王亞楠，陳瑩瑩，范樂樂，馬桂珍，李世東，孫漫紅*，暴增海*

（1.江蘇海洋大學江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，連云港 222000；2.中國農業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100081）

土傳病害是極為常見的植物病害，如絲核菌Rhizoctoniaspp.引起的立枯病、鐮刀菌Fusariumspp.引起的枯萎病以及根結線蟲Meloidogynespp.引起的線蟲病等給農業(yè)生產造成巨大的損失[1,2]。當前，對這類病害的防控多采用土壤消毒、栽種抗病品種、生物防治、化學防治及輪作、水肥管理等農作措施[3,4]，其中化學防治應用最廣。但由于存在污染環(huán)境、農藥殘留和產生抗藥性等諸多問題，近年來化學農藥的使用受到限制，而生物農藥，尤其是生防微生物因環(huán)保安全、高效持效等特點在土傳病害防治中發(fā)揮了越來越大的作用[5]。大量研究表明，在土壤中施用芽胞桿菌Bacillusspp.、假單胞菌Pseudomonasspp.和木霉Trichodermaspp.等有益細菌和真菌或生防菌代謝產物可有效降低土傳病害的發(fā)生與危害，促進植物生長、提高產量[6-7]。但由于土壤環(huán)境復雜，生防微生物應用時會受到多種因素的影響，導致防效不穩(wěn)定，因此提高生防產品防病作用和穩(wěn)定性極為重要。

為了提高生防菌防病效果，解決多種病原物復合侵染等問題，實際生產中有時會將不同的生防菌混合使用[8,9]。魏滟潔等[10]發(fā)現，球毛殼菌Chaetomiumglobosum與枯草芽胞桿菌B.subtilis混合使用后對黃瓜枯萎病的防效顯著高于單一菌株的防效。Keyser等[11]將棕色綠僵菌Metarhiziumbrunneum與粉紅螺旋聚孢霉Clonostachysrosea孢子懸液混合后處理小麥種子，可有效防治由黃色鐮孢菌F.culmorum和黃粉蟲Tenebriomolitor引起的種傳病害和蟲害。將多種有益菌聯合使用，利用不同生防微生物的不同作用機制，實現優(yōu)勢互補，以充分發(fā)揮生防作用，對提高防病水平具有重要的意義。

共培養(yǎng)技術作為多種微生物組合使用的一種方法，可提高有效代謝組分的產量，并誘導生成新化合物[12]。當前，對生防微生物共培養(yǎng)技術的研究主要集中在生防菌組合及培養(yǎng)條件篩選，以提高發(fā)酵水平和生防效果。Li等[13]通過正交試驗優(yōu)化深綠木霉T.atroviride與枯草芽胞桿菌共培養(yǎng)條件，大幅提高了抗真菌次級代謝產物產量，進而提高了對禾谷鐮刀菌F.graminearum的抑制作用。Emanuel等[14]發(fā)現木霉與枯草芽胞桿菌共培養(yǎng)可誘導產生乙酸丁酯，提高對鱷梨炭疽病的防效，而乙酸丁酯是抑制膠孢炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides生長的一個重要因子。但目前有關利用不同生防菌共培養(yǎng)防治各類土傳病害及對植物生長的影響研究還較少。

粉紅螺旋聚孢霉是一類重要的生防真菌，可通過重寄生、拮抗和競爭等多種作用機制防治植物病害[15,16]。Anwar等[17]發(fā)現粉紅螺旋聚孢霉能夠在番茄葉片上快速定殖并大量產孢，從而抑制灰霉病菌的繁殖，控制灰霉病的發(fā)生。粉紅螺旋聚孢霉也可以通過分泌絲氨酸蛋白酶降解線蟲體壁，并利用降解產物提供自身營養(yǎng)，從而防治線蟲的為害[18]，此外，這類生防菌還可以產生植物生長素類的代謝物，促進種子萌發(fā)和植株生長，減少衰老[19,20]。迄今，粉紅螺旋聚孢霉已在溫室、大田廣泛應用，對紋枯病、枯萎病、線蟲病等多種植物病害顯示出良好的生防效果[21-23]，但其應用中有時也會出現防治效果不理想、不穩(wěn)定的問題。

