張祥麗，曹瑱艷，楊怡華，宋 陽，申屠旭萍，俞曉平

（中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018）

鐵皮石斛Dendrobiumofficinale是一種多年生的附生草本植物，被譽(yù)為“九大仙草之首”，屬蘭科石斛屬[1]。鐵皮石斛具保健功能和治療效果且藥用歷史悠久，因在抗腫瘤降血糖、促進(jìn)消化、降血壓血脂和增強(qiáng)免疫系統(tǒng)等[2]諸多作用中都具有獨(dú)特功效，而享有“藥中黃金”的美稱，是傳統(tǒng)的名貴中草藥材。鐵皮石斛生長偏好溫濕氣候和半陰環(huán)境，因此病蟲害發(fā)生率高。自20世紀(jì)80年代以來，由于人們過度采挖野生鐵皮石斛，使本就珍貴的野生資源幾近枯竭，因此鐵皮石斛的集約化生產(chǎn)成為大勢所趨。

截至2019年，我國鐵皮石斛產(chǎn)量達(dá)到3.1萬噸，浙江省是我國鐵皮石斛道地藥材的主產(chǎn)區(qū)，在20世紀(jì)90年代基本實(shí)現(xiàn)了鐵皮石斛人工栽培的規(guī)?；l(fā)展，近年來全省栽植面積增至約2800公頃，鐵皮石斛產(chǎn)量已達(dá)7900噸，年產(chǎn)值為45億元[3]。金華市武義縣是浙江省乃至全國的鐵皮石斛主要生產(chǎn)地。2011年，壽仙谷牌“武義鐵皮石斛”被列入國家地理標(biāo)志登記保護(hù)名單，目前其種植面積占全省的10%以上。該地區(qū)鐵皮石斛的人工栽培主要以工廠化大棚栽培為主，雖然已取得一定經(jīng)驗(yàn)，但目前人工種植方面依舊面臨諸多難題。其中，由于要滿足鐵皮石斛特殊的生長習(xí)性，要對(duì)其培育條件加以嚴(yán)格控制。而溫暖濕潤陰涼的環(huán)境亦是病害滋生的溫床，加之鐵皮石斛葉茂莖嫩，營養(yǎng)價(jià)值高，易吸引病蟲侵襲，有些種植基地空氣不流通、過于潮濕，就會(huì)導(dǎo)致病蟲害的逐年加重。

浙產(chǎn)鐵皮石斛害病種類多而雜，常見病害有黑斑病、炭疽病、疫病、輪斑病、白絹病、銹病、根腐病等 12種，雖然目前對(duì)于浙產(chǎn)鐵皮石斛病害的防治已經(jīng)取得了一些成果，但是由于相關(guān)研究還處于剛起步階段，因此存在諸多不足，如病害發(fā)生規(guī)律不明晰、缺乏病原菌系統(tǒng)鑒定、防治技術(shù)單一落后等。目前國內(nèi)對(duì)于鐵皮石斛病害，已有與疫病、莖腐病、黑斑病、炭疽病病原菌鑒定和防治有關(guān)的報(bào)道[4,5]，但對(duì)于鐵皮石斛根腐病菌依舊限于病原菌鑒定方面，且相關(guān)報(bào)道極少，病害防控技術(shù)主要基于大田作業(yè)的經(jīng)驗(yàn)積累，缺乏科學(xué)研究的指導(dǎo)。

