50 μL，PCR 擴增程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃補充延伸10 min。擴增產(chǎn)物選用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物直接采用雙向測序方法進行測序。測序工作由北京博邁德生物技術(shù)有限公司完成。將所測得的菌株ZF145的16S rDNA序列分析上傳NCBI，利用NCBI的Blast數(shù)據(jù)庫中進行比對[14]，比對不同菌株的16S rDNA、atpD、gyrB基因，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其親緣關(guān)系。

1.5 菌株ZF145抑菌譜的測定

1.5.1 細菌抑菌譜測定 菌株ZF145對病原細菌的抑菌譜測定采取雙層培養(yǎng)的方法。方法參照1.3黃瓜細菌性角斑病拮抗細菌的篩選。

1.5.2 真菌抑菌譜測定 采用平板對峙法[15]檢測拮抗細菌對病原真菌的抑制效果。PDA平板中央接種直徑5 mm的待測病原菌菌餅，28 ℃培養(yǎng)2 d后，在距平板中央3.5 cm處接種5 μL OD600為0.8的拮抗菌株，以不接拮抗菌株為對照，28 ℃培養(yǎng)5 d。每個處理重復(fù)3 次。測量靶標菌的對照菌落半徑和處理菌落直徑，用抑菌率表示。抑菌率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

1.6 拮抗菌株ZF145對黃瓜細菌性角斑病的防治效果

1.6.1 盆栽防效 將病原菌和拮抗細菌在NA/LB固體平板上活化。28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后挑取單菌落轉(zhuǎn)接到NB/LB液體培養(yǎng)基，置于28 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)36 h后制備成菌懸液待用。盆栽黃瓜長至2片真葉時，噴施1×108cfu/mL黃瓜細菌性角斑病菌懸浮液。接種病菌24 h后，采用噴霧接種法接種菌株ZF145菌懸液（1×108cfu/mL），以5%中生菌素可濕性粉劑為藥劑對照，清水對照只接致病菌不接生防菌。接菌后將黃瓜苗放入相對濕度 95%、溫度26 ℃～28 ℃保濕柜中保濕培養(yǎng)24 h，之后轉(zhuǎn)入相對濕度50%、溫度15 ℃～20 ℃的育苗溫室培養(yǎng)，重復(fù)3次。清水對照充分發(fā)病后計算病情指數(shù)與防治效果。黃瓜細菌性角斑病：按角斑病斑所占葉片表面積進行分級。0級：無病斑；1級：0～5%；3級：6%～25%；5級：26%～50%；7級：51%～75%；9級：75%以上。病情指數(shù)＝100×∑（各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9），防治效果（%）＝100×（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)。

1.6.2 田間防效 本試驗于2019年1月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院壽光蔬菜研發(fā)中心日光溫室內(nèi)檢測貝萊斯芽胞桿菌對黃瓜細菌性角斑病的田間防治效果。試驗期間溫室內(nèi)按同一標準進行管理，在溫室內(nèi)設(shè)置3個獨立的隔離拱棚，每個拱棚長為10 m，寬為3 m，共計30 m2，每個拱棚內(nèi)種植2壟黃瓜，每壟種植33株，待黃瓜植株長至10片真葉時，采用噴霧接種法將1×108cfu/mL的黃瓜細菌性角斑病菌懸液接種于黃瓜植株上，每株黃瓜接種25 mL菌懸液，24 h后分別接種1×108cfu/mL貝萊斯芽胞桿菌ZF145菌懸液100倍液噴霧處理，5%中生菌素可濕性粉劑1000倍噴霧處理和清水對照。清水對照只接致病菌，待清水對照發(fā)病后，開始調(diào)查其他處理的病情指數(shù)，計算防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細菌的分離篩選

采用平板稀釋法，對采集的7份黃瓜根際土壤樣品中的拮抗細菌進行分離。最終獲得384株拮抗細菌，并對其進行保存、編號。通過雙層培養(yǎng)法測定對黃瓜細菌性角斑病的抑制效果，篩選到8株對黃瓜細菌性角斑病抑制效果較好的拮抗菌株，其中菌株ZF145抑菌圈直徑最大（圖1），顯著高于其他菌株的抑菌直徑，為5.60 cm，抑制效果為62.22%（表1）。

圖1 菌株ZF145對黃瓜細菌性角斑病的抑制效果Fig. 1 The inhibitory effect of antagonistic strain ZF145 on bacterial angular leaf spot of cucumber

表1 拮抗細菌菌株對黃瓜細菌性角斑病的防效Table 1 Control effect of antagonistic bacterial strains on bacterial angular leaf spot of cucumber

2.2 拮抗細菌ZF145的鑒定

菌株ZF145在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，在LB固體培養(yǎng)皿上菌落為乳白色，邊緣不規(guī)則，有褶皺（圖2）。生理生化測定結(jié)果表明，菌株ZF145為革蘭氏陽性菌，在NaCl含量1%～8%的培養(yǎng)基上均能生長，檸檬酸鹽利用、明膠液化為陰性；Biolog檢測結(jié)果表明，菌株ZF145可以利用α-D-葡萄糖、氯化鋰、亞碲酸鉀、1%乳酸鈉，但不能利用 D-山梨醇、D-甘露醇、丙三醇、L-谷氨酸、D-天冬氨酸、D-絲氨酸，初步鑒定菌株 ZF145屬于芽胞桿菌屬（表2）。菌株 ZF145全基因組長 3929800 bp (登錄號GCA-014622705.1），分析菌株ZF145的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，該菌株與貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensisCP055160.聚在一簇，確定菌株ZF145為貝萊斯芽胞桿菌。