粉紅螺旋聚孢霉67-1是本實驗室分離篩選到的一株高效粉紅螺旋聚孢霉生防菌株[24]。前期研究發(fā)現，將67-1與生防芽胞桿菌共培養(yǎng)可提高產孢量、縮短發(fā)酵周期，本研究在此基礎上測定了共培養(yǎng)發(fā)酵濾液對不同病原菌的抑菌活性，殺線蟲活性和促生作用，以期為提高生防菌作用效果、研發(fā)高效生防新產品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與線蟲

粉紅螺旋聚孢霉Clonostachysrosea67-1分離自海南省樂東縣菜園土壤，枯草芽胞桿菌B006分離自黑龍江省大豆田。大豆菌核病菌Rhizoctoniasolani分離自黑龍江省大豆病株，甘藍枯萎病菌Fusarium oxysporumf.sp.conglutinans和西瓜枯萎病菌F.oxysporumf.sp.niveum分離自河北廊坊蔬菜大棚病株。以上菌株均由中國農業(yè)科學院植物保護研究所土傳病害組保存。

根結線蟲采自內蒙古赤峰市紅山區(qū)文中鎮(zhèn)黑溝門村設施大棚感病番茄根部。

1.2 供試黃瓜

中農106號，購買于北京中蔬種業(yè)公司。

1.3 培養(yǎng)基

玉米粉/豆粕粉培養(yǎng)基：玉米粉16 g，豆粕粉6.8 g，MgSO40.5 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，ZnSO4·7H2O 0.05 g，水1 L。

葡萄糖/硫酸銨培養(yǎng)基：葡萄糖 30 g，(NH4)2SO41.5 g，MgSO40.5 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，ZnSO4·7H2O 0.05 g，水1 L。

NB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，葡萄糖10 g，酵母膏1 g，水1 L。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 L。

各培養(yǎng)基裝液量100/500 mL三角瓶，121 ℃濕熱滅菌25 min。

1.4 發(fā)酵濾液的制備

菌株67-1在PDA培養(yǎng)基上26 ℃培養(yǎng)7 d，刮取菌絲和孢子接種于PDB培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，制備菌株67-1種子液，濃度為108孢子/mL。菌株B006在NB培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min培養(yǎng)20 h，制備濃度為109孢子/mL的種子液。將菌株67-1種子液分別接種于玉米粉/豆粕粉、葡萄糖/硫酸銨培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后接種枯草芽胞桿菌B006種子液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。以在2種培養(yǎng)液中分別接種菌株67-1和菌株B006為對照。將發(fā)酵液4 ℃，10000 r/min離心20 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜去除菌體，制備共培養(yǎng)發(fā)酵濾液。

1.5 發(fā)酵濾液抑菌活性測定

將發(fā)酵濾液與冷卻至55 ℃左右的PDA培養(yǎng)基按1:4（v / v）比例混合，倒入9 cm培養(yǎng)皿中。用打孔器將PDA平板上培養(yǎng)7 d的大豆菌核病菌、甘藍枯萎病菌和西瓜枯萎病菌打成直徑為0.5 cm的菌餅，接種于培養(yǎng)基中心，28 ℃下培養(yǎng)7 d。十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率，同時刮取菌絲，測定生物量。抑菌率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。以未添加發(fā)酵濾液的PDA為對照。每個處理3個重復。