根腐病主要由立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、鐮孢屬Fusarium等真菌引起，鐮刀菌作為根腐病的主要致病菌（包括尖孢鐮刀菌F.oxysporum、茄病鐮孢菌F.solani、層出鐮刀菌F.proliferatum、黃色鐮刀菌F.culmorum、燕麥鐮刀菌F.avenaceum、接骨木鐮刀菌F.sambucium等）[6-10]，因其生態(tài)適應(yīng)性廣，侵染能力強(qiáng)，在任何生育期都能感染致病，嚴(yán)重危害鐵皮石斛的培育，造成大量減產(chǎn)，其引發(fā)的根腐病病害發(fā)生特點(diǎn)為根部腐爛，初期根尖、根莖出現(xiàn)水漬狀的褐色斑痕，并由病害處向四周擴(kuò)展，病情蔓延至莖葉，最嚴(yán)重時(shí)可致植株死亡[11]。種植基地根腐病的肆虐對(duì)鐵皮石斛的質(zhì)量和產(chǎn)量造成了嚴(yán)重影響，但是因種植區(qū)域、栽培模式和氣候環(huán)境及管理等方面的差異，病害發(fā)生情況不盡相同，其病原菌的優(yōu)勢種群也存在差異。為進(jìn)一步確認(rèn)武義鐵皮石斛根腐病致病菌群的具體特點(diǎn)，本研究將對(duì)前期從武義壽仙谷鐵皮石斛種植基地采集的病株中分離純化獲得并經(jīng)科赫法則驗(yàn)證的根腐病病原菌鐮刀菌進(jìn)一步進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子序列鑒定，明確其分類地位，篩選對(duì)該病原菌具有較強(qiáng)抑制作用的殺菌劑并用于田間防治，旨在明確浙江省金華市武義縣鐵皮石斛根腐病的病原菌并為其有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病原真菌 為本課題組前期從武義壽仙谷鐵皮石斛種植基地采集的病株中分離純化獲得并經(jīng)科赫法則驗(yàn)證的根腐病病原菌，初步鑒定為鐮刀菌（編號(hào)GF-14）[12]。

1.1.2 培養(yǎng)基 葡萄糖酵母礦物質(zhì)（Glucose yeast extract mineral，GYM）培養(yǎng)基：10 g麥芽提取物，4 g葡萄糖，4 g酵母提取物，2 g NaCl，1 g酶解酪蛋白，600 μL OB 溶液（5 g CuSO4·5H2O，7.5 g FeSO4·7H2O，5 g MgSO4·7H2O，3.6 g MnSO4·7H2O，9 g ZnSO4·7H2O，35 g CuCl2·2H2O，1 L 蒸餾水），1 L 蒸餾水，pH調(diào)至7.0；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1 L 蒸餾水，pH 調(diào)至 7.0；合成低營養(yǎng)瓊脂（Synthetic low nutrient agar，SNA）培養(yǎng)基：1 g KH2PO4，1 g KNO3，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g KCl，0.2 g葡萄糖，0.2 g蔗糖，20 g瓊脂粉，1 L蒸餾水，pH調(diào)至7.0；康乃馨葉片瓊脂（Carnation-leaf agar，CLA）培養(yǎng)基：6～8 mm2康乃馨葉片（處理：烘干并紫外滅菌過夜），20 g瓊脂粉，1 L蒸餾水，pH調(diào)至7.0；豐加霉素液體發(fā)酵培養(yǎng)基：3 g NH4NO3，5 g CaCO3，5 g (NH4)2SO4，10 g MgSO4·7H2O，10 g麩皮，15 g玉米粉，20 g黃豆粉，1 L蒸餾水，pH調(diào)至7.0；木霉素液體發(fā)酵培養(yǎng)基：0.001 g ZnSO4·7H2O，0.01 g NH4Cl，1 g牛肉浸膏，5 g蛋白胨，20 g葡萄糖，1 L蒸餾水，pH調(diào)至7.0。

1.1.3 引物 本研究中所用引物[12,13]如表1所示。

表1 本試驗(yàn)中所用的引物序列Table 1 Primers used in this study

1.1.4 殺菌劑 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628發(fā)酵液母液：淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628于豐加霉素液體發(fā)酵培養(yǎng)基中以28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后用4層紗布過濾，所得的上清液即為1628發(fā)酵液母液[14]，經(jīng)HPLC方法測定，該發(fā)酵液中主要含有4種代謝產(chǎn)物，其中豐加霉素濃度為178.32 mg/L、四霉素A濃度為186.72 mg/L、四霉素P濃度為502.13 mg/L、四烯霉素B濃度為48.07 mg/L[15]；臍孢木霉菌Trichodermabrevicompactum0248發(fā)酵液母液：臍孢木霉菌0248于木霉素液體發(fā)酵培養(yǎng)基中以28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d后用4層紗布過濾，所得的上清液即為0248發(fā)酵液母液[16]，經(jīng)GC方法測定，該發(fā)酵液中主要代謝產(chǎn)物為木霉素，含量穩(wěn)定在138.80 mg/L左右[17]（其中淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628和臍孢木霉菌0248均保存于浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）；96%寧南霉素原藥：購自天津阿爾塔科技有限公司；76%井岡霉素可濕性粉劑：購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；50%多菌靈可濕性粉劑：購自四川國光農(nóng)化股份有限公司。

