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        枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑的研制

        2022-04-22 04:29:28郭莊園楊成德金夢(mèng)軍崔凌霄蔡鋒鋒魏立娟
        關(guān)鍵詞:芽胞潤(rùn)濕保護(hù)劑

        郭莊園,楊成德,金夢(mèng)軍,崔凌霄,蔡鋒鋒,敖 遠(yuǎn),魏立娟

        (甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070)

        枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis是生防細(xì)菌中最重要的一種[1],也是植物體內(nèi)常見的內(nèi)生細(xì)菌,其在提高作物抗逆性、促進(jìn)作物生長(zhǎng)、改良作物品質(zhì)及治理農(nóng)業(yè)耕地污染等方面的應(yīng)用越來越廣泛[2,3],對(duì)水稻[3]、小麥[4]、玉米[5]、番茄[6]、棉花[7]和蘋果[8]等植物上多種病害具有良好的防治效果。由于枯草芽胞桿菌具有生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單以及產(chǎn)生耐熱、抗逆芽胞等突出特征[9],使其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單,成本較低,施用方便,儲(chǔ)存期長(zhǎng)。因此,枯草芽胞桿菌現(xiàn)已成為一種理想的生防細(xì)菌??蓾裥苑蹌┚哂猩a(chǎn)成本低,有效成分含量高,應(yīng)用范圍廣,對(duì)植物和環(huán)境安全,易儲(chǔ)運(yùn)等特點(diǎn)[10],在已登記微生物殺菌劑劑型中占最大比例[11],是我國(guó)微生物農(nóng)藥的主要?jiǎng)┬?,普遍?yīng)用于植物病害防治。

        本試驗(yàn)中枯草芽胞桿菌 262XY2'是從高寒草地牧草內(nèi)生細(xì)菌中篩選得到的,對(duì)番茄葉斑病菌Pseudomonassyringapv.tomato、馬鈴薯枯萎病菌Fusarium avenaceum、馬鈴薯炭疽病菌Colletotrichum coccodes和馬鈴薯壞疽病菌Phoma foveata等具有良好拮抗作用,且同時(shí)具有固氮、溶磷和分泌IAA的功能;發(fā)酵液在盆栽試驗(yàn)中對(duì)番茄葉斑病防治效果在60%以上[12];固體發(fā)酵菌劑顯著增加馬鈴薯株高、根長(zhǎng)和體內(nèi)PAL活性且對(duì)馬鈴薯炭疽病具有良好的預(yù)防和治療效果[13],應(yīng)用潛力大[14]?;谖覈?guó)生物農(nóng)藥市場(chǎng)占有率不足10%的發(fā)展現(xiàn)狀[15],因此,本試驗(yàn)以枯草芽胞桿菌262XY2'為研究對(duì)象,通過對(duì)載體、分散劑、穩(wěn)定劑和保護(hù)劑等的篩選,并依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行了質(zhì)量檢測(cè),為研制以枯草芽胞桿菌262XY2'為有效成分的可濕性粉劑提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        1.1.1 供試菌種 枯草芽胞桿菌262XY2′是分離自東祁連山高寒草地線葉嵩草Kobresia capillifolia葉部的內(nèi)生細(xì)菌,由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原細(xì)菌及細(xì)菌多樣性實(shí)驗(yàn)室保存。

        1.1.2 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基[16]。

        1.1.3 供試試劑 載體:碳酸鈣、高嶺土、滑石粉、膨潤(rùn)土、硅藻土、白炭黑、凹凸棒土、蛭石粉和海泡石粉。助劑:十二烷基苯磺酸鈉(DBS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚乙二醇(PEG8000)、木質(zhì)素磺酸鈣和羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)。穩(wěn)定劑:磷酸二氫鉀(KH2PO4)、碳酸鈣(CaCO3)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、高嶺土和甲基纖維素。紫外保護(hù)劑:糊精、抗壞血酸和黃原膠。以上試劑均為市購。

        1.2 發(fā)酵液制備

        1.2.1 菌種活化 將4 ℃保存的262XY2′菌種轉(zhuǎn)接到NA平板培養(yǎng)基上,28 ℃下培養(yǎng)24 h備用。

        1.2.2 種子液制備 將培養(yǎng)好的262XY2′接種到三角瓶中,裝液量50 mL/250 mL,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,制得種子液備用。

