呂 昂，吳明德，張靜，楊龍，李國慶*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，武漢 430064；2.農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，武漢 430064；3.華中農(nóng)業(yè)大學植物科學與技術(shù)學院，武漢 430070）

鏈霉菌Streptomyces是自然界中分布廣泛的一類放線菌，目前發(fā)現(xiàn)的鏈霉菌主要來源于土壤，在海洋、空氣、植物內(nèi)部同樣也發(fā)現(xiàn)了多種鏈霉菌[1-4]。據(jù)統(tǒng)計，現(xiàn)有已知的90%活性物質(zhì)來源于鏈霉菌[5]。在農(nóng)業(yè)上，源于鏈霉菌的殺菌劑有米多霉素、有效霉素、武夷菌素、諾沃霉素等[6-9]；殺蟲劑有阿維菌素、多殺菌素等[10,11]；除草劑有雙丙氨磷、Herboxidiene等[12,13]。鏈霉菌還可以產(chǎn)生一些有益于植物生長的小分子化合物或酶類，如植物生長激素類化合物、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等[14-16]。在植物病蟲害的生物防治中，主要應用的是鏈霉菌的活菌劑和發(fā)酵液及提取物[17]。目前，成功開發(fā)為商品制劑的鏈霉菌活菌劑有灰綠鏈霉菌Streptomycesgriseoviridis（Mycostop?）[18]和龜裂鏈霉菌S.rimosus（Rhizovit?）[19]，我國的涇陽鏈霉菌菌肥5406也被廣泛使用[20]。前人研究發(fā)現(xiàn)白黃鏈霉菌S.alboflavusTD-1發(fā)酵液可以抑制灰霉病菌的孢子萌發(fā)，提高番茄苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）的酶活力，從而促進番茄更好地抵御植物病原真菌[21]，唐德鏈霉菌S.tendaeXJ193發(fā)酵液對草莓灰霉病菌、桃褐腐病菌、黃瓜枯萎病菌等多種植物病原真菌具有明顯的抑菌活性[22]，鏈霉菌LA-5發(fā)酵液對番茄果實灰霉病的防效可達83.4%[23]。

鏈霉菌3-10屬于嗜酸鏈霉菌類群，鏈霉菌3-10的發(fā)酵液對灰霉病菌、油菜菌核病菌、立枯絲核菌等植物病原真菌具有良好的抑制作用[24]，使用菌株 3-10孢子液灌根后可抑制油菜根腫病的發(fā)生[25]。同時，研究還發(fā)現(xiàn)，菌株3-10抗真菌物質(zhì)粗提物對多種植物病原真菌有抑制作用，對多種真菌引起的草莓貯藏期腐爛病有防治作用[26]。因此，鏈霉菌 3-10的代謝產(chǎn)物和活菌均具有開發(fā)成為生防產(chǎn)品的潛力。但是，目前對于菌株3-10提取物在環(huán)境中的穩(wěn)定性沒有報道。本研究主要通過提取物對灰霉病菌的抑菌活性試驗，篩選一種能高效地將無菌發(fā)酵液中的抑菌成分提取出來的有機溶劑，研究外界環(huán)境（溫度、酸堿、紫外線）及提取物所處狀態(tài)（液態(tài)、干粉）對抑菌活性的影響，為實際應用鏈霉菌3-10及其提取物提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株：灰霉病菌BotrytiscinereaB05.10和鏈霉菌菌株Streptomycessp.3-10保存于本實驗室。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑和儀器

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1000 mL；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液（PDB）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1000 mL；ISP-2培養(yǎng)基：酵母浸膏4 g，麥芽提取物10 g，葡萄糖4 g，瓊脂粉15 g，pH調(diào)節(jié)至6.0左右，蒸餾水定容至1000 mL。上述培養(yǎng)基分裝后于121 ℃滅菌20 min，備用。

試劑：乙酸乙酯、正丁醇、三氯甲烷、四氯化碳、石油醚、環(huán)己烷、濃鹽酸、氫氧化鈉均為國藥試劑分析純級（國藥集團化學試劑有限公司）。

儀器：R-250 Rotavapor? 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Büchi），生化培養(yǎng)箱HP400S型（武漢瑞華儀器設備有限責任公司），pH計（型號 Delta 320，德國 Mettler-Toledo），真空冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）。