1.1.5 儀器設(shè)備 GZX-9140-MBE烘干箱、恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），SW-CJ-1F單人雙面超凈工作臺(tái)（浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司），T100 PCR儀、Sub-Cell GT核酸電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司），YS100顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原真菌的分子鑒定 采用CTAB法[18]提取DNA作為PCR模板，以表1中引物（ITS1/ITS4、EF1/EF2、Fa/G2R、5f2/7cr）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 體系（50 μL）如下：10×Buffer（Mg2＋plus）4 μL、10 mol/L dNTP 1 μL、10 μmol/L 正、反向引物各 0.5 μL、2 U/μLTaqpolymerase 0.8 μL、DNA 模板 150～200 ng、ddH2O 補(bǔ)至 50 μL。PCR 程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性 2 min；94 ℃變性 45 s，55 ℃～62 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 0.5～2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后回收片段，并送測序。引物合成和測序均由上海桑尼生物科技公司完成。測序結(jié)果于鐮刀菌屬數(shù)據(jù)庫（http://fusariumdb.org/）進(jìn)行同源序列比對(duì)，并使用軟件Clustal X和MEGA 7.0.26構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 病原真菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將斜面保菌的致病菌株（GF-14）菌絲切成直徑為5 mm的菌塊接種于PDA平板中央，25 ℃、黑暗環(huán)境下培養(yǎng)7 d，觀察菌落大小、形態(tài)、菌絲質(zhì)地以及色素產(chǎn)生情況；同時(shí)將GF-14菌塊以相同方式接種于SNA平板上，20 ℃、黑暗環(huán)境下培養(yǎng)14 d，直接在SNA平板上觀察產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)；將新鮮的康乃馨葉片剪成6～8 mm2的片狀置于直徑為90 mm的滅菌培養(yǎng)皿中，將葉片烘干去除水分，然后將平皿打開置于超凈工作臺(tái)，紫外殺菌過夜。取10片處理后的康乃馨葉片置于冷卻的CLA平板上，25 ℃光暗交替培養(yǎng)14 d，挑取菌絲至玻片，400×顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)和隔膜數(shù)量等。隨機(jī)選擇30個(gè)大、小孢型分生孢子在光學(xué)顯微鏡下測定其大小，具體參考《真菌鑒定手冊》[19]、《鐮刀菌屬》[20]及近期相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.2.3 抑菌活性測定 按1.1.4中方法分別制備菌株1628和菌株0248發(fā)酵液母液，并將粉劑（96%寧南霉素原藥、76%井岡霉素可濕性粉劑）與無菌水按質(zhì)量比1:1制成液體藥劑待用。配制PDA培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃、15 min高溫滅菌待降溫至50 ℃～60 ℃，將4種供試殺菌劑與PDA培養(yǎng)基按體積比1:9分別制成含10% 1628發(fā)酵液、10% 0248發(fā)酵液、9.6%寧南霉素、7.6%井岡霉素的含藥平板，按體積比1:99分別制成含1% 1628發(fā)酵液、1% 0248發(fā)酵液、0.96%寧南霉素、0.76%井岡霉素的含藥平板，接種鐵皮石斛病原菌GF-14菌餅（直徑為5 mm）于PDA含藥平板中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取平均值計(jì)算抑制率，對(duì)照組為無菌水處理。抑制率（%）＝（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.2.4 平板對(duì)峙培養(yǎng) 將供試菌株淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628以平板劃線法接種于GYM平板，供試病原菌菌株GF-14以同樣方法接種于PDA平板，在28 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)3 d。以菌餅接種法接種以上兩株菌株5 mm直徑菌塊于PDA平板上，其中病原菌GF-14接種于平板中央，鏈霉菌1628以距平板中心3 cm的邊緣處選取4個(gè)點(diǎn)進(jìn)行接種，28 ℃黑暗條件培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，每組設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)，取平均值計(jì)算抑制率，對(duì)照組為僅接種病原菌GF-14和僅接種鏈霉菌1628的PDA平板。菌絲生長抑制率（%）＝（對(duì)照培養(yǎng)菌落半徑－對(duì)峙培養(yǎng)菌落半徑）/（對(duì)照培養(yǎng)菌落半徑－菌餅直徑）×100。