        1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液以14%的接種量接入262XY2′的發(fā)酵培養(yǎng)基(3 g牛肉膏、30 g玉米淀粉、2 g CaC12、6 g酵母膏、1000 mL蒸餾水),pH 8.0,裝液量為20 mL/150 mL,32 ℃、210 r/min振蕩培養(yǎng)180 h,芽胞率達(dá)到80%以上,發(fā)酵液芽胞含量為1.55×1011cfu/mL。

        1.3 載體及助劑篩選

        1.3.1 載體篩選 載體吸附能力的測(cè)定:分別將5 g供試載體置于三角瓶,將發(fā)酵液緩慢加入三角瓶中,同時(shí)用玻璃棒攪拌直至載體呈液體流動(dòng)狀(不凝結(jié)成塊,放置不會(huì)析出液體),記錄添加發(fā)酵液用量 v。并計(jì)算最大吸附量H,即H= v/0.1(kg/L)。將發(fā)酵液分別與9種供試無菌載體按照7:3的比例混合均勻,鼓風(fēng)干燥箱50 ℃烘干,研磨成粉末測(cè)定其懸浮率和潤(rùn)濕時(shí)間,綜合考慮懸浮率、潤(rùn)濕時(shí)間、吸附容量、松散性和載體成本,選擇最優(yōu)載體。

        1.3.2 母粉制備 將枯草芽胞桿菌262XY2′發(fā)酵液分別加入到無菌載體白炭黑中,每100 g載體加入483 mL發(fā)酵液,混合均勻即為母液,置于鼓風(fēng)干燥箱50 ℃干燥10~12 h,研磨制成母粉,測(cè)定其芽胞含量為6.05×1011CFU/g。

        1.3.3 助劑種類及用量篩選 載體篩選基礎(chǔ)上,向母粉中分別添加10%助劑后粉碎加工成制劑,測(cè)定制劑的懸浮率和潤(rùn)濕時(shí)間;根據(jù)測(cè)定結(jié)果篩選出最優(yōu)助劑。將最優(yōu)助劑用量按2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%和18%添加量與母粉混合均勻,綜合考慮懸浮率、潤(rùn)濕時(shí)間及成本,篩選出復(fù)配助劑的最優(yōu)用量。

        1.3.4 穩(wěn)定劑篩選 在載體、助劑篩選的基礎(chǔ)上,向母粉中分別添加 2%的穩(wěn)定劑混合制成制劑,分別熱貯(54 ℃±2 ℃)14 d后測(cè)定其芽胞含量的變化,計(jì)算芽胞存活率,以不添加穩(wěn)定劑為對(duì)照,3 次重復(fù)。

        1.3.5 UV保護(hù)劑篩選 向母粉中分別添加紫外保護(hù)劑 (1%)并制成可濕性粉劑,以不添加保護(hù)劑紫外處理和不添加保護(hù)劑、紫外不處理為對(duì)照,4次重復(fù),將其分別稀釋后涂布在平板上,在距離紫外燈(254 nm,20 W)40 cm處照射30 min后,培養(yǎng)24 h分別測(cè)定芽胞存活率。通過比較UV照射前后芽胞含量篩選UV保護(hù)劑。

        1.4 制劑加工工藝

        將枯草芽胞桿菌262XY2′發(fā)酵液按載體與助劑優(yōu)化后的配比同時(shí)混合、攪拌,后在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中持續(xù)烘干10~12 h,經(jīng)粉碎機(jī)進(jìn)行超微粉碎,制成可濕性粉劑。

        1.5 枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑質(zhì)量檢測(cè)

        按照《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑進(jìn)行測(cè)定。

        (1)芽胞含量:參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)NY /T 2293. 1-2012。

        (2)懸浮率:參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB /T 14825-2006農(nóng)藥可濕性粉劑懸浮率的測(cè)定方法。

        (3)潤(rùn)濕時(shí)間:參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5451-2001標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。

        (4)細(xì)度:參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB /T 16150-1995農(nóng)藥可濕性粉劑細(xì)度測(cè)定。

        (5)熱貯穩(wěn)定性:參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19136-2003測(cè)定。

        (6)芽胞存活率:將樣品于85 ℃水浴鍋中水浴10 min,冷卻至室溫,取0.1 mL涂布平板計(jì)算芽胞數(shù),重復(fù)3次,采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定處理前后制劑中的芽胞含量;芽胞存活率(%)=(處理后芽胞含量/處理前芽胞含量)×100,計(jì)算平均芽胞存活率。

        (7)pH測(cè)定:參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB /T1601-93 農(nóng)藥pH的測(cè)定方法。