1.3 發(fā)酵液的制備

將鏈霉菌3-10劃線于ISP-2培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d后加適量無菌水用接種環(huán)刮洗菌落表面，三層擦鏡紙過濾、稀釋后得到孢子懸浮液（濃度1×109孢子/mL），將所得到的孢子懸浮液以1%體積比接種到PDB培養(yǎng)液中，在28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，得到鏈霉菌的發(fā)酵液。將發(fā)酵液以8000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm細菌過濾器過濾，得到無菌發(fā)酵液。

1.4 抗真菌物質(zhì)提取

選取極性不同的正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、四氯化碳、石油醚和環(huán)己烷作為提取溶劑，從鏈霉菌3-10發(fā)酵液中提取抗真菌物質(zhì)，通過測定提取物（有機相）和發(fā)酵液中殘留的抗真菌物質(zhì)（水相）的生物活性比較不同溶劑的提取效果。具體操作程序：將500 mL無菌發(fā)酵液分別與500 mL不同的提取溶劑混合，超聲波提取10 min、置于搖床150 r/min振蕩培養(yǎng)10 min，靜置12 h，使混合液分層，用梨型分液漏斗分液，分別收集提取后的水相和有機相，將提取后的水相置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在40 ℃下減壓蒸餾，以除去其中殘留的有機溶劑。將各溶劑提取后的有機相置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在40 ℃下減壓蒸餾至干燥，用5 mL甲醇溶解，將其作為抗菌物質(zhì)提取物，用蒸餾水稀釋50倍，采用帶毒平板法測定抗真菌活性。

乙酸乙酯提取物（Ethyl acetate extract，簡稱EA提取物）的獲得，根據(jù)上述1.3的方法大量獲得鏈霉菌3-10的發(fā)酵液，獲得的發(fā)酵液加入等體積的乙酸乙酯后充分混勻、靜置、待其分層后取上層乙酸乙酯相，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃下減壓蒸餾置干燥，稱重后一定體積甲醇溶解。

1.5 發(fā)酵液和提取物抗菌活性的穩(wěn)定性測定

將鏈霉菌3-10發(fā)酵液和EA提取物用于本試驗。將EA提取物稱重、甲醇溶解，再用無菌蒸餾水配制成濃度為200 μg/mL的溶液，用于下列試驗。（1）熱穩(wěn)定性試驗。將含有鏈霉菌3-10的發(fā)酵液或EA提取物溶液的塑料離心管分別置于40 ℃、60 ℃、80 ℃和100 ℃的水浴鍋中，在處理10、30和60 min后分別取出10 mL樣品置于冰上冷卻，以不經(jīng)過熱處理的發(fā)酵液和EA提取物溶液作為對照。（2）酸堿穩(wěn)定性試驗。分別用鹽酸溶液（2.0 mol/L）和氫氧化鈉溶液（2.0 mol/L）將發(fā)酵液和EA提取物溶液的pH值分別調(diào)節(jié)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0和 13.0，以未經(jīng)調(diào)節(jié)pH值的發(fā)酵液和EA提取物溶液為對照，置于4 ℃冰箱中，24 h后取出發(fā)酵液和EA提取物溶液，將其pH值調(diào)回至6.5（發(fā)酵液最終pH值）。（3）紫外線照射試驗。取10 mL發(fā)酵液和EA提取物溶液至培養(yǎng)皿（直徑60 mm），將培養(yǎng)皿開蓋置于磁力攪拌器上勻速攪拌，在磁力攪拌器正上方放置1個紫外燈管（UV-C, 30 W），燈管與培養(yǎng)皿中液面之間的垂直距離為15 cm，照射時間為 0（對照）、1、5、10、15、20、25、30、45和60 min。

1.6 EA提取物在不同狀態(tài)下的貯存穩(wěn)定性測定

測定EA提取物在液體和干燥狀態(tài)下貯存抗菌活性的穩(wěn)定性。液體貯存試驗是用無菌蒸餾水和甲醇將EA提取物分別配制成水溶液和甲醇溶液（濃度均為10 μg/mL），分裝至塑料管中（2 mL大小，每管1 mL）。干燥狀態(tài)貯存是將EA提取物冷凍干燥，制備成干粉，取0.1 g干粉，裝于塑料管（2 mL）中。將不同處理塑料管分別置于4 ℃、20 ℃、28 ℃和37 ℃下存放，在放置當天（0 d）以及貯存10、30、60和100 d后，取出管中所有的EA提取物干粉或溶液測定抗真菌活性。