1.2.5 田間防效測定 試驗(yàn)地點(diǎn)為杭州市中國計(jì)量大學(xué)微型農(nóng)田，試驗(yàn)用田面積約16 m2。于2019年10月采集武義壽仙谷鐵皮石斛種植的“仙斛1號(hào)”一年生健康組培苗，當(dāng)天帶回隨即進(jìn)行栽培，2020年8月份進(jìn)入發(fā)病期，對(duì)發(fā)病癥狀進(jìn)行記錄，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。根據(jù)發(fā)病嚴(yán)重程度分為4級(jí)：0級(jí)，健康苗；1級(jí)，低于25%的葉片枯死；2級(jí)，26%～50%的葉片枯死；3級(jí)，51%～75%的葉片枯死；4級(jí)，76%～100%的葉片枯死[21]。選取對(duì)病原菌GF-14菌絲生長抑制效果明顯的殺菌劑用于鐵皮石斛根腐病病發(fā)期的田間防效試驗(yàn)，以淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628的發(fā)酵液未稀釋時(shí)為100%的1628發(fā)酵液，采用100%和50%的1628發(fā)酵液作為田間防效測定的供試藥劑，于7 d統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。其中鐵皮石斛根腐病田間試驗(yàn)區(qū)分為：陰性對(duì)照區(qū)（施用清水）、陽性對(duì)照區(qū)（施用50%殺菌靈）、1628發(fā)酵液處理1區(qū)（施用100% 1628發(fā)酵液）、1628發(fā)酵液處理2區(qū)（施用50% 1628發(fā)酵液），采用手動(dòng)壓力式噴霧器于整株植物均勻噴灑各供試藥劑，噴灑量為500 kg/hm2，每個(gè)分區(qū)樣本量為 30株。由于施藥前分區(qū)間病情指數(shù)各不相同，防效計(jì)算以每分區(qū)本區(qū)塊施藥前的發(fā)病情況為基礎(chǔ)。病情指數(shù)和防效計(jì)算：病情指數(shù)＝∑（各級(jí)病株數(shù)×對(duì)應(yīng)各級(jí)代表數(shù)值）/（調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最高級(jí)的代表數(shù)值）×100，校正防效（%）＝100×[1－（處理藥后病情指數(shù)×對(duì)照藥前病情指數(shù)）/（處理藥前病情指數(shù)×對(duì)照藥后病情指數(shù)）][22]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS軟件對(duì)各供試藥劑對(duì)病原菌菌絲生長及田間生防作用數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用T-test進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛根腐病病原真菌的分子生物學(xué)鑒定

以病原菌GF-14基因組DNA為模板，使用ITS1/ITS4、EF1/EF2、Fa/G2R和5f2/7cr引物分別對(duì)內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS、翻譯延伸因子TEF-1α、RNA聚合酶最大亞基RPB1和RNA聚合酶第二大亞基RPB2基因進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到500 bp片段（圖1a）、730 bp片段（圖1b）、1800 bp片段（圖1c）、1000 bp片段（圖1d），經(jīng)膠回收后送生物公司測序，測序結(jié)果上傳NCBI網(wǎng)站，登錄號(hào)分別為rDNA-ITS（MW172977）、TEF-1α（MW172978）、RPB1（MW172979）和RPB2（MW172980）。BLASTN分析結(jié)果顯示，該菌與變紅-木賊鐮刀菌復(fù)合種群F.incarnatum-equisetispecies complex（即為FIESC）同源性最高，其rDNA-ITS基因與FIESC 15-a（NRRL43619）同源性為99.8%、TEF-1α基因與FIESC 16-c（NRRL34059）同源性為100%、RPB1基因與FIESC 15-a（NRRL32864）同源性為99.74%、RPB2基因與FIESC 15-a（NRRL32175）同源性為98.63%（圖2）。

圖1 4對(duì)鐮刀菌特異性引物ITS1/ITS4、EF1/EF2、Fa/G2R和5f2/7cr的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplifications with four specific primer pairs (ITS1/ITS4, EF1/EF2, Fa/G2R and 5f2/7cr)

圖2 基于rDNA-ITS、TEF-1α、RPB1、RPB2序列構(gòu)建GF-14相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of GF-14 based on rDNA-ITS, TEF-1α, RPB1, RPB2 sequences