        (8)制劑貯藏穩(wěn)定性測(cè)定:取100 g芽胞桿菌可濕性粉劑置于室溫(25 ℃)條件下貯藏,每30 d測(cè)定芽胞含量1次,重復(fù)3次,測(cè)定時(shí)長(zhǎng)180 d,確定制劑貯藏180 d期間芽胞含量變化。

        (9)貨架期測(cè)定:將可濕性粉劑分裝在自封袋中,于4 ℃條件下存放6個(gè)月,每個(gè)月取樣1次,3次重復(fù),采用平板涂布法測(cè)定菌劑中的活菌數(shù)。

        1.6 室內(nèi)盆栽防效測(cè)定

        先將262XY2′枯草芽胞桿菌可濕性粉劑,有效成分為母粉87%(每100 g白炭黑加入48.3 mL的發(fā)酵液)、十二烷基硫酸鈉10%、磷酸二氫鉀2%和抗壞血酸1%,稀釋1000倍(活菌數(shù)為2.19×107cfu/g)均勻噴施于番茄葉面至全部潤(rùn)濕(每株需50 mL),待葉面藥液自然風(fēng)干24 h后,將經(jīng)LB搖瓶液體培養(yǎng)24 h后的番茄丁香假單胞葉斑病菌(病原菌)菌懸液稀釋10倍使其活菌數(shù)達(dá)到1.0×108cfu/mL,通過致傷接種法接種于健康的番茄植株葉片上,每處理3次重復(fù),以清水處理為空白對(duì)照,保濕一周后觀察發(fā)病情況,每盆選取15片葉進(jìn)行調(diào)查,計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)及262XY2′枯草芽胞桿菌可濕性粉劑對(duì)番茄細(xì)菌性葉斑病的防治效果,病情指數(shù)=Σ(病級(jí)數(shù)×該病級(jí)植株數(shù))/(最大病級(jí)數(shù)×植株總株數(shù))×100,防治效果(%)=(對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100。番茄細(xì)菌性葉斑病病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照馮中紅[12]的方法。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 載體篩選

        白炭黑的吸附容量最大,為4.83 L/kg,其次為蛭石粉,為3.63 L/kg,白炭黑的懸浮率達(dá)91.48%,達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(≥70%)(表1)。因此,選擇白炭黑作為262XY2′可濕性粉劑的載體。

        表1 載體的篩選Table 1 Screening of carriers

        2.2 助劑篩選

        結(jié)果表明,十二烷基硫酸鈉的懸浮率最高,為94.07%,其次是羧甲基纖維素鈉,為93.70%;拉開粉的潤(rùn)濕時(shí)間最短為27.40 s,其次是十二烷基硫酸鈉,為34.40 s,但拉開粉的懸浮率較低,為82.96%;活菌數(shù)除了十二烷基苯磺酸鈉和三聚磷酸鈉外,均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),并且活菌數(shù)最高的為木質(zhì)素磺酸鈉,達(dá)6.70×1010cfu/g,其次為十二烷基硫酸鈉,達(dá)2.68×1010cfu/g,結(jié)合懸浮性和潤(rùn)濕性,選擇十二烷基硫酸鈉為助劑(表2)。

        表2 助劑的篩選Table 2 Screening of additives

        2.3 助劑用量?jī)?yōu)化

        助劑用量為12%時(shí),懸浮率最高,達(dá)94.81%;其次助劑用量為8%和10%的懸浮率均為94.07%,但助劑用量為10%時(shí),潤(rùn)濕時(shí)間最短,為37.80 s,根據(jù)制劑成本和質(zhì)量確定助劑用量為10%(表3)。

        表3 助劑用量的篩選Table 3 Screening of auxiliary dosage

        2.4 穩(wěn)定劑篩選

        如表4所示,磷酸二氫鉀熱儲(chǔ)后的芽胞含量最高,并且其熱儲(chǔ)分解率最低為39.56%,而未加保護(hù)劑的對(duì)照熱儲(chǔ)分解率高達(dá)78.08%,說明磷酸二氫鉀為枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑的最優(yōu)穩(wěn)定劑。

        表4 穩(wěn)定劑的篩選Table 4 Screening of stabilizers

        2.5 紫外保護(hù)劑篩選

        如表5所示,以抗壞血酸為紫外保護(hù)劑時(shí),經(jīng)紫外處理后的芽胞存活率達(dá)72.08%,均高于黃原膠38.89%和糊精40.60%,故確定抗壞血酸為枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑最優(yōu)保護(hù)劑。

        表5 紫外保護(hù)劑的篩選Table 5 Screening of ultraviolet protectants

        2.6 質(zhì)量檢測(cè)