1.7 抗菌活性測定

以灰霉病菌菌株 B05.10為靶標菌測定不同有機溶劑提取物和余液及乙酸乙酯提取物抗菌活性。測定方法是帶毒平板法，將2 mL發(fā)酵液（包括提取后的發(fā)酵液水相）或EA提取物（母液濃度：10 μg/mL）與18 mL PDA培養(yǎng)基混合均勻（二者的比例是1:9），以添加PDB的PDA為陰性對照。在不同平板中接種菌株B05.10菌絲瓊脂塊（直徑5 mm），在20 ℃培養(yǎng)3 d，測量各平板中的菌落直徑，將含有抗菌物質(zhì)處理菌落直徑與陰性對照中的菌落直徑進行比較，計算抑菌百分率。抑菌百分率（%）＝（陰性對照菌落直徑—處理菌落直徑）/陰性對照菌落直徑×100[27]。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0和Excel軟件進行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有機溶劑的提取效果

使用不同極性的有機溶劑提取鏈霉菌3-10產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，篩選最佳提取溶劑。結(jié)果表明：乙酸乙酯是最佳提取溶劑，乙酸乙酯提取物（EA提取物）對灰霉病菌菌絲生長的抑制作用最強，抑菌率為 96.6%（圖1，2），而乙酸乙酯提取后的余液抑菌率僅為3.7%（圖1）；正丁醇和三氯甲烷提取效果中等（圖1，2）；四氯化碳、石油醚和環(huán)己烷的提取效果最差（圖1，2），該結(jié)果表明，鏈霉菌3-10發(fā)酵液中的抗真菌物質(zhì)能被乙酸乙酯很好地提取出來。

圖1 不同有機溶劑提取物對灰霉病菌菌絲生長的抑菌效果Fig.1 Antifungal activity of crude extract and extract residue against mycelial growth of B.cinerea

圖2 不同溶劑提取物及余液對灰霉病菌菌絲生長的抑菌率Fig.2 Inhibition rate of crude extract and extract residue against mycelial growth of B.cinerea

2.2 發(fā)酵液和提取物中抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性

在熱穩(wěn)定性試驗中，40 ℃處理至60 min后，菌株3-10發(fā)酵液和EA提取物的抑菌率未明顯下降。60 ℃處理至60 min，發(fā)酵液和EA提取物的抑菌率分別下降至65.3%和55.3%。80 ℃和100 ℃高溫處理后抑菌活性顯著下降，80 ℃處理10 min發(fā)酵液和EA提取物抑菌活性開始下降，處理60 min后發(fā)酵液和EA提取物的抑菌率分別下降至49.2%和33.2%；100 ℃處理10 min后發(fā)酵液和EA提取物的抑菌率分別下降至57.4%和52.1%，處理至60 min時幾乎失去抑菌活性，這說明鏈霉菌3-10中的抗菌物質(zhì)對80 ℃以上的高溫比較敏感（圖3）。

圖3 溫度對發(fā)酵液和提取物抑菌活性的影響Fig.3 Effect of temperature on antifungal activity of the cultural filtrate and crude extract from Streptomyces sp.3-10

在酸堿穩(wěn)定性試驗中，發(fā)酵液和EA提取物在pH為2～6的酸性環(huán)境中能保持良好的抑菌活性，發(fā)酵液和EA提取物在pH 2處理后抑菌活性分別為93.5%和90.3%，在pH 6處理后抑菌活性分別為95.3%和92.1%。pH 8以上的堿性環(huán)境會破壞發(fā)酵液和EA提取物的生物活性，發(fā)酵液和EA提取物在pH為8的條件下處理，抑菌活性開始下降，在pH為13的條件下抑菌率分別下降至47.3%和33.2%，發(fā)酵液的抑菌活性下降比提取物的緩慢，這可能是因為發(fā)酵液中存在一些緩沖酸堿的物質(zhì)（圖4）。