2.2 鐵皮石斛根腐病病原真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

致病菌株GF-14在PDA培養(yǎng)基上氣生菌絲密集發(fā)達(dá)、略有發(fā)散，呈棉絮狀；在25 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)，平均菌絲生長速度為每天15.2～18.5 mm，3 d后長滿90 mm直徑平板。初期菌絲呈圓形擴(kuò)散，正面為白色至淡奶油色，背面中部菌核處為褐色，后期平板正面呈不規(guī)則狀并有深黃色菌絲斑塊（圖3G-I）。顯微鏡下可見產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子：分生孢子呈假頭狀分布在產(chǎn)孢細(xì)胞頂部（圖 3A），瓶梗型產(chǎn)孢細(xì)胞在菌絲上側(cè)生，多有3～5個(gè)分枝（圖3B，C）。大型分生孢子為鐮刀形，頂端漸尖稍彎曲，3～6個(gè)分隔，大小為（18.0～32.0）μm×（3.0～5.0）μm（圖3D，E）；小型分生孢子為紡錘形、卵形，2～3個(gè)分隔，大小為（7.0～10.0）μm×（2.1～3.0）μm（圖 3F）。根據(jù)菌落形態(tài)特征、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、大分生孢子和小分生孢子的形態(tài)特征，結(jié)合分子學(xué)鑒定的結(jié)果，將致病菌株GF-14鑒定為變紅-木賊鐮刀菌復(fù)合種群[23,24]。

圖3 菌株GF-14的形態(tài)Fig.3 Morphology of strain GF-14

2.3 鐵皮石斛根腐病病原菌對(duì)供試殺菌劑的敏感性

10%的1628發(fā)酵液對(duì)菌株GF-14的抑制作用最強(qiáng)，菌絲生長抑制率為98.22%，而1%的1628發(fā)酵液對(duì)菌株GF-14的抑制率僅為55.58%。臍孢木霉菌0248的發(fā)酵液對(duì)菌株GF-14的菌絲抑制效果較差，10%和1%的0248發(fā)酵液對(duì)菌株GF-14的菌絲抑制率分別為28.89%和11.11%。而寧南霉素、井岡霉素不論是高濃度還是低濃度處理對(duì)GF-14均無明顯抑制作用（表2）。試驗(yàn)結(jié)果表明，淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628發(fā)酵液對(duì)GF-14具有較強(qiáng)抑制作用。

表2 供試殺菌劑對(duì)鐵皮石斛根腐病致病菌菌絲生長的影響Table 2 Effects of fungicides on the hyphae growth of root rot pathogen of D.officinale

2.4 平板對(duì)峙試驗(yàn)

淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628與鐵皮石斛根腐病菌GF-14在PDA平板上對(duì)峙培養(yǎng)5 d后，病菌GF-14的菌落前緣在靠近鏈霉菌 1628方向的生長受到抑制，菌絲呈明顯抑制狀態(tài)（圖 4），經(jīng)測定計(jì)算，菌絲生長抑制率為32.65%。

圖4 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628與鐵皮石斛根腐病原菌GF-14的對(duì)峙培養(yǎng)（5 d）Fig.4 The confrontation(5 d) culture of S.diastatochramogenes 1628 and GF-14 (5 d)

2.5 田間防效測定結(jié)果

100%的1628發(fā)酵液對(duì)鐵皮石斛根腐病病株的防效在施藥第7 d時(shí)最高，為34.90%，顯著高于50%的1628發(fā)酵液處理；50%濃度的多菌靈是目前田間使用最常用的劑量，其田間防效在施藥第7 d達(dá)30.68%，與100%的1628發(fā)酵液在施藥第7 d時(shí)的田間防效無顯著性差異，表明1628發(fā)酵液可以取代50%多菌靈作為防治鐵皮石斛根腐病的新型殺菌劑（表3）。