        如表6所示,通過對(duì)枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑的細(xì)度、潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率、干燥減量、pH值、芽胞含量及雜菌率等主要性能指標(biāo)的檢測(cè),可知各項(xiàng)指標(biāo)均符合農(nóng)藥可濕性粉劑的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),說明該菌劑合格,可以用于病害的防治。

        表6 枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑質(zhì)量檢測(cè)Table 6 Quality inspection ofB.subtilis262XY2' wettable powder formulation

        2.7 室內(nèi)盆栽防效測(cè)定

        如表7所示,枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑稀釋1000倍(2.19×107cfu/g)的室內(nèi)盆栽防治效果達(dá)到64%,可用于番茄細(xì)菌性葉斑病的防治。

        表7 枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑對(duì)番茄細(xì)菌性葉斑病的盆栽防效結(jié)果Table 7 Control effect ofB.subtilis262XY2' wettable powder formulation on tomato bacterial leaf spot in pot trial

        3 討論

        可濕性粉劑是我國(guó)微生物制劑的主要?jiǎng)┬蚚17,18],因其具有生產(chǎn)成本低,有效成分含量高,易于貯運(yùn)等特點(diǎn),在生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用??蓾裥苑蹌┲休d體所占比例最大,對(duì)可濕性粉劑的性能影響也最大,所以最佳載體的篩選是可濕性粉劑研制過程中最為關(guān)鍵的一步。由于原藥為液態(tài)的發(fā)酵液,需要選擇吸附容量高的載體,白炭黑質(zhì)地疏松,因其吸附容量和懸浮率高,同時(shí)研究結(jié)果顯示白炭黑較其他載體性能好,因此選擇白炭黑為制劑載體,與丁宇倩等[19]的結(jié)果一致。

        懸浮率和潤(rùn)濕時(shí)間是評(píng)價(jià)農(nóng)藥可濕性粉劑質(zhì)量的重要指標(biāo)[20],直接影響菌劑混合操作的便利性和混合后的均一穩(wěn)定性。潤(rùn)濕劑可以減小可濕性粉劑的表面張力從而增加其潤(rùn)濕性,分散劑能夠以低成本的方式增加其懸浮性[21]。本試驗(yàn)中可濕性粉劑芽胞含量為2.19×1010cfu/g,懸浮率為83.7%,潤(rùn)濕時(shí)間為23.8 s,以上3項(xiàng)主要指標(biāo)均優(yōu)于文獻(xiàn)[22]報(bào)道的枯草芽胞桿菌B1514可濕性粉劑的芽胞含量為1.70×109cfu/g、懸浮率為72%和潤(rùn)濕時(shí)間為135 s。

        為了保證制劑在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)芽胞含量的穩(wěn)定[23]以及降低實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中紫外線對(duì)芽胞產(chǎn)生的影響[24]。李舒雯等[23]報(bào)道羧甲基纖維素鈉作為穩(wěn)定劑時(shí), 熱貯后芽胞存活率高達(dá)54%。本試驗(yàn)中,羧甲基纖維素鈉作為穩(wěn)定劑時(shí),其芽胞存活率僅為27.29%,而磷酸二氫鉀作為保護(hù)劑時(shí),芽胞存活率高達(dá)60.44%,即選擇磷酸二氫鉀為 262XY2′的穩(wěn)定劑,這與李磊等[25]的研究結(jié)果一致。張正一等[26]報(bào)道抗壞血酸用于菌劑的紫外保護(hù)劑時(shí)能夠有效降低紫外線對(duì)哈茨木霉菌的影響,本研究也取得相似的研究結(jié)果。

        本研究通過對(duì)載體、助劑、穩(wěn)定劑和紫外保護(hù)劑的篩選,確定了枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑的最佳配方:母粉87%(每100 g白炭黑加入48.3 mL的發(fā)酵液),十二烷基硫酸鈉10%、磷酸二氫鉀2%和抗壞血酸1%。在此條件下制得的枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑懸浮率為83.7%,潤(rùn)濕時(shí)間為23.8 s,活菌數(shù)為219億cfu/g,且在細(xì)度、潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率、干燥減量、pH值、芽胞含量及雜菌率等指標(biāo)均符合可濕性粉劑及微生物制劑的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),盆栽防治效果達(dá)到64%,可用于番茄細(xì)菌性葉斑病的防治。該研究結(jié)果為枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑研制提供了技術(shù)支撐,也為其他微生物菌劑的研制提供了參考。

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