圖2 貝萊斯芽胞桿菌ZF145在LB培養(yǎng)基的菌落形態(tài)Fig. 2 The colony morphology ofBacillus velezensisZF145 on LB medium

表2 ZF145生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of ZF145

圖3 菌株ZF145基于多基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on the multigene sequences of strain ZF145

2.3 菌株ZF145抑菌譜的測定

拮抗菌株ZF145可以明顯抑制胡蘿卜軟腐果膠桿菌、丁香假單胞番茄致病變種、馬鈴薯環(huán)腐病菌、野油菜黃單胞野油菜致病變種和西瓜嗜酸菌5種病原細菌的生長，且對病原真菌也有明顯的抑制效果，可以抑制番茄匍柄霉病、灰葡萄孢、西瓜殼二孢、尖孢鐮孢菌、茄鏈格孢、辣椒炭疽病菌、多主棒孢菌、辣椒疫霉菌8種病原真菌的生長，表明拮抗菌株ZF145具有較為廣譜的抑菌能力（表3）。

表3 菌株ZF145對病原菌的抑菌效果Table 3 The inhibitory effect of ZF145 on 14 different pathogenic fungi

2.4 拮抗菌株ZF145對黃瓜細菌性角斑病防治效果

2.4.1 盆栽防效 采用噴霧接種法對兩葉一心的黃瓜植株接種黃瓜細菌性角斑病菌4 d后，清水對照開始發(fā)病，其病情指數(shù)21.09，而接種拮抗菌株ZF145菌懸液（1×108cfu/mL）后，黃瓜植株的病情指數(shù)為6.10，防治效果為71.10%，與對照藥劑中生菌素的防治效果無明顯差異（表4）。研究表明從土壤樣品中分離出來的貝萊斯芽胞桿菌ZF145在溫室條件下對黃瓜細菌性角斑病具有良好的防治效果。

表4 菌株ZF145對黃瓜細菌性角斑病的盆栽防治效果Table 4 Control effect of strain ZF145 on bacterial angular leaf spot of cucumber

2.4.2 田間防效 貝萊斯芽胞桿菌 ZF145按 108CFU/mL濃度施用時對黃瓜細菌性角斑病的防治效果為61.30%，對照藥劑5%中生菌素可濕性粉劑按1000倍施用時對黃瓜細菌性角斑病的防治效果為54.48%（表5），同等條件下，貝萊斯芽胞桿菌ZF145的防治效果高于對照藥劑中生菌素的防治效果，表明菌株ZF145在田間也具有較強的抑菌活性。

表5 菌株ZF145對黃瓜細菌性角斑病的田間防治效果Table 5 Control efficacy of antagonistic bacteria strain ZF145 on bacterial angular leaf spot of cucumber

3 討論

近年來，黃瓜細菌性角斑病發(fā)生嚴重，對黃瓜產(chǎn)量造成嚴重的威脅。目前，對黃瓜細菌性角斑病的防治方法主要采用化學(xué)防治，但化學(xué)藥劑存在種類單一、抗藥性等問題[15]。而生物防治能有效地避免這些問題，并且可以達到一菌多防的效果[16,17]。大量研究發(fā)現(xiàn)，土壤中存在大量的拮抗細菌，可以抑制多種病原菌的生長。從馬鈴薯根際土壤中篩選到一株解淀粉芽胞桿菌 Z17-2，對馬鈴薯立枯絲核菌具有明顯的抑制作用[18]。因此，本試驗以篩選黃瓜細菌性角斑病的高效生防菌株為出發(fā)點，從黃瓜根際土壤中分離出384株細菌菌株，并成功篩選獲得了1株對黃瓜細菌性角斑病具有良好拮抗能力的貝萊斯芽胞桿菌ZF145。其離體抑菌率為62.22%，盆栽防治效果為71.10%，田間防治效果為61.30%。

大量研究表明，對1種病原菌具有明顯抑制作用的拮抗菌株可能會對多種病原菌具有抑制效果，研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌可以有效的抑制多主棒孢病菌[19]、小麥赤霉病、立枯絲核菌[20]等病原菌的生長，李新宇[21]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌ZF 57可以有效抑制密執(zhí)安棒桿菌番茄潰瘍致病型、丁香假單胞菌番茄致病變種、胡蘿卜軟腐果膠桿菌、青枯雷爾氏菌、茄匍柄霉菌、多主棒孢菌的生長。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌ZF145可以有效抑制胡蘿卜軟腐果膠桿菌、丁香假單胞菌流淚致病變種、丁香假單胞菌番茄致病變種、密執(zhí)安棒桿菌馬鈴薯環(huán)腐致病變種、茄匍柄霉菌、灰葡萄孢菌、尖孢鐮孢菌等多種病原菌的發(fā)生，表明貝萊斯芽胞桿菌ZF145應(yīng)用空間較為廣泛。因此，以生防菌的獨特優(yōu)勢可作為防治真菌病害及細菌病害的有效拮抗菌株，這表明貝萊斯芽胞桿菌ZF145在黃瓜細菌性角斑病防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景。