1.6 發(fā)酵濾液殺線蟲活性測定

取根結線蟲發(fā)病嚴重的番茄根，切成1～2 cm的小段，放入1%次氯酸鈉溶液中，用玻璃棒攪動3～4 min，快速倒入200目網篩中，500目網篩收集流出液。自來水反復沖洗，將收集的根結線蟲卵轉移至含有少量無菌水的培養(yǎng)皿中，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化24 h，收集2齡幼蟲，制備線蟲懸液，調節(jié)濃度約為300 J2/mL。

取3 mL共培養(yǎng)發(fā)酵濾液和1 mL線蟲懸液加入6孔組織培養(yǎng)板中，混勻后于25 ℃培養(yǎng)箱中靜置24 h。加入4 mL濃度為1 mol/L的NaOH溶液，搖勻后迅速于40倍倒置顯微鏡（OLYMPAUS CK2）下計數，記錄死亡線蟲數及線蟲總數，以單一菌株發(fā)酵濾液和清水為對照?；钴S，彎曲蠕動的幼蟲為活線蟲；蟲體僵直呈直線狀，且加入NaOH溶液后仍然僵直不動的為死亡線蟲。計算線蟲死亡率，校正死亡率（%）＝（處理死亡率－對照死亡率）/（1－對照死亡率）×100。每個處理3個重復。

1.7 發(fā)酵濾液對黃瓜種子萌發(fā)的影響

選取籽粒飽滿的黃瓜種子，用0.5%次氯酸鈉溶液消毒2 min，無菌水沖洗3遍，晾干。在15 cm玻璃培養(yǎng)皿中放置同等大小的滅菌濾紙，加入4 mL稀釋5倍的共培養(yǎng)發(fā)酵濾液。將黃瓜種子置于濾紙上，每皿15粒，26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天補充無菌水保持濾紙濕潤。以稀釋5倍的單一菌株發(fā)酵濾液和清水為對照。每天統(tǒng)計種子發(fā)芽數，4 d時測定幼苗長度，計算活力指數。每個處理3個重復。

1.8 發(fā)酵濾液對黃瓜幼苗的促生作用

將消毒的黃瓜種子置于鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，28 ℃培養(yǎng)箱中避光催芽24 h。待種子露白后溫室播種，每盆3株。待黃瓜幼苗長出真葉后取稀釋1倍的發(fā)酵濾液灌根，每株5 mL。每隔7 d灌根1次，連續(xù)灌根4次。待28 d處理結束后，測定幼苗株高、莖粗、葉面積，以及幼苗地上部與地下部鮮重。以單一菌株發(fā)酵濾液和清水為對照。每個處理12盆，3個重復。

1.9 數據統(tǒng)計與分析

試驗數據采用Excel 2011和SPSS 24軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 共培養(yǎng)發(fā)酵濾液對病原菌的抑制作用

2.1.1 發(fā)酵濾液對大豆菌核病菌菌核形成的影響 立枯絲核菌在玉米粉/豆粕粉培養(yǎng)基和葡萄糖/硫酸銨培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后會形成大量的菌核，而菌株67-1和B006發(fā)酵濾液處理后均可顯著減少立枯絲核菌菌核的數量，且共培養(yǎng)發(fā)酵濾液處理后菌核數量明顯少于單一菌株發(fā)酵濾液。在玉米粉/豆粕粉培養(yǎng)基中共培養(yǎng)發(fā)酵濾液處理后幾乎沒有菌核產生（圖1）。

圖1 生防菌發(fā)酵濾液對大豆菌核病菌菌核形成的抑制作用Fig.1 Inhibition of sclerotial formation in R.solani of soybean by the fermentation filtrates of biocontrol agents