圖4 酸堿度對發(fā)酵液和提取物抑菌活性的影響Fig.4 Effect of ambient pH on antifungal activity of the cultural filtrate and crude extract of Streptomyces sp.3-10

在紫外線照射穩(wěn)定性試驗中，發(fā)酵液和提取物經(jīng)過紫外線照射后，抑菌活性顯著下降。EA提取物在紫外線照射1 min，抑菌活性下降至83.5%；照射20 min，抑菌率下降至9.7%；發(fā)酵液在紫外線照射10 min，抑菌率下降至85.2%；照射60 min，抑菌率仍有43.2%。發(fā)酵液經(jīng)過紫外線照射后抑菌活性下降比提取物緩慢，這可能是因為發(fā)酵液中含有糖和一些大分子物質(zhì)作為保護劑延緩了紫外線對發(fā)酵液抑菌活性的影響（圖5）。以上結(jié)果表明，鏈霉菌3-10的發(fā)酵液及提取物對80 ℃以上的高溫、堿性環(huán)境和紫外線照射比較敏感。

圖5 紫外線照射對發(fā)酵液和提取物抑菌活性的影響Fig.5 Effect of UV irradiation on antifungal activity of the cultural filtrate and crude extract of Streptomyces sp.3-10

2.3 不同狀態(tài)下提取物穩(wěn)定性

提取物在水中時，其穩(wěn)定性較差，4 ℃條件下貯存超過30 d后，抑菌活性有明顯下降，抑菌率下降至83.4%，隨著貯存時間的延長，EA提取物的抑菌活性隨之下降；到100 d時，抑菌率下降至44.5%；20 ℃時貯存至第30 d時，EA提取物的抑菌率下降至64.5%，100 d時，EA提取物抑菌率下降至39.1%；28 ℃時貯存30 d時，EA提取物的抑菌率僅為21.7%；60 d時無生物活性；EA提取物在37 ℃貯藏10 d時抑菌率下降至11.4%，30 d時無生物活性。EA提取物在水溶液條件下，在低溫（4 ℃）下可以貯藏30 d，在室溫（20 ℃～28 ℃）時，貯藏不宜超過30 d，不宜處于37 ℃的高溫條件下（圖6）。

圖6 提取物在水中貯存溫度和時間對抑菌活性的影響Fig.6 Effect of temperature and storage period on antifungal activity of the crude extract in water solution of Streptomyces sp.3-10

提取物溶解在甲醇中時，其穩(wěn)定性較好。在4 ℃和20 ℃時，貯存100 d EA提取物抑菌率分別為83.1%和66.2%；在28 ℃和37 ℃時，貯存至第30 d EA提取物抑菌率分別為77.5%和63.7%；隨著時間延長至100 d，提取物的抑菌率下降至53.9%和43.7%。EA提取物在甲醇溶解的條件下，貯存在4 ℃時可以保持良好的抑菌活性，在室溫（20 ℃～28 ℃）條件下貯存不宜超過100 d，在37 ℃條件貯存不宜超過30 d（圖7）。

圖7 提取物在甲醇中貯存溫度和時間對抑菌活性的影響Fig.7 Effect of temperature and storage period on antifungal activity of the crude extract in methanol solution of Streptomyces sp.3-10

將EA提取物制備成固體粉末時最為穩(wěn)定，在低溫（4 ℃）至室溫（20 ℃～28 ℃）條件下可以保持良好的抑菌活性，貯存100 d EA提取物抑菌率分別為90.3%、92.5%和89.5%；在37 ℃條件下，貯存100 d提取物的抑菌率下降至80.2%（圖8）。該結(jié)果表明，EA提取物在水中的穩(wěn)定性較差，在甲醇中能在低溫條件下可以保持較好的抑菌活性；將提取物冷凍干燥后制備成干粉最有利于提取物的貯存，在低溫至室溫條件下提取物均能保持良好的抑菌活性。

圖8 提取物制備成干粉后貯存溫度和時間對抑菌活性的影響Fig.8 Effect of temperature and storage period on antifungal activity of the crude extract lyophilized powder of Streptomyces sp.3-10