表3 供試殺菌劑對(duì)鐵皮石斛的田間防效Table 3 Control effects of fungicides on D.officinale

3 討論

ITS序列是位于rDNA中18S和5.8S之間（ITS1）以及5.8S和26S之間（ITS2）的非編碼轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，其間隔序列短，利于進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是廣泛應(yīng)用于真菌分類中的標(biāo)記序列，但I(xiàn)TS作為rDNA中的中度保守區(qū)，進(jìn)化速度相對(duì)較快，在某些真菌中間隔區(qū)差異性較小，不適合屬內(nèi)種的鑒定。為了解決這一問題，其他可作為分類標(biāo)記的基因也被應(yīng)用于鐮刀菌的分類鑒定，包括翻譯延伸因子α亞基基因TEF-Iα、RNA聚合酶基因RPB1、RPB2和β-微管蛋白基因Tub等[25,26]。為了更準(zhǔn)確地鑒定病原菌GF-14的分類地位，本研究結(jié)合病原菌內(nèi)多個(gè)非連鎖基因rDNA-ITS、TEF-Iα、RPB1和RPB2的比對(duì)分析和形態(tài)鑒定的結(jié)果，將其鑒定為變紅-木賊鐮刀菌復(fù)合種群。本研究中的分子鑒定涉及的系譜系統(tǒng)發(fā)育種類鑒別技術(shù)（Genealogical concordance phylogenetic species recognition，GCPSR）使結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠，并為之后的鐮刀菌菌種鑒定提供新思路。

除了對(duì)病原菌進(jìn)行分類鑒定外，本研究繼續(xù)對(duì)其在不同殺菌劑作用下表現(xiàn)的敏感性進(jìn)行了測定。農(nóng)用抗生素是一種由微生物產(chǎn)生的、能抑制或殺滅植物病原菌的生物農(nóng)藥，也稱微生物農(nóng)藥，以其安全高效、可降解性、環(huán)境污染小等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注，并成為未來農(nóng)藥發(fā)展的一個(gè)重要方向。在將生防菌用于作物的土傳病害、開發(fā)新型農(nóng)用抗生素方面，我國已取得諸多成果[27]。根腐病是作物的常見病害之一，由真菌引起的根腐病達(dá)到其病害發(fā)生率的70%以上[28,29]，鐮刀菌是主要致病菌之一，嚴(yán)重威脅著農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量。目前，采用微生物源農(nóng)藥對(duì)根腐病進(jìn)行防治也取得諸多成效，Saad等[30]發(fā)現(xiàn)從木棉樹和榕樹的根際微生物中分離得到的植物促生菌其混合菌株可有效抑制蠶豆根腐病的病情指數(shù)，使其降低了32.4%～57.4%，楊瑞先等[31]使用解淀粉芽胞桿菌Bacillusamyloliquefaciensmd8和md9合成的伊枯草菌素類物質(zhì)可有效抑制牡丹根腐病原菌的菌絲生長，盧志軍等[32]通過平板培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌B.subtilisHL29對(duì)苜蓿根腐病鐮刀菌抑制率能達(dá)到72.79%～81.09%。

針對(duì)鐵皮石斛根腐病的相關(guān)報(bào)道主要集中于對(duì)致病真菌的分離鑒定及生物學(xué)特性分析上，對(duì)防治用藥方法的比較分析卻少之又少。浙江省的鐵皮石斛種植具有區(qū)域性強(qiáng)、用藥水平不均的特點(diǎn)，因此經(jīng)常由于濫用、誤用農(nóng)藥致使農(nóng)藥殘留而影響藥材質(zhì)量安全[33]。淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628是本課題組前期從浙江天目山采集的土樣中分離鑒定得到的一株生防放線菌，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用[34-36]。通過分析比較不同殺菌劑對(duì)鐵皮石斛根腐病病原菌的防治效果，發(fā)現(xiàn) 1628發(fā)酵液能高效抑制病原菌GF-14菌絲的生長，10%的1628發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制率高達(dá)98.22%，顯著高于臍孢木霉菌 0248發(fā)酵液的抑制效果，而寧南霉素、井岡霉素（均為市面可購最高純度產(chǎn)品）則顯示無抑制效果。在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628與石斛根腐病菌GF-14的平板對(duì)峙試驗(yàn)中，病原菌GF-14菌絲生長狀態(tài)受到菌株1628的抑制率為32.65%，菌株1628對(duì)病原菌GF-14有一定防治效果。此外，在后續(xù)田間防效測定時(shí)1628發(fā)酵液原液與50%多菌靈防效無顯著差異，說明菌株1628代謝產(chǎn)物可以取代多菌靈發(fā)揮作用。多菌靈雖然在我國的使用范圍廣泛，但其對(duì)哺乳動(dòng)物的毒害作用不可忽視，而 1628代謝產(chǎn)物作為更環(huán)保安全的新型抑菌劑，為后續(xù)鐵皮石斛根腐病的防治開辟了新途徑，提供了可靠的理論依據(jù)。