2.1.2 發(fā)酵濾液對甘藍枯萎病菌和西瓜枯萎病菌生長的影響 菌株67-1和菌株B006發(fā)酵濾液對2種枯萎病菌均有一定的拮抗作用，且2種培養(yǎng)基中共培養(yǎng)發(fā)酵濾液對病原菌菌落擴展和生物量積累的抑制作用顯著高于單一菌株發(fā)酵濾液（P＜0.05）。當培養(yǎng)基中含有葡萄糖和硫酸銨時，其代謝物拮抗作用更為明顯，其中對甘藍枯萎病菌的抑制率比菌株67-1和菌株B006發(fā)酵濾液分別提高了86.6%和62.7%，病原菌生物量減少 36.2%和 19.7%（圖 2）。共培養(yǎng)發(fā)酵液處理后西瓜枯萎病菌菌絲擴展速度較粉紅螺旋聚孢霉濾液處理顯著降低，菌落直徑雖然與芽胞桿菌處理沒有差異，但菌絲稀疏，生物量顯著下降，在玉米粉/豆粕粉和葡萄糖/硫酸銨培養(yǎng)中分別減少了20.8%和11.3%（圖3）。

圖2 生防菌發(fā)酵濾液對甘藍枯萎病菌生長的影響Fig.2 Effects of the fermentation filtrates of the biocontrol agents on growth of F.oxysporum f.sp.conglutinans

2.2 共培養(yǎng)發(fā)酵濾液對根結線蟲二齡幼蟲殺蟲能力

粉紅螺旋聚孢霉濾液處理24 h后根結線蟲2齡幼蟲的致死率近50%，共培養(yǎng)發(fā)酵濾液處理后殺蟲效果顯著提高。但不同培養(yǎng)基中代謝物殺線蟲活性存在一定的差異，以葡萄糖/硫酸銨為培養(yǎng)基共培養(yǎng)發(fā)酵濾液的殺線活性更強，提高了50.8%，玉米粉/豆粕粉培養(yǎng)基中的共培養(yǎng)發(fā)酵濾液的殺線活性提高了37.0%（圖4）。

圖4 生防菌發(fā)酵濾液對根結線蟲的校正致死率Fig.4 The correction fatality rate of biocontrol agents fermentation filtrates to juveniles of root-knot nematode

2.3 共培養(yǎng)發(fā)酵濾液對黃瓜種子萌發(fā)和黃瓜幼苗生長的影響

2.3.1 生防菌發(fā)酵濾液對黃瓜種子萌發(fā)的影響 粉紅螺旋聚孢霉和芽胞桿菌發(fā)酵濾液處理后黃瓜種子活力指數、苗重及芽長顯著增加，且生防菌共培養(yǎng)濾液對芽長的增加、活力指數的提升顯著高于單一菌株發(fā)酵液（P＜0.05），2種共培養(yǎng)發(fā)酵濾液浸種后黃瓜種子的活力指數提高了19.6%～24.5%（表1）。

表1 生防菌發(fā)酵濾液對黃瓜種子萌發(fā)的影響Table 1 Effect of fermentation filtrates on the germination of cucumber seeds

2.3.2 生防菌發(fā)酵濾液對黃瓜幼苗的促生作用 不同發(fā)酵濾液處理后黃瓜莖粗、株高、地上部顯著提高，其中共培養(yǎng)濾液對幼苗株高、地上和地下部鮮重的提高顯著，優(yōu)于單一生防菌發(fā)酵濾液（P＜0.05）。不同培養(yǎng)條件下代謝物的活性也存在一定的差異，以玉米粉/豆粕粉為碳氮源時，共培養(yǎng)發(fā)酵濾液處理的黃瓜地上部鮮重比葡萄糖/硫酸銨培養(yǎng)基提高了20%（表2）。

表2 生防菌發(fā)酵濾液對黃瓜幼苗的促生作用Table 2 Growth promoting effect of fermentation filtrates on cucumber seedlings