3 討論

微生物產(chǎn)生的農(nóng)用抗生素在使用時進入外界環(huán)境后，會受到光照、溫度、濕度等自然環(huán)境的影響。目前，鏈霉菌產(chǎn)生發(fā)酵液對植物病原真菌的抑制作用和穩(wěn)定性研究報道較多，但發(fā)酵液的提取物穩(wěn)定性報道相對較少。楊勇等[28]研究了黃麻鏈霉菌AUH-1發(fā)酵液的抑菌活性和穩(wěn)定性，發(fā)酵粗提液在100 ℃處理30 min、經(jīng)紫外線照射50 min仍有較好的抑菌活性，耐受酸堿。范萬澤等[29]報道了婁徹氏鏈霉菌ZZ-9發(fā)酵液在100 ℃高溫、長時間（16 h）紫外線照射、強酸（pH=2）和強堿（pH=12）的條件下亦仍能保持較好的抑菌活性。張雨陽等[30]發(fā)現(xiàn)黃三素鏈霉菌15-6的發(fā)酵液在80 ℃以上的高溫、酸性（pH=1～6）或堿性（pH=8～13）條件下對膠孢炭疽菌的抑菌效果降低。蔣桂芳等[31]報道了拮抗放線菌 F2發(fā)酵液的穩(wěn)定性，在 70 ℃以上的高溫會降低發(fā)酵液對辣椒炭疽病菌的抑制作用，在環(huán)境pH為3～10的條件下、紫外線照射30 min對發(fā)酵液的抑菌活性影響不大，室溫或4 ℃條件下儲藏15 d的發(fā)酵液仍能保持較好的抑菌活性。

本研究采用不同極性的有機溶劑對鏈霉菌3-10發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)進行提取，獲得的提取物及提取后余液對灰霉病菌菌絲生長的抑菌活性測定后發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯提取物活性最強且提取后余液抑菌活性很弱，說明乙酸乙酯能有效地將無菌發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)提取出來，所以選取乙酸乙酯作為提取溶劑。穩(wěn)定性試驗表明，發(fā)酵液和提取物對 80 ℃以上的高溫比較敏感，在酸性（pH=2～6）條件下發(fā)酵液和提取物均能發(fā)揮較好的抑菌活性，堿性（pH=8～13）條件會降低二者的抑菌活性，紫外線照射會破壞發(fā)酵液和提取物的抑菌活性。提取物貯存條件試驗表明，提取物在水中、甲醇中和制備成干粉的3種狀態(tài)下，在水中可以短期貯存，在甲醇中的貯存時間比在水中長，但這兩種狀態(tài)只能處于低溫和室溫，高溫條件下提取物在水中容易喪失生物活性，提取物制備成干粉后在低溫、室溫和高溫的條件下貯存100 d后均能保持良好的生物活性，比較適合長期貯存。

已有的研究報道了鏈霉菌3-10的乙酸乙酯提取物可以抑制多種植物病原真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)，提取物中具有抑菌活性的主要成分是reveromycin A，但是對于發(fā)酵液及EA提取物的穩(wěn)定性沒有報道[26]。Reveromycin A是一種螺環(huán)化合物，可以抑制腫瘤細胞增殖、抑制酵母細胞生長[32]，reveromycin A在酸性條件下才能保持良好的生物活性[33,34]。在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)經(jīng)過酸性處理后的發(fā)酵液和EA提取物都能保持較好的抑菌活性，經(jīng)過堿性處理后抑菌活性有所下降，這可能是因為堿性破壞了reveromycin A的分子結(jié)構(gòu)而導致抑菌活性降低。在reveromycin A的分子中存在多個碳碳雙鍵結(jié)構(gòu)，容易受到紫外光激發(fā)從而改變其分子狀態(tài)，這可能是提取物受到紫外線照射后抑菌活性迅速下降的原因。

本研究以灰霉菌為生物活性測定的指示菌，測定了鏈霉菌3-10發(fā)酵液和EA提取物在不同的溫度、酸堿度、紫外線照射和不同存在狀態(tài)下的活性保持能力，為鏈霉菌3-10的田間應用提供了指導信息。此外，本研究中鏈霉菌3-10發(fā)酵液和EA提取物的穩(wěn)定性試驗均為對植物病原真菌生長的室內(nèi)測定，而在田間環(huán)境中的生物活性測定需要進一步研究和驗證。