3 討論

本文通過對粉紅螺旋聚孢霉和枯草芽胞桿菌共培養(yǎng)發(fā)酵濾液的生物學活性測定發(fā)現，共培養(yǎng)發(fā)酵濾液可以提高生防菌抗真菌活性、殺線活性、促進植物種子萌發(fā)和生長，這可能是共培養(yǎng)過程中2種生防菌共同作用的結果。在共培養(yǎng)過程中，不同類型的生防菌由于彼此間的競爭誘導分泌了更多的抗菌物質，且這些代謝產物也會對彼此的生長和代謝產生影響。研究發(fā)現，枯草芽胞桿菌可以誘導側孢短芽胞桿菌Brevibacilluslaterosporus產生新的抗菌物質，從而提高抗植物病原真菌的活性[25]；蘇云金芽胞桿菌B.thuringiensis可以刺激枯草芽胞桿菌產生更多的脂肽類化合物，從而提高抑菌效果[26]。粉紅螺旋聚孢霉和枯草芽胞桿菌在共同發(fā)酵培養(yǎng)過程中生防菌代謝物的變化可能是導致共培養(yǎng)發(fā)酵濾液生防活性增強的一個重要原因。其次，共培養(yǎng)過程中不同的生防菌相互作用，也會對彼此的生長、產孢產生影響。Li等[27]發(fā)現枯草芽胞桿菌分泌的脂肽類抗生素可以誘導木霉厚垣孢子的產生，Valliappan等[28]發(fā)現木霉菌與解淀粉芽胞桿菌共培養(yǎng)過程中其產孢和生長相關的酶基因表達水平顯著提高。我們在前期研究中也發(fā)現，將粉紅螺旋聚孢霉與芽胞桿菌共培養(yǎng)能夠顯著提高真菌產孢和生長（待發(fā)表）。由于生物量的增加，提高了生防真菌活性代謝組分的含量，進而共培養(yǎng)發(fā)酵濾液生防作用增強。粉紅螺旋聚孢霉可產生多種具有殺線蟲活性的代謝物和細胞壁降解酶，而枯草芽胞桿菌可分泌大量脂肽類抗生素等抑菌活性物質，將粉紅螺旋聚孢霉與芽胞桿菌組合，通過不同生防菌株的優(yōu)勢和功能互補，充分發(fā)揮二者的作用，從而有效提高對植物土傳病害的防控作用，促進作物健康生長。

不同營養(yǎng)條件對生防真菌和細菌共培養(yǎng)發(fā)酵液生物活性的影響不同。對營養(yǎng)物質的利用直接影響了生防菌的生理代謝和生長繁殖，進而影響生防菌生防作用的發(fā)揮[29,30]。本試驗中我們分別采用了營養(yǎng)豐富的玉米粉和豆粕粉，以及速效碳氮源葡萄糖和硫酸銨，結果發(fā)現葡萄糖/硫酸銨培養(yǎng)基中共培養(yǎng)發(fā)酵液的生防活性更高。這可能是共培養(yǎng)過程中，速效營養(yǎng)成分更有利于生防菌的攝取利用，其生長代謝速率更快，活性物質產量更高，從而表現出更強的生物活性。張燕等[31]發(fā)現不同碳源可影響熒光假單胞菌P.fluorescens抗生素2,4-DAPG相關基因的表達，進而影響抗生素的合成，當葡萄糖為碳源時2,4-DAPG產量最高，對棉花立枯絲核菌抑制作用最強。Meyer和Stahl[32]通過調整巨大曲霉Aspergillusgiganteus與尖孢鐮刀菌共培養(yǎng)的碳氮源，發(fā)現共培養(yǎng)過程中巨大曲霉中抗真菌蛋白基因表達量的變化很大程度上取決于培養(yǎng)基的組成。本實驗中，生防菌更易于利用速效營養(yǎng)生長繁殖，真菌-細菌間的相互作用表現得更為顯著。

通過將粉紅螺旋聚孢霉與枯草芽胞桿菌共同發(fā)酵培養(yǎng)，提高了生防菌對病原真菌、根結線蟲的生防作用以及黃瓜種子萌發(fā)、生長的促進作用。后續(xù)將進一步開展溫室評價，并探討其作用機制，為高效生防新產品的研發(fā)和應用奠定基礎。